高爾基體蛋白ACBD3通過AKT-FOXOs信號通路促進三陰性乳腺癌細胞增殖*

鄭迎春，汪 蘭

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東廣州 510006）

據(jù)2020 年全球世界癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，乳腺癌在女性腫瘤中的發(fā)病率居于首位，乳腺癌發(fā)病率一度超過肺癌，成為全球最常見的腫瘤［1］。隨著臨床診斷和治療方法的不斷發(fā)展，早期乳腺癌的治療效果良好，但三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）因易轉(zhuǎn)移和易復發(fā)而難以徹底治愈。探索TNBC的細胞特性有助于為其臨床治療提供理論依據(jù)［2］。

TNBC 占浸潤性乳腺癌的10%～20%，是雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2 均不表達的乳腺癌［3］。TNBC 生長迅速且侵襲性較強，易于復發(fā)使得預后較差［4］。目前，有大量針對特定受體或TNBC 靶向治療的臨床試驗正在進行中，例如，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制靶向治療的研究發(fā)現(xiàn)，PARP 抑制劑對BRCA1/2 缺陷型腫瘤具有顯著的抗腫瘤作用，對BRCA1 突變型腫瘤的抑制作用比無此類突變腫瘤的抗腫瘤效果顯著［5］。雌激素受體α36 在雌激素受體陰性乳腺癌細胞的細胞質(zhì)和細胞膜中表達，參與調(diào)控乳腺癌細胞的惡性進程，存在正反饋環(huán)路，作為一個TNBC 治療的潛在靶點正被深入研究［6］。同時，免疫治療中的PD-L1和CAR-T療法在TNBC 的臨床治療中也已由實驗室研究邁向臨床［7］。綜上可知，找到TNBC的關鍵調(diào)控因子對于乳腺癌的靶向治療和個性化治療至關重要。

高爾基體是細胞內(nèi)一個重要的膜性結構，執(zhí)行多種重要的生物學功能［8］。?；o酶A 結合結構域蛋白3（acyl-CoA binding domain containing protein 3，ACBD3），又稱GCP60、GOCAP1、GOLPH1 和PAP7，作為一個高爾基體銜接蛋白參與高爾基體結構和功能的維持［9］。研究發(fā)現(xiàn)，ACBD3 可參與類固醇代謝、細胞凋亡、鐵平衡、胚胎發(fā)育及細胞周期調(diào)控［10-11］。高爾基體蛋白可用于臨床篩查及預后判斷，如膽管上皮細胞高爾基體蛋白73 可用于協(xié)助診斷肝纖維化和肝硬化［12］；ACBD3 在非小細胞肺癌中表達上調(diào)預示較差的治療效果。但ACBD3 在TNBC 增殖中的功能及機制尚不清楚。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信號通路調(diào)控細胞增殖及存活，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中至關重要［13-14］。叉頭框蛋白O（forkhead box O，F(xiàn)OXO）轉(zhuǎn)錄因子受PI3K-AKT 信號通路負調(diào)控，經(jīng)AKT 磷酸化后使其活性下降，在細胞增殖中起到負性調(diào)控作用［15］。然而，ACBD3 與增殖關鍵信號通路AKT 的關系尚無研究報道。本研究首次探討了ACBD3通過活化AKT進而調(diào)控TNBC細胞的增殖。

材料和方法

1 細胞株

人乳腺癌細胞系MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT549 和MDA-MB-231 及永生化正常乳腺上皮細胞系MCF-10A均為中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室提供［16］。

2 主要試劑

DMEM 粉末、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)基（keratinocyte serum-free medium，KSFM）均購自Gibco；PCR 及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme）；鼠抗人ACBD3 抗體（sc-101277）購自Santa Cruz；鼠抗人GAPDH 抗體（ab8245）和兔抗人p-FOXO4Ser193抗體（ab174849）購自Abcam；MTT 粉末、ECL 發(fā)光液粉末和Hoechst 33342 細胞核染料（Sigma）；兔抗人p-AKTSer473抗體（9271S）、p-AKTThr308抗體（4056S）、AKT 抗體（9272S）、FOXO4 抗體（9472S）、p-FOXO3aSer253抗體（9466S）、FOXO3a 抗體（9466S）、p-FOXO1Ser256抗體（9461S）、p-GSK3β（9322S）抗體和GSK3β 抗體（12456S），鼠抗人FOXO1 抗體（14952S）均購自Cell Signaling Technology；細胞周期檢測試劑盒（RiboBio）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher）；ACBD3引物序列由金唯智生物科技有限公司合成。

3 實驗方法

3.1 細胞培養(yǎng) MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT-549 和MDA-MB-231 細胞均使用含10% FBS 的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，MCF-10A 細胞使用KSFM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將所有細胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3.2 qPCR 和Western blot 驗證乳腺癌細胞中ACBD3 的表達 胰酶消化接種于6 孔板中的MDAMB-231、BT-549 及MCF-10A 細胞，分別提取各組細胞的RNA 及蛋白，使用qPCR 及Western blot 法分別檢測ACBD3 在各組細胞中的mRNA 和蛋白表達。ACBD3 上游引物序列為5'-ACAGTATCCAGGGAACTACGAA-3'，下游引物序列為5'-GTTTCTGTAATGCTGCCGTTG-3'；內(nèi)參照GAPDH 的上游引物序列為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引 物序列為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

3.3 構建沉默ACBD3的TNBC 細胞系模型 選取TNBC 細胞系MDA-MB-231 和BT-549，分為2 組：（1）對照（RNAi-Vector）組：轉(zhuǎn)染RNAi-Vector 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染濃度為1 g/L，構建為MDA-MB-231-RNAi-Vector 細胞和BT-549-RNAi-Vector細胞；（2）ACBD3沉默（ACBD3-RNAi）組：轉(zhuǎn)染ACBD3-RNAi 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染濃度為1 g/L，構建為MDA-MB-231-ACBD3-RNAi 細胞和BT-549-ACBD3-RNAi 細胞。ACBD3-RNAi 的序列為5'-AUUGAUGGCUGCCAGCAUACACCUC-3'，所使用質(zhì)粒載體為pSUPER.retro.puro（Oligoengine）［17］。本文中所使用的載體制備及實驗技術均按Oligoengine 公司pSUPER載體實驗指南操作。

3.4 MTT 法檢測ACBD3 對乳腺癌細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231和BT-549細胞及其構建成功的ACBD3-RNAi 細胞，分別以每孔2×103個接種于96孔板中，每組設置3個復孔，分別培養(yǎng)0、24、48、72 和96 h 后，每孔加入18μL MTT 溶液（濃度為5 g/L），放置于37 ℃孵育4～6 h，棄去上清，每孔加入160 μL 的DMSO 溶液，避光震蕩使孔板底部藍紫色結晶充分溶解，490 nm 波長處檢測吸光度，使用GraphPad Prism繪制細胞生長曲線。

3.5 平板集落形成實驗 取MDA-MB-231 和BT-549 細胞及其構建成功的ACBD3-RNAi 細胞，分別以每孔500 個接種于12 孔板中，置于37 ℃孵箱培養(yǎng)14 d，棄去上清，每孔加入500μL甲醇固定30 min，使用PBS 清洗2 次，加入1%的結晶紫溶液染色10 min，回收結晶紫溶液，并使用流動水沖洗孔板，直至清水無色后，室溫晾干孔板，進行集落數(shù)目統(tǒng)計。

3.6 EdU 染色檢測ACBD3 對乳腺癌細胞增殖的影響 取MDA-MB-231 和BT-549 細胞及其ACBD3-RNAi細胞，分別以每孔2×104個接種于12孔板中，細胞放置于37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h，每孔加入200μL EdU標記物孵育2 h；使用PBS 清洗3 次，加入250 μL 的4%多聚甲醛固定30 min；使用PBS 清洗2 次，每孔加入300 μL 的5% Triton X-100，孵育10 min；使用PBS清洗2 次，加入250μL 的Apollo 熒光染料，避光孵育30 min；每孔加入250μL 的5%Triton X-100，孵育10 min，重復2 次；使用PBS 清洗1 次，每孔加入250 μL的Hoechst 33342染色液孵育30 min，使用PBS清洗2次；晾干細胞爬片，使用防淬滅封片劑進行封片，熒光顯微鏡20倍鏡進行拍照。

3.7 流式細胞術檢測細胞周期分布 將MDA-MB-231 和BT-549 細胞及其ACBD3-RNAi 細胞以每孔5×105個接種于6 孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，次日加入基礎培養(yǎng)基同步化處理24 h 后換為含有10% FBS 的完全培養(yǎng)基處理24 h。使用不含EDTA 的胰酶消化細胞，每組細胞內(nèi)加入1 mL 提前預冷的70%乙醇吹打混勻于4 ℃固定過夜。次日，使用PBS 清洗3 次，加入500 μL 染色液（RNase A 與PI 體積比為1∶9），重懸細胞并使用濾網(wǎng)過濾至流式管中染色30 min，激發(fā)波長488 nm 處上機檢測各個細胞周期的變化。

3.8 構建小鼠荷瘤模型 皮下接種乳腺癌細胞至小鼠乳房墊，構建小鼠異種種植模型，每只接種2×106個MDA-MB-231 細胞及其ACDB3-RNAi 細胞或1×107個BT-549 細胞及其ACDB3-RNAi 細胞，注射體積均為100μL。實驗終點結束后對小鼠進行脫頸處死，并剝離小鼠腫瘤進行拍照、稱重及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間的比較在正態(tài)性檢驗之后用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義?；蚣患治觯╣ene set enrichment analysis，GSEA；Version 4.0.3；https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）。

結果

1 qPCR 和Western blot 法檢測ACBD3 在TNBC細胞中的表達

本課題組先前研究通過TCGA（The Cancer Genome Atlas）公共數(shù)據(jù)庫分析ACBD3在乳腺癌組織及正常乳腺上皮組織中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ACBD3 在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺上皮組織［18］。本實驗中，我們對乳腺癌病例中的TNBC和其他類型乳腺癌中的ACBD3 進行了分組對比分析。我們選取正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）和5 株乳腺癌細胞系（MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT-549 和MDA-MB-231）并收集其RNA 及蛋白，利用qPCR 和Western blot 法分別檢測ACBD3 的mRNA 及蛋白表達水平。實驗結果表明，在所有乳腺癌細胞系中ACBD3 的mRNA 及蛋白表達水平均顯著高于正常乳腺上皮細胞（P＜0.05 或P＜0.01），其中TNBC 細胞系MDA-MB-231及BT-549中ACBD3的表達水平比其他類型的乳腺癌細胞更高（P＜0.01），見圖1。

2 ACBD3能夠促進TNBC細胞增殖

通過qPCR 和Western blot 實驗驗證TNBC 細胞系MDA-MB-231 和BT-549 及其ACBD3-RNAi 細胞中ACBD3 的表達水平（P＜0.01），見圖2A、B。MTT 實驗結果證明，ACBD3 能夠顯著促進TNBC 細胞系MDA-MB-231 和BT-549 的生長速度，與RNAi-Vector組相比，敲減內(nèi)源性ACBD3的表達能夠顯著抑制TNBC 細胞的生長（P＜0.01），見圖2C。平板集落形成實驗結果證明，ACBD3 能夠顯著增加TNBC 細胞系MDA-MB-231 和BT-549 的集落形成能力，與RNAi-Vector 組相比，敲減內(nèi)源性ACBD3的表達則能夠顯著抑制TNBC 細胞的集落形成能力（P＜0.01），見圖2D。EdU 細胞增殖檢測結果證明，ACBD3 能夠顯著促進TNBC 細胞系MDA-MB-231 和BT-549 的增殖能力，與RNAi-Vector 組相比，敲減內(nèi)源性ACBD3的表達能夠顯著抑制TNBC 細胞的增殖能力（P＜0.01），見圖2E。

Figure 1.The mRNA and protein levels of ACBD3 in normal breast epithelial cells and breast cancer cells were tested by qPCR（A）and Western blot（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs MCF-10A group.圖1 正常乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞中ACBD3的mRNA及蛋白表達情況

3 ACBD3能夠促進乳腺癌細胞G1/S期轉(zhuǎn)變

流式細胞術結果證明，ACBD3 能夠促進TNBC細胞系MDA-MB-231和BT-549的細胞周期進展。與RNAi-Vector 組相比，當敲減內(nèi)源性ACBD3表達后，各組細胞中G0/G1期的比例增加，S 期的比例減少。與RNAi-Vector 組相比，MDA-MB-231 細胞的G0/G1期比例由35.05%增加至64.45%，S 期比例由36.80%減少至18.83%；BT-549 細胞的G0/G1期比例由35.82%增加至58.23%，S 期比例由40.63%減少至23.48%（P＜0.01），見圖3。

4 ACBD3體內(nèi)促進TNBC細胞增殖

為進一步驗證ACBD3 在小鼠體內(nèi)的生物學功能，通過接種TNBC 細胞待其成瘤，觀察各個細胞系中RNAi-Vector 組與ACBD3-RNAi 組小鼠腫瘤體積大小的變化情況。小鼠腫瘤實驗結果證明，ACBD3能夠促進小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。與RNAi-Vector 組相比，敲減內(nèi)源性ACBD3表達能夠顯著抑制腫瘤細胞生長，見圖4A。此外，通過測量記錄小鼠腫瘤體積曲線及腫瘤重量發(fā)現(xiàn)，ACBD3 能夠促進小鼠體內(nèi)腫瘤的增殖及成瘤，與RNAi-Vector 組相比，敲減內(nèi)源性ACBD3能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖及成瘤（P＜0.05或P＜0.01），見圖4B、C。

5 ACBD3表達與AKT-FOXO信號通路相關

通過GSEA 發(fā)現(xiàn)ACBD3的高表達與AKT活化的基因群相關，與FOXO3 負調(diào)控的富集基因群相關（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5A。此外，Western blot 結果顯示，ACBD3 能夠促進AKT、GSK3β 及FOXOs 等蛋白的磷酸化。與RNAi-Vector 組相比，敲減內(nèi)源性ACBD3的表達能夠顯著降低AKT、GSK3β 及FOXOs等蛋白的磷酸化水平（P＜0.01），見圖5B。

討 論

高爾基復合體是細胞執(zhí)行生物學功能的重要場所，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的修飾，運輸及分選［19］。ACBD3基因位于人類染色體1q42.12，其蛋白是一個高爾基體銜接蛋白，主要負責維護高爾基體的結構和功能，且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出蛋白的分選和修飾中起關鍵作用［20-21］。先前研究表明，ACBD3 可以與多種分子相互作用，如PI4KB、Golgin45、TBC1D22、PPM1L、DMT1、PKA、FAPP2、TUG、PARP-1和Numb以及一些細菌和病毒蛋白等［22］。微陣列數(shù)據(jù)顯示，ACBD3 參與調(diào)控細胞周期，已有研究表明ACBD3 可通過調(diào)控不對稱細胞分裂中的Numb信號通路，從而調(diào)控細胞周期［18，23］。除此之外，研究報道ACBD3 在病毒及細菌復制中發(fā)揮重要作用。但ACBD3 在乳腺癌細胞發(fā)生發(fā)展中的具體生物學功能及分子機制研究甚少。

Figure 2.ACBD3 promoted the proliferation of triple-negative breast cancer（TNBC）cells in vitro.A：the mRNA expression of ACBD3 in the indicated TNBC cells transfected with RNAi-Vector and ACBD3-RNAi was detected by qPCR；B：the protein expression of ACBD3 in the indicated TNBC cells transfected with RNAi-Vector and ACBD3-RNAi was detected by Western blot；C：the cell viability was measured by MTT assay；D：the growth of the cells was detected by colony formation assay；E：the proliferation of TNBC cells was detected by EdU staining.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.圖2 ACBD3可促進三陰性乳腺癌細胞增殖

已有的研究發(fā)現(xiàn)，TNBC 中通常伴有PTEN、TP53、PIK3CA、KRAS、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、IGFR1、KIT或MET等突變［24］。例如PTEN是10q23染色體上的腫瘤抑制基因，是PI3K-AKT 信號通路激活的關鍵調(diào)控因子之一，而PI3K-AKT 信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其也是乳腺癌預后判斷的重要分子［25］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ACBD3 可通過調(diào)節(jié)PI4Kβ 從而參與調(diào)控細胞自噬［10］。在多種腫瘤中沉默ACBD3或PRKAR1A（protein kinase A regulatory subunit type 1A）表達可誘導腫瘤細胞的生長抑制和凋亡，并伴有絲裂原活化蛋白激酶、PI3K-AKT 和JAK-STAT 等通路信號傳導的減少［26-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，ACBD3 在TNBC 細胞中的表達水平高于其他類型乳腺癌細胞，通過細胞生物學實驗證明ACBD3 能夠促進TNBC細胞生長及增殖。

FOXO 轉(zhuǎn)錄因子受PI3K-AKT 信號通路負調(diào)控，被認為對細胞增殖有抑制作用［27］。FOXOs 的4 種亞型（FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6）具有較高的蛋白同源性，均受到AKT 蛋白調(diào)控［29］。FOXO1、FOXO3 和FOXO4 轉(zhuǎn)錄因子可被AKT 直接磷酸化并被抑制轉(zhuǎn)錄，在AKT 調(diào)控細胞增殖的過程中發(fā)揮著重要作用［30］。本研究發(fā)現(xiàn)ACBD3 能夠調(diào)控AKTFOXOs 信號通路促進TNBC 細胞的增殖能力，沉默內(nèi)源性ACBD3則能夠抑制其增殖能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ACBD3 在TNBC 細胞中高表達，能夠通過AKT-FOXOs 信號通路調(diào)控TNBC細胞的增殖能力，在TNBC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

Figure3.ACBD3 promoted the G1/S phase progression of triple negative breast cancer（TNBC）cells in vitro.The G1/S phase progression of TNBC cells was detected by flow cytometry analysis.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.圖3 ACDB3促進三陰性乳腺癌細胞G1/S期轉(zhuǎn)變

Figure 4.ACBD3 promoted the proliferation of triple negative breast cancer cells in vivo.A：tumor photos analysed by Canvas；B and C：analysis of tumor volume and weight by GraphPad Prism.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.圖4 ACBD3體內(nèi)促進三陰性乳腺癌細胞增殖

Figure 5.The effect of ACBD3 on AKT-FOXOs pathway in triple negative breast cancer cells.A：the results of gene set enrichment analysis（GSEA）showed that ACBD3 expression was positively correlated with proliferation and cell cycle-activated gene signatures（ACBD3-H：high expression of ACBD3；ACBD3-L：low expression of ACBD3）；B：the protein levels of AKT，GSK3β and FOXOs were examined by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.圖5 ACBD3對三陰性乳腺癌細胞中AKT-FOXOs信號通路的影響