口服α-硫辛酸對MPTP-PD模型老年小鼠的保護作用*

楊曉波，姚 愷，祖恒兵，趙永飛

（復旦大學附屬金山醫(yī)院神經內科，上海 201508）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是老年人常見的神經退行性疾病。流行病學研究證實衰老是散發(fā)性PD最重要的獨立危險因素［1］。隨著人類平均壽命的不斷延長和人口老齡化不斷加劇，衰老相關疾病日益成為一個緊迫的問題。

PD 主要由黑質致密部多巴胺能（dopaminergic，DA）神經元嚴重丟失引起。氧化應激和自由基損傷被認為是衰老發(fā)生和PD 發(fā)病的重要關聯(lián)原因［2］。PD 中存在易于導致DA 神經元死亡的物質，如功能障礙的溶酶體和泛素蛋白酶體標志物、氧化應激標志物等，這些物質在正常衰老過程中以區(qū)域特異性模式蓄積（如中樞神經系統(tǒng)），最終可促進PD 的發(fā)生。同時，自然衰老過程中，中樞神經系統(tǒng)抗氧化應激損害能力逐漸減弱，也增加了患PD 的風險。因此，抗氧化應激反應有可能對延緩衰老進展有一定的效果。根據(jù)散發(fā)性PD 二次打擊發(fā)病理論［3］，延緩衰老進展可能在PD 防治過程中減輕第一次打擊的損傷，從而影響二次打擊后PD的發(fā)生。

α-硫辛酸（α-lipoic acid，α-LA）是機體在線粒體內能自身合成的化合物，可作為輔酶參與物質代謝中的?；D移，能消除導致加速老化與致病的自由基，通過多種機制參與抗氧化。研究表明，大鼠PD模型中，α-LA 處理可有效保護黑質紋狀體DA 神經元［4-5］，但既往的研究主要集中于注射給藥，對于口服給藥模式缺乏研究，同時對相關作用機制也尚未完全闡明。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）能誘導經典的氧化應激損傷PD 模型，因此本研究選用MPTP 誘導的老年小鼠PD 模型，探討口服α-LA 是否在衰老和PD的發(fā)生發(fā)展起一定的預防作用。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 老年健康雌性C57/BL6 小鼠在8～10周齡時購自中國科學院上海分院實驗動物中心上海斯萊克實驗動物有限公司，置于（25±2）℃環(huán)境下，清潔級飼養(yǎng)，自由進食及飲水。飼養(yǎng)至16 月齡時隨機分組，18 月齡時實驗干預結束后處死，體重33～38 g。動物飼養(yǎng)和實驗設計均符合復旦大學倫理委員會要求。

1.2 主要試劑 α-LA 和MPTP 購自Sigma；RIPA 裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物公司；兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體購自Millipore；兔抗小鼠血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體購自Abgent；兔抗小鼠核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗 體、兔抗小 鼠NADPH 氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2/gp91phox）抗體及兔抗小鼠GAPDH（內參照）抗體購自Abcam；山羊抗兔Ⅱ抗IgG-HRP 及熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；ECL 化學發(fā)光試劑購自Millipore。

2 方法

2.1 建立小鼠氧化應激損傷PD 模型 C57/BL6 老年小鼠32 只，隨機分為老年MPTP 組、老年LA+MPTP 組、老年對照組和老年LA 組，每組8 只。老年LA+MPTP 組和老年LA 組在16月齡時將日常飲用水換成0.5 g/L 的α-LA 溶液，每天自由飲用，平均每只飲用5 mL/d。老年MPTP 組和老年LA+MPTP 組在出生18 個月時，MPTP 劑量第1、2 天為20 mg/（kg·d），第3～5 天為25 mg/（kg·d），用生理鹽水稀釋，每次200μL 腹腔注射，每天1 次，共5 d；老年對照組和老年LA 組腹腔注射等體積的生理鹽水。首次注射后10 d，行為學檢測之后處死動物，30 s內快速取腦，每組4只固定后用于免疫熒光染色，其余4只去除小腦部位，用于蛋白定量檢測，-80 ℃保存。

2.2 轉棒（rotarod）實驗 小鼠行為學檢測采用rotarod 實驗，在MPTP 腹腔注射后第2天開始。待測試小鼠安放于轉棒踏車（Ugo Basile）上，從4 r/min 的初速開始，在3 min 內逐漸加速到40 r/min 的速度。計數(shù)每次從開始計數(shù)到從轉棒踏車上墜落的時間。檢測前2 d開始行為訓練和學習，每天訓練一次。檢測每日進行一次，連續(xù)檢測4 d。

2.3 腦組織蛋白提取 取各組小鼠4 只，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后開胸，經左心室先灌注溫的生理鹽水至肝臟顏色變白后，快速分離腦組織并稱量，置1.5 mL 離心管中，加入RIPA 裂解液，在冰上用勻漿器將組織勻漿。冰上充分裂解1 h，勻漿置4 ℃、12 000×g離心30 min，吸取上清液，棄沉淀，轉移至新預冷的微量離心管中。按BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。

2.4 Western blot 將腦組織蛋白樣本與上樣緩沖液以4∶1 比例混合，100 ℃加熱5 min，每組標本上樣蛋白量為10 μg，進行SDS-PAGE 分離，200 mA 恒定電流下室溫電轉膜2 h；1×TBST 液洗膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h；分別將兔抗小鼠TH 抗體（1∶2 000）、兔抗小鼠Nrf2 抗體（1∶1000）、兔抗小鼠HO-1 抗體（1∶1 000）、兔抗小鼠NOX2/gp91phox抗體（1∶1 000）及兔抗小鼠GAPDH 抗體（1∶8000）4 ℃孵育過夜。1×TBST 洗膜10 min×3 次，加二抗山羊抗兔IgG-HRP，室溫孵育1 h，1×TBST 洗膜10 min×3 次；采用ECL 化學發(fā)光法置Bio-Rad 自動曝光儀中進行顯色曝光。圖像處理及分析：由Bio-Rad 自動曝光儀自帶的分析軟件Image Lab 完成。TH、Nrf2、HO-1 和NOX2/gp91phox相對表達量以目標蛋白與內參照吸光度的比值表示。

2.5 免疫組織熒光 取各組小鼠4 只麻醉后開胸，經左心室灌注溫的生理鹽水至肝臟顏色變白后，用4%多聚甲醛經心臟灌注內固定，分離腦組織，置10%～30%蔗糖溶液梯次脫水，OCT 包埋，液氮冰凍，LEICA 冰凍切片機切片（層厚10μm）。選取腦黑質及紋狀體區(qū)組織標本切片室溫充分干燥，PBS 洗5 min×3 次，5%小牛血清室溫下封閉30 min，切片分別滴加兔抗小鼠TH 抗體（1∶500）、兔抗小鼠Nrf2 抗體（1∶50）、兔抗小鼠HO-1 抗體（1∶50）、兔抗小鼠gp91phox抗體（1∶50）及大鼠抗小鼠CD11b 抗體（1∶50）；4 ℃孵育24 h 后PBS 洗5 min×3 次，滴加Fluor-555 山羊抗兔IgG（1∶1 000）或Fluor-488 山羊抗大鼠IgG（1∶1 000），室溫作用1 h。PBS 洗5 min×3 次，切片滴加Hochest 33342（1∶1 000），室溫孵育5min，PBS洗5 min×3 次，50%甘油封片。置Olympus 熒光顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析免疫熒光圖像，計數(shù)黑質和紋狀體區(qū)免疫陽性細胞或表達相應蛋白的小膠質細胞。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 6 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 α-LA對老年小鼠行為學的影響

為了評估較長時期口服抗氧化劑α-LA 抗衰老（即減輕首次打擊）的作用，以及是否能減輕二次打擊后DA 神經元的丟失，我們用rotarod實驗來評估各組小鼠的運動平衡和協(xié)調功能，從在轉棒上記時開始到從轉棒上跌落，時間越長代表運動平衡和協(xié)調功能越好。結果顯示，老年LA+MPTP 組在轉棒儀上的運動時間與老年對照組和老年LA 組之間無顯著差異（P＞0.05），而老年MPTP 組在轉棒儀上的運動時間顯著低于其余3 組（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1。實驗結果提示，α-LA 較長時期口服干預可以改善運動平衡和協(xié)調功能，在一定程度上減輕老年MPTPPD小鼠的運動障礙。

Figutre 1.Results of rotarod test.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；LA：lipoic acid；CTRL：control.Mean±SD. n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖1 轉棒實驗

2 α-LA對老年小鼠腦內TH表達的影響

TH 是多巴胺合成的關鍵酶，而多巴胺減少是PD 主要發(fā)病機制之一，于是我們檢測了α-LA 作用下各組小鼠腦內TH的表達。Western blot結果顯示，老年MPTP 組的TH 表達量顯著低于老年LA+MPTP組（P＜0.05），也顯著低于老年對照組和老年LA 組（P＜0.01），見圖2A。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，老年小鼠黑質紋狀體區(qū)TH 免疫反應陽性細胞稀疏，以黑質腹側部（ventral part of substantia nigra，vtSN）最為顯著。老年MPTP 組的TH 免疫反應陽性細胞丟失最明顯，黑質各區(qū)都很少能見完整的TH 免疫反應陽性神經元，而老年LA+MPTP 組、老年對照組和老年LA 組在vtSN 和黑質背側部（dorsal part of substantia nigra，dtSN）TH 免疫反應陽性細胞也大量丟失，但在腹側被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）能見到一定數(shù)量完整的TH 免疫反應陽性神經元，見圖2B。以上研究結果提示，長期口服α-LA 并沒有顯著減少正常衰老狀態(tài)下的TH 神經元丟失；在MPTP-PD 模型組中，沒有口服α-LA 的情況下，黑質區(qū)TH 神經元顯著丟失；而長期口服α-LA 能很好地發(fā)揮抗氧化應激和自由基清除作用，從而保護TH 神經元免受MPTP 毒物損害造成的丟失。

3 α-LA 對老年小鼠腦內抗氧化應激蛋白Nrf2 和HO-1表達的影響

氧化應激是衰老和PD 的重要原因，我們檢測α-LA 對氧化應激相關分子的影響。Western blot 實驗結果顯示，老年MPTP 組的Nrf2 表達顯著低于老年LA+MPTP 組（P＜0.05），亦顯著低于老年對照組和老年LA 組（P＜0.01），而老年對照組與老年LA 組之間差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）。免疫熒光結果與Western blot檢測結果一致，黑質紋狀體區(qū)老年MPTP組的Nrf2免疫反應陽性細胞數(shù)（29±5）顯著低于老年LA+MPTP 組（57±6）、老年對照組（74±6）和老年LA組（96±11），差異均有統(tǒng)計學顯著性（P＜0.05），老年對照組與老年LA 組之間差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）；我們通過CD11b 標記小膠質細胞，發(fā)現(xiàn)Nrf2免疫陽性熒光主要與CD11b 免疫陽性熒光共定位。HO-1 的實驗 結果 與Nrf2 類 似，老 年MPTP-PD 組 的HO-1 表達顯著下調，與老年LA+MPTP 組、老年對照組和老年LA 組相比均有顯著差異（P＜0.05 或P＜0.01），老年對照組與老年LA組之間無顯著差異（P＞0.05）。免疫熒光檢測結果與Western blot 檢測結果趨勢相似，老年MPTP-PD組黑質紋狀體區(qū)的HO-1免疫反應陽性細胞（17±3）顯著低于老年LA+MPTP 組（43±8）、老年對照組（66±8）和老年LA 組（86±4），差異均有統(tǒng)計學顯著性（P＜0.05），老年對照組與老年LA 組之間差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）。HO-1 免疫陽性熒光也主要與CD11b 免疫陽性熒光共定位。見圖3。

Figure 2.Effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of tyrosine hydroxylase（TH）in the brain of aged mice.A：Western blot was used to detect TH expression；B：immunofluorescence showed TH immunoreactive neurons（scale bar=50μm）.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；CTRL：control；VTA：ventral tegmental area；dtSN：dorsal part of substantia nigra；vtSN：ventral part of substantia nigra.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖2 α-硫辛酸對老年小鼠腦內酪氨酸羥化酶表達的影響

4 α-LA 對老年小鼠腦內氧化應激蛋白NOX2/gp91phox表達的影響

我們進一步檢測了氧化應激相關的分子改變。Western blot 結果顯示，老年MPTP 組的NOX2表達顯著高于老年LA+MPTP 組（P＜0.05），也顯著高于老年對照組和老年LA 組（P＜0.05），老年對照組與老年LA 組之間無顯著差異（P＞0.05）。免疫熒光檢測與Western blot 檢測結果趨勢相似，老年MPTP 組黑質紋狀體區(qū)的NOX2 免疫反應陽性細胞（86±4）顯著高于老年LA+MPTP 組（71±5），也顯著高于老年對照組（62±4）和老年LA 組（45±6），差異均有統(tǒng)計學顯著性（P＜0.05），老年對照組與老年LA組之間也有顯著差異（P＜0.05）。NOX2 免疫陽性熒光主要與CD11b 免疫陽性熒光共定位。見圖4。

以上實驗結果提示，與正常老年對照組相比，長期口服抗氧化劑α-LA 未發(fā)現(xiàn)能顯著改變正常衰老狀態(tài)下氧化應激反應Nrf2/抗氧化反應原件信號通路中氧化和抗氧化信號因子的表達量，但在遭遇二次打擊時（MPTP 毒物損害），氧化應激反應顯著加劇時，α-LA 能很好地發(fā)揮清除自由基、抗氧化應激反應，保護神經元，顯著減少TH 神經元的進一步丟失。我們還發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞是氧化應激反應的主要參與者。

討 論

衰老與PD 的發(fā)生密切相關，我們既往的研究也證明衰老是散發(fā)性PD 的促進因素之一［6］，而氧化應激損傷在其中扮演了重要角色［7］。自從發(fā)現(xiàn)MPP+通過抑制電子傳遞鏈復合物Ⅰ導致黑質神經元丟失引起帕金森癥狀群以來，線粒體功能異常、氧化應激對黑質內健康、存活的神經元的作用以及PD 發(fā)病機制的重要性的認識不斷加深。隨著年齡增長，功能缺陷的線粒體蓄積不斷增加，線粒體產能過程受損，活性氧族生成增多，氧化應激損傷加重［8］，足以引起PD 相關的神經病理和癥狀，被認為是PD 發(fā)病的重要原因。同時，作為PD 發(fā)生機制的多巴胺的自身代謝可導致α-synuclein聚集［9］，加重氧化應激損害及神經元損害。過多的DA 氧化代謝的產物可直接導致線粒體功能障礙、引起氧化應激加重［10］?？梢姡€粒體功能障礙、氧化應激損傷可促進細胞衰老丟失，進一步促進PD的發(fā)生。

Figure 3.The effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of heme oxygenase-1（HO-1）and nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2）and HO-1 in the brain of aged mice.A and B：Western blot analysis of HO-1 and Nrf2 expression；C and D：immunofluorescence showed HO-1 and Nrf2 immunoreactive positive cells（scale bar=50 μm）.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；CTRL：control.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖3 α-硫辛酸對老年小鼠腦內抗氧化應激蛋白Nrf2和HO-1表達的影響

Figure 4.Effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of oxidative stress protein NOX2/gp91phox in the brain of aged mice.A：the expression of NOX2/gp91phox was detected by Western blot；B：immunofluorescence showed NOX2/gp91phox immunoreactive positive cells（scale bar=50μm）.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖4 α-硫辛酸對老年小鼠腦內氧化應激蛋白NOX2/gp91phox表達的影響

α-LA 是一種在線粒體內可自然合成的小分子強力抗氧化劑，由辛酸衍生來的二硫化合物，是線粒體的能量代謝中一些脫氫酶所必需的輔因子［11］，它含有2 個氧化的或還原的巰基基團，其還原型稱為二氫硫辛酸，是與ROS相互作用的主要形式，其氧化型通常稱為硫辛酸，同樣能清除自由基。α-LA 的作用機制較多，它可以直接螯合鐵離子，參與其代謝，在PD 發(fā)生中起到保護作用［12］，也可以通過激活Nrf2信號通路減輕神經細胞死亡［13］。在中樞神經系統(tǒng)中，α-LA 可通過改變細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽的比例發(fā)揮抗氧化作用，此外，還原型α-LA 還能促進其它抗氧化劑如谷胱甘肽過氧化物酶的表達水平，增強這些抗氧化劑的作用效果［14］。鑒于線粒體功能障礙和氧化應激損傷是衰老和帕金森病共同的重要危險因素，而α-LA 具有自由基清除和抗氧化作用，補充α-LA 來抗衰老及抗PD 的研究已在人體和動物模型的多種器官中進行，研究最多的是耗氧量最大的腦和心臟組織［15-16］，如研究發(fā)現(xiàn)補充α-LA 可在一定程度上改善記憶［17］。

盡管既往的研究結果提示α-LA 能有效抗衰老，但具體機制仍不完全明確，其用藥方式也多為腹腔注射，而無創(chuàng)性給藥途徑的效果尚缺乏評估。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，給予正常老齡小鼠每天口服α-LA，無論是行為學功能評價還是檢測TH 表達量，或是檢測黑質紋狀體區(qū)TH 免疫反應陽性神經元數(shù)量，與對照組之間的差異并沒有統(tǒng)計學顯著性，與PD 發(fā)病密切相關的氧化應激平衡和抗氧化應激損害的Nrf2 氧化應激通路［18］中信號因子的表達也沒有顯著差異，提示在正常衰老狀態(tài)下口服α-LA 對一般衰老狀態(tài)的改善效果并不明顯。我們推測，促進衰老是由多種因素和機制參與，氧化應激僅是其中之一，由于衰老機制的多樣性，單一口服α-LA 的抗氧化應激作用還不能顯著消除內源性氧化應激產生的影響，導致不能顯著改善衰老及PD 相關的DA 神經元丟失及氧化應激反應增加。

但是，我們的研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠在受到MPTP毒物打擊時，口服α-LA 能有效減輕MPTP 作用造成的傷害。轉棒實驗行為學測試發(fā)現(xiàn)老年α-LA+MPTP 組的運動協(xié)調平衡功能顯著好于老年MPTP組，同時減緩了腦內TH 表達的下降和多巴胺能神經元的丟失。此外，已有文獻報道α-LA 對Nrf2/HO-1通路具有激活作用［19-20］，是其抗氧化作用的機制之一，但在MPTP-PD 模型中尚未證實。我們研究發(fā)現(xiàn)，老年α-LA+MPTP 組中抗氧化應激防御分子Nrf2及其下游的保護性抗氧化因子HO-1 表達顯著高于老年MPTP 組，而代表氧化應激反應嚴重度的NOX2表達顯著低于老年MPTP 組，說明口服α-LA 還能夠誘導Nrf2 氧化應激通路激活，維持腦內氧化應激平衡，從而起到保護作用，與以往研究結果相似［21］。

綜上所述，α-LA 是一個有效的抗氧化劑和自由基清除劑，在正常生理性衰老狀態(tài)下并沒有顯著的保護黑質紋狀體區(qū)DA 神經元效果，但當遭受環(huán)境因素的2 次打擊時，線粒體功能嚴重異常、自由基產生過度失衡，氧化應激損傷明顯加重，超過了機體自身抗氧化能力，長期口服α-LA 能顯著緩解氧化應激，減少黑質紋狀體區(qū)DA 神經元的進一步丟失，具有一定的預防PD效果。