hsa-miR-103a-3p影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞化療耐藥性的機(jī)制研究*

王 芳，宋 彬，肖帥帥，成曉龍△

（1山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，2山西白求恩醫(yī)院腫瘤中心，3山西省腫瘤醫(yī)院普外科二病區(qū)，山西太原 030000）

食管癌是我國(guó)第三大腫瘤，也是腫瘤致死的第四位原因［1］，其組織學(xué)類(lèi)型以鱗狀細(xì)胞癌為主。由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已是臨床晚期，5年生存率在15%以下［2］。目前，食管癌的治療方法主要為手術(shù)、化療、放療或多學(xué)科綜合治療［3］。盡管外科技術(shù)和綜合治療為食管癌患者帶來(lái)生存獲益，但其預(yù)后仍不盡人意。經(jīng)典的聯(lián)合化療方案仍有約一半的患者會(huì)產(chǎn)生原發(fā)性耐藥，即使對(duì)原方案敏感的患者，經(jīng)過(guò)2～3 個(gè)周期化療后又會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［4-5］?；熕幬锬退幨侵苯訉?dǎo)致臨床治療失敗和不良預(yù)后的重要原因。因此，闡明食管癌耐藥機(jī)制、篩選療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，對(duì)改善多藥耐藥現(xiàn)象、實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療及提高生存率具有重大意義。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種長(zhǎng)度為21～25 nt 的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因的3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'UTR）結(jié)合來(lái)抑制其翻譯或降解，從而參與細(xì)胞多種生理過(guò)程［6］。近年來(lái)，miRNA 與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，miRNA在癌細(xì)胞中可以作為腫瘤抑制因子或致癌因子發(fā)揮作用［7］。miR-103a-3p 位于染色體11q24.1 上，近期研究表明miR-103a-3p 的異常表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。但是，miR-103a-3p 與腫瘤耐藥的關(guān)系鮮少報(bào)道。本項(xiàng)工作探討了食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中miR-103a-3p 對(duì)奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）耐藥的影響及可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

ESCC 細(xì)胞系Eca109 和KYSE150 由山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心樣本庫(kù)保存。細(xì)胞培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購(gòu)自HyClone；血清購(gòu)自Gibco；MTT 購(gòu)自Invitrogen；OXA 粉針購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Trizol、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR 試劑盒均購(gòu)自TaKaRa；miRNA 提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Qiagen；抗RASSF8（Ras association domain family member 8）抗體（Abcam）；抗XPA（xeroderma pigmentosum complementation group A）和XPC（xeroderma pigmentosum complementation group C）抗體均購(gòu)自Proteintech；TransIntro?EL 轉(zhuǎn)染試劑和雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）股份有限公司。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Eca109 和KYSE150 細(xì)胞系均為貼壁細(xì)胞，其培養(yǎng)條件為：含有10%血清的完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2孵育。每2～3 d 換一次液，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，保持細(xì)胞良好的狀態(tài)。

2.2 耐藥和敏感細(xì)胞系篩選 研究者所在實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用氟尿嘧啶、OXA、伊立替康、順鉑、多西他賽和紫杉醇等6 種化療藥物對(duì)KYSE150、Eca109、EC9706 和TE-1 等多種食管癌細(xì)胞系及正常食管黏膜上皮細(xì)胞系SHEE進(jìn)行化療敏感性的研究，篩選出針對(duì)不同化療藥物表現(xiàn)出不同敏感程度的耐藥細(xì)胞系和敏感細(xì)胞系。經(jīng)鑒定，Eca109 細(xì)胞對(duì)OXA 耐藥，稱為OXA 化療耐藥ESCC 細(xì)胞系；KYSE150 細(xì)胞對(duì)OXA敏感，稱為OXA化療敏感ESCC細(xì)胞系。

2.3 OXA 藥物配制 OXA 分子量為397.29 g/mol。濃度范圍：0～1 200 μmol/L。母液配制：用生理鹽水溶解配成50 mg/10 mL（12.58 mmol/L），分裝成每管300 μL，-20 ℃密封儲(chǔ)存。稀釋液的配制：7 236.86μL 完全培養(yǎng)液中加入763.14μL 的OXA 母液，配成1 200 μmol/L 稀釋液8 mL，再分別配成15、30、60、120和240μmol/L的稀釋液。

2.4 MTT 和藥敏實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以每孔5 000 個(gè)的密度接種于96 孔板中，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。次日細(xì)胞貼壁 后，分別加 入15、30、60、120 和240 μmol/L 的OXA。藥物處理48 h 后，每孔加入20μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入200μL DMSO 置于搖床上10 min，促進(jìn)結(jié)晶充分溶解，觀察顆粒結(jié)晶逐漸溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處的吸光度（absorbance，A），根據(jù)A值計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

2.5 miRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 本研究所用的hsa-miR-103a-3p mimics、hsa-miR-103a-3p inhibitor 及相應(yīng)的陰性對(duì)照（negative control，NC）均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，序列見(jiàn)表1。細(xì)胞以每孔（1～2）×105個(gè)的密度接種于6 孔板中，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔。次日細(xì)胞貼壁后，分別取hsa-miR-103a-3p mimics（20 μmol/L）0.6 μL、mimics-NC 0.6 μL、inhibitor-NC 6 μL 和hsa-miR-103a-3p inhibitor（20 μmol/L）6μL，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液400μL 和轉(zhuǎn)染試劑12μL 輕輕吹打混勻，靜置5～10 min 后加入對(duì)應(yīng)的6 孔板中，培養(yǎng)36 h后，待驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 miRNA序列Table 1.The miRNA sequences

2.6RASSF8敲減載體的構(gòu)建 在Sigma 公司的網(wǎng)站上查找RASSF8基因的shRNA 序列，選擇序列如下：編碼序列1（coding sequence 1，CDS1）為5'-CCGGGCCTCAGATTGACAAATCAATCTCGAGATTGATTTGTCAATCTGAGGCTTTTTG-3'；非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）為5'-CCGGCCTGTTAGGTTACATCTGCTACTCGAGTAGCAGATGTAACCTAACAGGTTTTTTG-3'。將序列合成后退火，進(jìn)行雙酶切連接到pLKO.1 的載體上，篩選陽(yáng)性克隆。RASSF8 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建：將片段擴(kuò)增出來(lái)后，通過(guò)雙酶切連接到pENTER 載體上，篩選陽(yáng)性克隆。RASSF8 雙螢光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建：預(yù)測(cè)與靶基因的結(jié)合區(qū)，設(shè)計(jì)引物，上游序列為5'-GGCGGCTCGAGCACATTTGACTGACTTTGGTT-3'，下游序列為5'-AATGCGGCCGCACATGGCAATTTTCTGTTT-3'。將片段擴(kuò)增出來(lái)后，通過(guò)雙酶切連接到pMIR-RB-REPORT 載體上，篩選陽(yáng)性克隆。

2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種到6 cm皿中培養(yǎng)，融合度達(dá)到60%～70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將4 μg 質(zhì)粒與500 μL Opti-MEM 培養(yǎng)液混合標(biāo)記為A 液，10μL EL 轉(zhuǎn)染試劑與500μL Opti-MEM 培養(yǎng)液混合標(biāo)記為B 液，將A液和B 液混勻，靜置15 min 后加入對(duì)應(yīng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)48～72 h，待驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.8 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 利用Trizol 法提取總RNA，由反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 Western blot 實(shí)驗(yàn) 提取總蛋白后，用BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，取30～50μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜孵育，Ⅱ抗室溫1 h，化學(xué)發(fā)光顯影，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.10 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 細(xì)胞以每孔（5～8）×104個(gè)的密度接種于24 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，共同轉(zhuǎn)染hsa-miR-103-3p mimics/inhibitor 和pMIR-RB-REPORT 質(zhì)粒。48 h 后使用雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，然后對(duì)螢光素酶相對(duì)活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.11 PCR-array 實(shí)驗(yàn) PCR-array 是使用熒光定量PCR 的方法在一張96 孔或384 孔板上同時(shí)對(duì)某個(gè)信號(hào)通路或某疾病的84 個(gè)或371 個(gè)重要基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。本研究選用的RT2Profiler PCR Arrays 購(gòu)自QIAGEN，型號(hào)為PAHS-004ZC，涉及與人類(lèi)癌癥耐藥相關(guān)的信號(hào)通路。首先收集RASSF8 過(guò)表達(dá)和對(duì)照組細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板檢測(cè)PCR-array 96孔板中基因的差異表達(dá)，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié)果

1 hsa-miR-103-3p 在OXA 敏感ESCC 細(xì)胞 系中高表達(dá)

華大公司基因測(cè)序結(jié)果顯示，hsa-miR-103-3p在OXA 敏感ESCC 細(xì)胞系KYSE150 中的表達(dá)量為11 086，在OXA 耐藥ESCC 細(xì)胞系Eca109 中的表達(dá)量為4 985，敏感細(xì)胞系的表達(dá)量是耐藥細(xì)胞系表達(dá)量的2.22 倍（圖1A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，hsa-miR-103-3p 在KYSE150 細(xì)胞系中的表達(dá)量為3.89，在Eca109 細(xì)胞系中的表達(dá)量為1，敏感細(xì)胞系的表達(dá)量是耐藥細(xì)胞系表達(dá)量的3.89 倍（圖1B）。公司測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證結(jié)果一致，表明hsa-miR-103-3p在OXA敏感ESCC細(xì)胞系中高表達(dá)。

Figure 1.The expression of hsa-miR-103a-3p in oxaliplatin（OXA）-resistant esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）cell line Eca109 and OXA-sensitive ESCC cell line KYSE150 detected by Huada gene sequencing（A）and RT-qPCR（B）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Eca109 group.圖1 hsa-miR-103a-3p在OXA耐藥ESCC細(xì)胞系Eca109和OXA敏感ESCC細(xì)胞系KYSE150中的表達(dá)

2 hsa-miR-103a-3p的表達(dá)影響ESCC細(xì)胞對(duì)OXA的敏感性

在OXA 敏 感ESCC 細(xì)胞系KYSE150 和OXA 耐藥ESCC 細(xì)胞系Eca109 中分別轉(zhuǎn)染miRNA-inhibitor和miRNA-mimics，結(jié)果顯示，hsa-miR-103a-3p 過(guò)表達(dá)效率比對(duì)照組高862倍（圖2A）；而與對(duì)照組相比，敲減效率為89.2%（圖2B）。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hsamiR-103a-3p 對(duì)OXA 化療敏感性的影響，結(jié)果顯示，在OXA 化療耐藥ESCC 細(xì)胞系Eca109 中，與mimics-NC組相比，OXA對(duì)hsa-miR-103a-3p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞活力的抑制率顯著升高（P＜0.01），即細(xì)胞對(duì)OXA 的敏感性升高（圖2C）；反之，在OXA 化療敏感ESCC 細(xì)胞系KYSE150 中，與inhibitor-NC 組相比，OXA 對(duì)hsamiR-103a-3p敲減組細(xì)胞活力的抑制率顯著降低（P＜0.01），即細(xì)胞對(duì)OXA 的敏感性降低（圖2D）。上述結(jié)果表明，hsa-miR-103a-3p 可增強(qiáng)ESCC 細(xì)胞對(duì)OXA的敏感性。

3 RASSF8可能是hsa-miR-103a-3p的候選靶基因

結(jié)合軟件預(yù)測(cè)和文獻(xiàn)篩選，推測(cè)RASSF8可能是hsa-miR-103a-3p 的候選靶基因。根據(jù)圖3A 所示構(gòu)建與hsa-miR-103a-3p 相互結(jié)合的RASSF8-UTR 野生型及突變型螢光素酶報(bào)告基因載體。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與3'UTR-WT+miRNA NC 組相比，3'UTR-WT+miRNA 組螢光素酶相對(duì)活性顯著降 低（P＜0.05）；與3'UTR-WT+miRNA 組相比，3'UTR-MUT+miRNA 組螢光素酶相對(duì)活性顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。同時(shí)進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與轉(zhuǎn)染miRNA-NC 組相比，轉(zhuǎn)染hsa-miR-103a-3pmimics 后RASSF8 的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（圖3C），轉(zhuǎn) 染hsa-miR-103a-3p-inhibitor 后RASSF8 的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（圖3D）。

4 hsa-miR-103a-3p 可能通過(guò)RASSF8 影響ESCC細(xì)胞對(duì)OXA的敏感性

Figure 2.Effect of hsa-miR-103a-3p on oxaliplatin（OXA）sensitivity of Eca109 and KYSE150 cell lines.A：the overexpression efficiency of hsa-miR-103a-3p mimics in Eca109 cell line；B：the knockdown efficiency of hsa-miR-103a-3p inhibitor in KYSE150 cell line；C：the OXA sensitivity of Eca109 cell line after hsa-miR-103a-3p overexpression；D：the OXA sensitivity of KYSE150 cell line after hsa-miR-103a-3p knockdown.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs mimics-NC group；△△P＜0.01 vs inhibitor-NC group.圖2 hsa-miR-103a-3p對(duì)ESCC細(xì)胞奧沙利鉑化療敏感性的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Eca109 細(xì)胞系中，與hsa-miR-103a-3p mimics 組相比，共轉(zhuǎn)染hsamiR-103a-3p mimics 和pENTER-RASSF8 載體后，RASSF8 蛋白的表達(dá)顯著升高（圖4A）；在KYSE150細(xì)胞系中，與hsa-miR-103a-3p inhibitor 組相比，共轉(zhuǎn)染hsa-miR-103a-3p inhibitor和pLKO.1-RASSF8載體后，RASSF8 蛋白的表達(dá)顯著降低（圖4B）。MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與hsa-miR-103a-3p mimics 組相比，過(guò)表達(dá)RASSF8可減弱由hsa-miR-103a-3p 高表達(dá)所增強(qiáng)的Eca109 細(xì)胞化療敏感性，使耐藥性增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)圖4C；反之，與hsa-miR-103a-3p inhibitor 組相比，敲減RASSF8可減弱由hsa-miR-103a-3p低表達(dá)所促進(jìn)的KYSE150 細(xì)胞化療耐藥性，使敏感性增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)圖4D。

5 RASSF8 可能通過(guò)核苷酸切除修復(fù)機(jī)制參與ESCC細(xì)胞耐藥

通過(guò)PCR-array 實(shí)驗(yàn)，共篩選出8 個(gè)差異表達(dá)基因，其中FOS、RARB、XPA和XPC基因表達(dá)上調(diào)，而ABCB1、ABCC3、ESR2和SULT1E1基因表達(dá)下調(diào)。經(jīng)RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提示只有XPA和XPC的表達(dá)與PCR-array 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致（圖5A）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，hsa-miR-103a-3p低表達(dá)能夠引起XPA 和XPC 蛋白表達(dá)上調(diào)，而過(guò)表達(dá)hsamiR-103a-3p 能夠引起XPA 和XPC 蛋白表達(dá)下調(diào)（圖5B）。

6 hsa-miR-103-3p 在ESCC 患者中高表達(dá)，且患者預(yù)后差

配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果表明，hsa-miR-103-3p在ESCC腫瘤組織中高表達(dá)（圖6A）。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，hsa-miR-103-3p 高表達(dá)的ESCC 患者生存時(shí)間顯著縮短（圖6B）。

Figure 3. RASSF8 may be a target gene of hsa-miR-103a-3p in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）cell lines.A：the putative binding sites of hsa-miR-103a-3p on 3'-untranslated region（3'UTR）of RASSF8；B：dual-luciferase reporter assay showed that hsa-miR-103a-3p mimics decreased the luciferase activity of RASSF8 3'UTR-WT reporter rather than 3'UTRMUT reporter；C：the mRNA expression of RASSF8 after transfection of hsa-miR-103a-3p mimics；D；the mRNA expression of RASSF8 after transfection of hsa-miR-103a-3p inhibitor.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 3'UTR-WT+miRNA group；△△P＜0.01 vs inhibitor NC group.圖3 RASSF8可能是hsa-miR-103a-3p的候選靶基因

討 論

食管癌是一種全身性疾病，早期的食管癌患者癥狀十分隱匿，就診時(shí)已延誤最恰當(dāng)?shù)闹委煏r(shí)機(jī)，預(yù)后差，5 年生存率僅10%左右［2］，手術(shù)結(jié)合化療仍是其治療的常用手段。然而，化療耐藥成為治療過(guò)程中的主要挑戰(zhàn)。已有研究證實(shí)，miRNA 廣泛參與多種生理和病理過(guò)程，包括腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥。miRNA 作為重要的作用靶標(biāo)，有可能逆轉(zhuǎn)或改善多基因、多信號(hào)通路、多因素共同導(dǎo)致的腫瘤耐藥。

hsa-miR-103a-3p 作為腫瘤促進(jìn)和抑制因子，調(diào)控多種腫瘤的進(jìn)展。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，hsa-miR-103a-3p可作為腫瘤抑制因子抑制細(xì)胞增殖［8］。胃癌中，hsa-miR-103a-3p通過(guò)靶向調(diào)控ATF7促進(jìn)細(xì)胞增殖［9］。結(jié)直腸癌中，hsa-miR-103a-3p 呈現(xiàn)高表達(dá)，且通過(guò)靶向調(diào)控DICER 和PTEN 促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［10］。近期還有研究報(bào)道，hsa-miR-103a-3p 通過(guò)Hippo信號(hào)通路下調(diào)LATS1的表達(dá)，從而促進(jìn)甲狀腺腫瘤的侵襲、遷移和凋亡［11］，但是在前列腺癌中，hsamiR-103a-3p 通過(guò)靶向調(diào)控D52 明顯抑制細(xì)胞的增殖和遷移［12］。然而，hsa-miR-103a-3p 與腫瘤耐藥的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)改變hsa-miR-103a-3p的表達(dá)，影響ESCC 細(xì)胞對(duì)OXA 的耐藥，闡述了hsamiR-103a-3p 與ESCC 化療耐藥的關(guān)系，具有一定的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究證實(shí)RASSF8作為hsa-miR-103a-3p 下游的直接靶基因，參與ESCC 細(xì)胞對(duì)OXA 的耐藥機(jī)制。RASSF8是Ras 結(jié)構(gòu)域家族四個(gè)新成員之一，與RASSF1-6 不同，RASSF7-10 包含N 端RA 結(jié)構(gòu)域，缺少SARAH 結(jié)構(gòu)域［13-15］。RASSF蛋白參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期控制、微管穩(wěn)定、啟動(dòng)子甲基化、囊泡運(yùn)輸和缺氧反應(yīng)等［15］。RASSF8 在主要器官和組織中普遍表達(dá)，包括大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺和其他正常人體組織。內(nèi)源性RASSF8在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有表達(dá)，通過(guò)維持黏連連接的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞的黏附［16-17］。肺癌中，RASSF8低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖［18］。黑色素瘤中，RASSF8 通過(guò)激活P53-P21 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，體內(nèi)研究也表明抑制RASSF8 可增加人類(lèi)黑色素瘤異種移植的致瘤性［19］。卵巢癌中RASSF8作為miR-320a的直接靶基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［20］。結(jié)直腸癌中，miR-505通過(guò)靶向調(diào)控RASSF8參與結(jié)直腸癌對(duì)甲氨蝶呤的化療耐藥［21］。本研究提示，在hsa-miR-103a-3p 低表達(dá)的ESCC 細(xì)胞系中敲減RASSF8的表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)由hsa-miR-103a-3p低表達(dá)引起的化療耐藥表型；同時(shí)，在hsa-miR-103a-3p高表達(dá)的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)RASSF8，可以逆轉(zhuǎn)由hsa-miR-103a-3p 高表達(dá)引起的化療敏感表型。因此，我們推測(cè)hsa-miR-103a-3p通過(guò)靶向調(diào)控RASSF8參與ESCC 細(xì)胞對(duì)OXA 的化療耐藥。

Figure 4.hsa-miR-103a-3p influenced the oxaliplatin（OXA）sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）cell lines by targeting RASSF8.A：overexpression of RASSF8 in Eca109 cell line；B：knockdown of RASSF8 in KYSE150 cell line；C：the OXA sensitivity of Eca109 cell line with RASSF8 overexpression；D：the OXA sensitivity of KYSE150 cell line with RASSF8 knockdown.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Eca109 group；△△P＜0.01 vs mimics group；##P＜0.01 vs KYSE150 group；▲▲P＜0.01 vs inhibitor group.圖4 hsa-miR-103a-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控RASSF8影響ESCC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑化療敏感性

OXA 是第三代水溶性鉑類(lèi)化合物，其抗癌機(jī)制主要是作用于DNA，引起DNA 復(fù)制障礙，從而抑制癌細(xì)胞的分裂。核苷酸切除修復(fù)機(jī)制是造成OXA耐藥的機(jī)制之一。該途徑是一個(gè)由多功能蛋白聯(lián)合組成的網(wǎng)絡(luò)，其中ERCC1是公認(rèn)的關(guān)鍵因子，ERCC1基因的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)鉑類(lèi)耐藥；XPA 是另一個(gè)關(guān)鍵因子，抑制XPA基因的表達(dá)可以降低核苷酸切除修復(fù)的能力，提高細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的敏感性。XPC 主要作用于基因組修復(fù)途徑，與HR23B 和CETN2 結(jié)合形成XPC 復(fù)合物，發(fā)揮識(shí)別損傷位點(diǎn)的作用［22-24］。本研究表明，hsa-miR-103a-3p 的表達(dá)能夠引起XPA和XPC 蛋白水平的變化，hsa-miR-103a-3p 低表達(dá)能使得XPA 和XPC 的表達(dá)上調(diào)，提高了核苷酸切除修復(fù)能力，從而增加了細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的耐藥性。

總之，本研究通過(guò)驗(yàn)證組學(xué)測(cè)序中hsa-miR-103a-3p 在OXA 敏感ESCC 細(xì)胞系中高表達(dá)，明確了hsa-miR-103a-3p在ESCC中的耐藥作用，并初步預(yù)測(cè)hsa-miR-103a-3p的表達(dá)下調(diào)，通過(guò)上調(diào)RASSF8的表達(dá)，同時(shí)XPA和XPC的表達(dá)也上調(diào)，誘導(dǎo)核苷酸修復(fù)機(jī)制，促使ESCC 細(xì)胞對(duì)OXA 發(fā)生化療耐藥。臨床相關(guān)信息分析提示hsa-miR-103a-3p 高表達(dá)的ESCC患者，生存時(shí)間較短，預(yù)后差。因此，hsa-miR-103a-3p有望成為預(yù)測(cè)ESCC化療效果的潛在分子標(biāo)志物，為ESCC的治療及預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

Figure 5.hsa-miR-103a-3p influenced the oxaliplatin（OXA）sensitivity of esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）cell lines through regulating XPA and XPC.A：overexpression of RASSF8 promoted the mRNA expression of XPA and XPC；B：the protein expression of XPA and XPC in the cell lines with hsa-miR-103a-3p mimics/inhibitor transfection.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 150-NC group；△△P＜0.01 vs KYSE150 group；##P＜0.01 vs Eca109 group.圖5 hsa-miR-103a-3p可能通過(guò)調(diào)控XPA和XPA的表達(dá)影響ESCC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑化療敏感性

Figure 6.High expression of hsa-miR-103a-3p was correlated with the prognosis of ESCC patients.A：ESCC tumor tissues（T）had high hsa-miR-103a-3p expression compared with corresponding non-tumor tissues（N）using paired t-test（n=155，P＜0.001）；B：the patients with low hsa-miR-103a-3p expression had better survival than those with high hsa-miR-103a-3p expression（Kaplan-Meier survival analysis，log-rank test，P=0.043）.圖6 hsa-miR-103a-3p高表達(dá)的ESCC患者生存時(shí)間較短