酸棗葉總黃酮通過調(diào)控HIF-1α表達(dá)減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷*

趙煥新，楊 蓉，翟曉艷，楊李旺，季新燕，王惠潔

（山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原 030600）

心肌缺血后，盡早恢復(fù)血液再灌注是挽救缺血心肌的有效措施，但是大量研究證實(shí)，再灌注本身會(huì)造成心肌額外損傷，稱為缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［1］。在臨床上，心肌I/R 損傷一般發(fā)生在心梗溶栓后，會(huì)進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞的損傷，是造成患者預(yù)后不良的嚴(yán)重因素。因此，如何減輕心肌I/R損傷一直是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難題。

有研究表明，鈣超載、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等在心肌I/R 損傷中發(fā)揮重要作用，最終導(dǎo)致了心肌細(xì)胞凋亡或壞死，加重心肌損傷［2］。低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是在氧平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄活性來介導(dǎo)細(xì)胞對缺血和/或缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)［3］。大量研究證實(shí)，HIF-1α可以通過減輕I/R造成的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等發(fā)揮心肌保護(hù)作用［4-7］。我們在前期研究中觀察到，用DMOG 穩(wěn)定HIF-1α 在心肌的表達(dá)后，I/R誘發(fā)的心肌損傷顯著減輕［8-9］。

廣泛分布于自然界植物中的多種黃酮類化合物對I/R 損傷的心肌具有顯著的保護(hù)作用［10-12］。Ni等［13］觀察到豆蔻明通過激活HIF-1α/VEGFA 途徑可以減輕腦I/R 損傷。酸棗作為我國北方分布廣泛的野生資源，其葉子的提取物主要化學(xué)成分是黃酮類物質(zhì)，具有顯著的抗自由基作用及體內(nèi)抗氧化功能［14］。但是酸 棗葉總黃酮（total flavonoids fromZiziphus jujubavar.spinosaleaves，F(xiàn)ZSL）對I/R 損傷的心肌是否具有作用尚不明確。因此，本研究通過建立心肌I/R 損傷大鼠模型，觀察FZSL 對I/R 損傷心肌的影響，并探討其機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠60 只，6～8 周齡，體重（180～200）g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（晉）2017-0001。

2 主要試劑

FZSL 由山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，并經(jīng)過了中藥鑒定教研室的鑒定（詳細(xì)制備方法見參考文獻(xiàn)［15］）。伊文思藍(lán)（Evans blue）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自Sigma；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒，以及IL-1β、IL-6、TNF-α 和丙二 醛（molondialdehyde，MDA）ELISA 檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；caspase-3 活性檢測試劑盒購自BIOMOL；HIF-1α 抑制劑Lificiguat（YC-1）購自Cayman；HIF-1α和GAPDH兔多克隆抗體購自Santa Cruz。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 60 只雄性大鼠隨機(jī)分為6 組（每組10 只，其中5 只動(dòng)物用于缺血面積和心梗面積測定，另外5 只用于心肌組織MDA 含量、SOD 活性和caspase-3 活性測定，以及Western blot 檢測）：假手術(shù)（sham）組，冠狀動(dòng)脈左前降支下只穿線不結(jié)扎，穿線30 min后腹腔注射生理鹽水；I/R組，心肌缺血30 min后，腹腔注射生理鹽水，再灌注3 h；低、中、高劑量FZSL 組（FZSL-L、FZSL-M 和FZSL-H 組），心肌缺血30 min 后，50 mg/kg、100 mg/kg 和200 mg/kg 的FZSL腹腔注射，再灌注3 h；YC-1組，術(shù)前30 min腹腔注射HIF-1α 抑制劑YC-1（20 mg/kg），心肌缺血30 min，后200 mg/kg的FZSL腹腔注射，再灌注3 h。

3.2 大鼠心肌I/R 模型的建立 參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法［8-9］，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支造成左心室缺血，以心電圖出現(xiàn)ST 段和（或）T 波抬高或降低等心肌缺血波形為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)扎30 min（即缺血30 min）后，松開結(jié)扎線恢復(fù)冠脈血液灌注并持續(xù)（即再灌注）3 h。

3.3 心肌梗死面積的測定 于再灌注結(jié)束后原位重新結(jié)扎冠脈左前降支，經(jīng)股靜脈注入2%伊文思藍(lán)染料，待大鼠口唇變藍(lán)后取出心臟，將左心室沿垂直于心腔縱軸方向自心底向心尖平均切成六片環(huán)形的薄片，置于1%TTC 中，37 ℃避光孵育15 min，然后用10%甲醛溶液固定。正常心肌被伊文思藍(lán)染成藍(lán)色，缺血心肌染為紅色，梗死的心肌為白色。對心臟切面進(jìn)行掃描，并利用Image-Pro Plus 圖像分析軟件分別測定藍(lán)色、紅色和白色區(qū)域的面積。缺血面積（%）=缺血區(qū)總面積（area at risk，AAR）/左心室面積（left ventricle，LV）×100%；心梗面積（%）=梗死區(qū)面積（area of necrosis，An）/AAR×100%

3.4 血清LDH 和CK 活性及IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量測定 再灌注3 h結(jié)束后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，1 509×g離心15 min，取血清，按照檢測試劑盒測定LDH 和CK 活性，按照ELISA 試劑盒測定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

3.5 心肌組織MDA 含量及SOD 活性測定 各組動(dòng)物于再灌注結(jié)束后取缺血區(qū)心肌組織30 mg，提取蛋白后按照檢測試劑盒操作說明進(jìn)行測定。

3.6 心肌組織caspase-3 相對活性測定 再灌注結(jié)束后取缺血區(qū)心肌組織30 mg，充分裂解后離心取50μL 上清與底物于37 ℃孵育1.5 h，酶標(biāo)儀檢測其吸光度（A）。用蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化校正A值，以sham組的活性為1，計(jì)算其余各組的相對活性。

3.7 Western blot 法檢測心肌組織HIF-1α 的蛋白表達(dá)水平 再灌注結(jié)束后取缺血區(qū)心肌組織約50 mg，提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度，按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行操作［8-9］。用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 FZSL對大鼠心肌梗死面積的影響

以AAR/LV 的百分率作為判別心肌缺血程度的指標(biāo)，各模型大鼠之間無顯著差異，表明在進(jìn)行I/R實(shí)驗(yàn)過程中，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的手術(shù)操作在各組動(dòng)物間無差異性，各組動(dòng)物模型的心肌缺血程度大致相同，排除了由操作（如結(jié)扎范圍、結(jié)扎深度等）造成的誤差，因而在此模型基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，見圖1A、B。與sham 組相比，I/R 導(dǎo)致大鼠心肌發(fā)生梗死（P＜0.01）；給予FZSL 治療后，中劑量和高劑量組心肌梗死面積均顯著縮?。≒＜0.05），而低劑量組梗死面積與模型組相比無顯著差異（P＞0.05），見圖1A、C。

2 FZSL對大鼠血清LDH和CK活性的影響

血清LDH和CK活性常用于反映心肌損傷程度。與sham 組相比，I/R 組大鼠血清LDH 和CK 活性均顯著增加（P＜0.01）；中、高劑量FZSL組血清LDH和CK活性與I/R 組相比均顯著降低（P＜0.01），而低劑量FZSL組則無顯著變化（P＞0.05），見圖2。

3 FZSL對大鼠血清炎癥因子水平的影響

在sham 組中，大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平均較低，發(fā)生心肌I/R 損傷后，這些炎癥因子均顯著增加（P＜0.01）；中、高劑量FZSL組其含量比I/R 組顯著降低（P＜0.01），但低劑量FZSL 組變化與I/R 組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

4 FZSL 對大鼠心肌組織MDA 含量及SOD 活性的影響

I/R 使大鼠心肌組織中MDA 含量顯著增加，SOD活性顯著降低（P＜0.01）；在再灌注前給予FZSL 后，中、高劑量組大鼠心肌MDA 含量下降而SOD 活性顯著升高（P＜0.01），低劑量組二者的變化與I/R組比較均無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

5 FZSL對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與sham 組相比，I/R 大鼠心肌缺血區(qū)caspase-3相對活性顯著升高（P＜0.01）；給予中、高劑量FZSL后，caspase-3相對活性顯著降低（P＜0.01），而低劑量組變化與I/R組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

6 FZSL 對大鼠I/R 心肌組織HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響

用Western blot 方法檢測心肌組織中HIF-1α 的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與sham組比較，I/R增加了心肌組織HIF-1α 的蛋白表達(dá)量（P＜0.01）；而中、高劑量FZSL 可以使心肌組織HIF-1α 的蛋白水平進(jìn)一步增加（P＜0.05），低劑量組HIF-1α 的蛋白水平變化與I/R組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖6。

7 抑制HIF-1α后FZSL對大鼠I/R損傷心肌的影響

應(yīng)用YC-1 抑制HIF-1α 后，200 mg/kg FZSL 對大鼠I/R 損傷心肌的保護(hù)作用顯著減弱，與FZSL-H 組比較，心肌梗死面積顯著增大（P＜0.01，圖1C），血清LDH 和CK 活性顯著增加（P＜0.01，圖2），血清炎癥因子含量顯著增加（P＜0.01，圖3），心肌組織MDA含量增加而SOD 活性顯著降低（P＜0.01，圖4），caspase-3活性顯著增加（P＜0.01，圖5）。

討 論

Figure 1.Myocardial ischemic area and infarct size in the rats.A：representative images of Evans blue and TTC staining；B：myocardial ischemic area；C：myocardial infarct size.AAR：area at risk；LV：left ventricle；An：area of necrosis.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.圖1 大鼠心肌缺血面積與梗死面積

Figure 2.The activity of serum LDH and CK in the rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.圖2 大鼠血清LDH與CK活性

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌I/R 模型，研究FZSL對I/R 損傷心肌的作用。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ZSL 顯著減輕了I/R 造成的大鼠心肌損傷，使心梗面積顯著縮小，血清LDH 及CK 活性降低，IL-1β、IL-6 和TNF-α含量減少，心肌組織MDA 含量和caspase-3 活性降低，SOD 活性增加。同時(shí)，本研究也觀察到FZSL 上調(diào)了I/R 心肌組織HIF-1α 的蛋白表達(dá)水平，這一結(jié)果提示FZSL 對I/R 損傷心肌的保護(hù)作用可能與HIF-1α有關(guān)。

缺氧在缺血引起的病理生理變化過程中起著關(guān)鍵作用。HIF-1 是在氧平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄來介導(dǎo)細(xì)胞對缺血和/或缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。HIF-1 由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基構(gòu)成，其中α亞基被認(rèn)為是體內(nèi)低氧調(diào)控的主要功能亞基和活性亞基。有研究表明，HIF-1α表達(dá)增加是心肌缺血時(shí)最早期的分子水平上的適應(yīng)性反應(yīng)［16］。上調(diào)HIF-1α 表達(dá)可以抑制I/R 所致的大鼠心肌炎癥反應(yīng)［17］，減輕糖尿病大鼠I/R 心肌的氧化應(yīng)激損傷［18］。我們在研究中也觀察到，缺血后處理通過上調(diào)HIF-1α 表達(dá)，減輕了高脂血癥大鼠缺血再灌注造成的心肌梗死和細(xì)胞凋亡［9］，表明HIF-1α具有明確的心肌保護(hù)作用。

從植物中提取的黃酮類化合物具有改善心腦血管循環(huán)、清除自由基、抗氧化等功效。有研究顯示，酸棗葉的提取物總黃酮在小鼠體內(nèi)可以發(fā)揮抗氧化和抗衰老的作用［14］。本研究在大鼠模型上觀察到，心肌缺血后在再灌注前給予FZSL，可以顯著減輕I/R造成的心肌梗死和細(xì)胞凋亡，減少心肌炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，提示FZSL 對I/R 損傷的大鼠心肌具有保護(hù)作用。研究結(jié)果還顯示，F(xiàn)ZSL 在減輕心肌損傷的同時(shí)，上調(diào)了大鼠心肌組織HIF-1α 的蛋白表達(dá)量，這一結(jié)果初步提示，HIF-1α可能介導(dǎo)了FZSL的心肌保護(hù)作用。為了進(jìn)一步明確HIF-1α 在FZSL 保護(hù)大鼠心肌中的作用，我們應(yīng)用YC-1 抑制HIF-1α 后，觀察到FZSL 減小大鼠心梗面積、減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)抗氧化能力的作用顯著減弱，這一結(jié)果證實(shí)HIF-1α 在FZSL 的保護(hù)機(jī)制中確實(shí)發(fā)揮了一定的作用。

Figure 3.The levels of serum IL-1β，IL-6 and TNF-α in the rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.圖3 大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平

Figure 4.The content of MDA and the activity of SOD in the myocardial tissue of rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.圖4 大鼠心肌組織MDA含量及SOD活性

Figure 5.The activity of caspase-3 in the myocardial tissue of rats.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group；△△P＜0.01 vs FZSL-H group.圖5 大鼠心肌組織caspase-3活性

Figure 6.The protein level of HIF-1α in the myocardial tissue.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R group.圖6 大鼠心肌組織HIF-1α蛋白水平

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對大鼠進(jìn)行心肌I/R 的研究結(jié)果提示，F(xiàn)ZSL 減輕大鼠I/R 心肌損傷可能與其上調(diào)HIF-1α 表達(dá)有關(guān)，但是其確切機(jī)制尚需我們在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。