雷帕霉素通過AKT/mTOR途徑抑制川崎病冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)*

李潔瀅，胡 琳，楊艷娟，周 忠，田 正，焦 蓉

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院兒科，湖北襄陽 441000）

川崎病（Kawasaki disease，KD）又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種病因不明的急性發(fā)熱出疹性疾病，常見于5 歲以下嬰幼兒，病理變化為全身中、小血管炎，可累及冠狀動(dòng)脈，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈損傷（coronary artery lesion，CAL）［1］。目前大劑量靜脈使用丙種球蛋白（intravenous immunnoglobulin，IVIG）聯(lián)合阿司匹林口服是治療KD的標(biāo)準(zhǔn)方案，可使CAL發(fā)生率下降至3%～5%。然而，約10%～20%的KD 患兒對IVIG 無反應(yīng)，主要表現(xiàn)為首次劑量IVIG 后36～48 h 仍持續(xù)發(fā)熱且臨床癥狀無改善。對于無反應(yīng)型病例，糖皮質(zhì)激素、血漿置換、烏司他丁、英夫利昔單抗、免疫抑制劑等治療有其重要的應(yīng)用前景［2-3］。

目前的研究指出，KD 冠脈血管內(nèi)皮損傷及功能紊亂可能與血管炎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是全身炎癥反應(yīng)中重要的炎癥因子，也是KD 急性期最主要的促炎因子之一，不僅可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，還能進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子、趨化因子等。在KD 急性期炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度判斷方面，TNF-α 的表達(dá)水平可作為一個(gè)有價(jià)值的參考指標(biāo)［4］。在KD 動(dòng)物模型中，TNF-α 也是誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈炎癥和動(dòng)脈瘤形成所必需的［5］。Ma等［6］及Huang 等［7］研究者們常用TNF-α 誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）作為KD 冠脈損害的細(xì)胞模型，因此在本研究中我們延用了這一造模方法。

雷帕霉素（rapamycin，Rapa）又稱西羅莫司，是一種新型高效的脂溶性免疫抑制劑，能夠特異性抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）。mTOR 是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞生長的信號通路中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［8］。Rapa 能夠抑制mTOR 信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，但目前mTOR 信號通路是否參與KD冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷，以及Rapa能否誘導(dǎo)KD冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬及其調(diào)控機(jī)制的研究較少。本研究用Rapa處理KD冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力、自噬及炎癥損傷的相關(guān)指標(biāo)，旨在初步探討Rapa對冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)效應(yīng)及抗炎作用可能的機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

HCAEC 購自O(shè)two Biotech；DMEM 高糖培養(yǎng)液底液購自Gibco；TNF-α 和細(xì)胞自噬染色檢測試劑盒購自Solarbio；胎牛血清購自Sigma；Rapa 購自Selleck；CCK-8 試劑盒購自Biosharp；TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNase H Plus）購自TaKaRa；兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）抗體、鼠抗人磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗體、兔抗人微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（mitotubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體和兔抗人beclin-1 抗體均購自Poteintech；兔抗人mTOR 和磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）抗體均購自Cell Signaling Technology；鼠抗人核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體購自Santa Cruz；兔抗人磷酸化NF-κB p65（phosphorylated p65，p-p65）抗體購自Wanleibio；兔抗人p62、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β抗體均購自Absin。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher）；化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad）；熒光顯微鏡及分子病理分型系統(tǒng)（Olympus）；SpectraMax 多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；4 ℃低溫高速離心機(jī)（Beckman）。

3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HCAEC 在37 ℃、5% CO2加濕的 氣氛下，用DMEM 高糖培養(yǎng)液，附加10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/mL）和1%鏈霉素（100 mg/L）進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d傳代1 次，選擇對數(shù)期生長良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)處理?xiàng)l件的不同將HCAEC 分為對照組、TNF-α刺激組（TNF-α 刺激4 h）、TNF-α+50 nmol/L Rapa 組（50 nmol/L Rapa 預(yù)保護(hù)24 h 后再用TNF-α 刺激4 h）和TNF-α+100 nmol/L Rapa 組（100 nmol/L Rapa 預(yù)保護(hù)24 h后再用TNF-α刺激4 h）。

4 方法

4.1 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力 按CCK-8 試劑說明書檢測TNF-α 及Rapa 對HCAEC 的細(xì)胞毒作用。將對數(shù)生長期的HCAEC 接種于96 孔板，每孔4 000 個(gè)細(xì)胞。我們首先參考Fan 等［9］及Wang 等［4］的研究，篩選出Rapa 及TNF-α 作用的大致濃度范圍及作用時(shí)間，即用不同濃度（200、100、50、25 和12.5 nmol/L）的Rapa 作用24 h，或不同濃度（100、50、25、12.5和6.25μg/L）的TNF-α 作用4 h 后每孔加入10μL 的CCK-8 試劑，避光保存置于培養(yǎng)箱2 h 后用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度（A），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)下列公式計(jì)算：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對照A值）×100%。

4.2 RT-qPCR 檢測HCAEC 中AKT、mTOR、IL-1β、IL-6 和IL-8 的mRNA 表達(dá)水平 將細(xì)胞按照上述分組處理鋪于6 孔板中培養(yǎng)，用Trizol 法提取各組細(xì)胞總RNA，以提取的總RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為70 ℃保溫10 min后迅速在冰上冷卻。使用TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNase H Plus）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)周期，每個(gè)標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4.3 Western blot 檢測AKT、mTOR、IL-1β、IL-6、NFκB、LC3、beclin-1 和p62 蛋白的表達(dá)水平 將孵育后的HCAEC 裂解，使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。吸取處理好的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后用聚偏二氟乙烯膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（250 mA，150 min）?？贵w孵育前將膜放置在5%脫脂奶粉中封閉2 h，滴加Ⅰ抗（1∶1 000）后4℃孵育過夜。在TBST 洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或抗兔IgG Ⅱ抗（1∶3 000）孵育2 h，使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光呈像系統(tǒng)顯影定影后得到各組蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，重復(fù)做3 次。使用Image Lab 軟件進(jìn)行積分吸光度分析，比較各組蛋白水平差異。

4.4 單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）染色 MDC 可被細(xì)胞吸收并選擇性聚集于自噬泡中，在熒光顯微鏡下可觀察到染上MDC 熒光的自噬泡呈綠色點(diǎn)狀。選擇生長良好的HCAEC 接種于24 孔板，按上述分組處理培養(yǎng)后棄去原培養(yǎng)液，用300～400 μL 的洗滌液清洗細(xì)胞2 遍，每孔加入20 μL 的MDC，室溫避光染色15～45 min（染色時(shí)間根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，可適當(dāng)延長），再用洗滌液清洗2 遍后置于熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm），計(jì)數(shù)并拍照。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Rapa和TNF-α對HCAEC活力的影響

將Rapa 溶解于有機(jī)溶劑二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，用不同濃度（12.5、25、50、100和200 nmol/L）的Rapa 處理冠脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h 后，如圖1A 所示，除200 nmol/L 組細(xì)胞活力被顯著抑制外（P＜0.01），其余各組細(xì)胞的活力無顯著差異（P＞0.05）。因此，可忽略因DMSO 毒性作用所致的細(xì)胞生長抑制，我們用50 和100 nmol/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)預(yù)保護(hù)的Rapa 濃度。用不同濃度（6.25、12.5、25、50和100 μg/L）的TNF-α 處理冠脈內(nèi)皮細(xì)胞4 h 后，如圖1B 所示，6.25、12.5 和25μg/L 組細(xì)胞活力無顯著差異（P＞0.05），當(dāng)TNF-α 濃度高于50μg/L 后細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01）。因此，我們后續(xù)選用50μg/L的TNF-α刺激HCAEC。

2 Rapa促進(jìn)TNF-α刺激的HCAEC自噬發(fā)生

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α 刺激組自噬相關(guān)蛋白beclin-1 表達(dá)水平和LC3-II/LC3-I比值顯著下降（P＜0.05），p62 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；用50 和100 nmol/L Rapa 預(yù)保護(hù)處理后，beclin-1 表達(dá)水平和LC3-II/LC3-I 比值顯著升高（P＜0.01），p62表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖2。

MDC 染色結(jié)果顯示，TNF-α 處理后，細(xì)胞自噬泡較正常組明顯減少；經(jīng)50 和100 nmol/L Rapa 處理后HCAEC自噬泡數(shù)量明顯增加，見圖3。

3 Rapa抑制TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC炎癥因子表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果表明，與對照組相比，HCAEC 經(jīng)TNF-α 刺激后炎癥因子IL-6、IL-1β 和IL-8 的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；50 和100 nmol/L Rapa預(yù)保護(hù)24 h 后IL-6（P＜0.05）、IL-1β（P＜0.05）和IL-8（P＜0.01）的mRNA 表達(dá)被抑制，見圖4。Western blot 結(jié)果亦顯示，與對照組相比，TNF-α 刺激后IL-6和IL-1β 的蛋白表達(dá)被激活（P＜0.01）；Rapa 顯著抑制IL-6和IL-1β蛋白的表達(dá)（P＜0.01），見圖5。

Figure 1.The cytotoxicity of rapamycin（Rapa；A）and TNF-α（B）on HCAEC.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 nmol/L Rapa or 0μg/L TNF-α group.圖1 Rapa及TNF-α對HCAEC的細(xì)胞毒性作用

Figure 2.Rapamycin（Rapa）up-regulated the expression of beclin-1 and the ratio of LC3-II/LC3-I in HCAEC，but inhibited the expression of p62 protein.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs control（Con）group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs TNF-α group.圖2 Western blot檢測HCAEC中beclin-1、p62和LC3的蛋白水平

Figure 3.After rapamycin（Rapa）treatment，the number of autophagic vesicles in HCAEC increased（scale bar=50μm）.A：control group；B：TNF-α group；C：TNF-α+50 nmol/L Rapa group；D：TNF-α+100 nmol/L Rapa group.圖3 MDC染色檢測TNF-α和Rapa作用后HCAEC自噬泡的變化

Figure 4.Rapamycin（Rapa）significantly inhibited the mRNA expression of IL-6（A），IL-1β（B）and IL-8（C）in HCAEC.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control（Con）group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs TNF-α group.圖4 RT-qPCR檢測各組HCAEC中IL-6、IL-1β和IL-8的mRNA表達(dá)水平

4 Rapa 可能通過AKT/mTOR/NF-κB 信號通路來誘導(dǎo)自噬并發(fā)揮抗炎作用

為了探究Rapa 促進(jìn)自噬發(fā)生及減少炎癥因子表達(dá)的作用機(jī)制，我們檢測了mTOR 及其上游AKT、下游NF-κB 的表達(dá)。與對照組相比，TNF-α 作用4 h后，HCAEC 中p-p65蛋白水平顯著升高（P＜0.01），同時(shí)AKT 和mTOR 的mRNA 表達(dá)水平及p-AKT 和pmTOR 蛋白水平也顯著升高（P＜0.05）；Rapa 預(yù)保護(hù)24 h 后上述mRNA 及蛋白水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖5～7。

討 論

KD 是一種以動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活化為特征的系統(tǒng)性脈管炎，逐漸成為兒童獲得性心臟病的主要原因之一。KD 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能涉及免疫活化、炎癥因子、NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮損傷等諸多因素［10-11］。組織病理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，KD 患者冠狀動(dòng)脈血管壁發(fā)生明顯破壞，內(nèi)皮細(xì)胞脫落、大量炎性細(xì)胞侵潤［12］。因此本研究主要采用體外培養(yǎng)的HCAEC 來探索早期KD 血管炎的發(fā)病機(jī)制，我們用KD 急性期最主要的促炎因子TNF-α 刺激HCAEC，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞被激活，大量炎癥因子如IL-6、IL-1β 等表達(dá)，這提示我們成功構(gòu)建了KD 血管損傷的細(xì)胞模型。

AKT/mTOR 信號通路在人體各系統(tǒng)疾病尤其是心血管疾病發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［13-14］?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)表明，Rapa 可能通過影響AKT/mTOR 信號通路，改善心臟結(jié)構(gòu)和功能，減輕心力衰竭或減緩心肌肥厚的進(jìn)展等［15］。但關(guān)于AKT/mTOR 信號通路是否參與KD的發(fā)生與發(fā)展目前尚無定論。從我們的研究結(jié)果中可以推測mTOR通路與KD冠脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷有一定的相關(guān)性，并對AKT 進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，mTOR通路的激活會加速AKT 的磷酸化，用Rapa 阻斷mTOR通路后，AKT的磷酸化就相應(yīng)減少。有研究指出，Rapa最初為一種免疫抑制劑，在單核細(xì)胞中可抑制NF-κB 依賴性前炎癥細(xì)胞因子IL-12 生成，增加信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3依賴性抗炎因子IL-10的產(chǎn)生［16］。同樣，在TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC 中，mTOR 的阻斷抑制了NF-κB 信號通路的活化并減少相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，這提示mTOR 通路可能參與了KD 冠脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。但mTOR 蛋白包括mTOR 復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTORC2。這兩種形式的mTOR 復(fù)合物在對Rapa 的敏感性、相關(guān)蛋白成分、上游信號、底物特異性以及它們控制的細(xì)胞功能方面各不相同［17］，在KD冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Rapa作用于何種復(fù)合物仍需進(jìn)一步的探索。另外，疑惑的是，陳芳［18］等關(guān)于mTOR基因rs1883965 位點(diǎn)多態(tài)性與KD的關(guān)聯(lián)性研究中顯示，KD患兒mTOR基因型分布與健康兒童相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明mTOR基因可能并未參與KD及其冠脈損傷的發(fā)生。但該研究僅從基因水平進(jìn)行分析且樣本量較小，故仍需進(jìn)行大樣本、多中心的研究。

Figure 5.Rapamycin（Rapa）significantly decreased the protein levels of IL-6，IL-1β and p-p65 in HCAEC.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs TNF-α group.圖5 Western blot檢測HCAEC中IL-6、IL-1β和p-p65的蛋白水平

自噬可以降解多余蛋白質(zhì)及損傷細(xì)胞器，在急性病理損傷的情況下，自噬激活被認(rèn)為是保護(hù)性的［15］。自噬通過內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等參與多種血管性疾病及炎性疾病，而以血管非特異性炎癥為主要病理改變的KD，其炎癥反應(yīng)及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損害過程中是否存在自噬的發(fā)生，目前報(bào)道不多。Huang 等［19］的研究表明，缺乏自噬可能有助于KD 患者外周血中性粒細(xì)胞的持續(xù)活動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，IVIG 可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的自噬和中性粒細(xì)胞的死亡，但其確切的機(jī)制仍有待闡明。然而Qin等［20］的研究推測，KD患者外周血單核細(xì)胞分泌的趨化因子和炎癥因子可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞過度自噬，并導(dǎo)致HCAEC 的炎癥損傷，這表明外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在KD 中發(fā)揮不同的作用，內(nèi)皮細(xì)胞的自噬在不同的生化因素誘導(dǎo)下可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果［21］。而本研究直接檢測了冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平，我們觀察到在TNF-α 誘導(dǎo)的KD 冠脈損害的細(xì)胞模型中自噬功能受損，Rapa可以顯著提高HCAEC的自噬水平，且進(jìn)一步證明了這一作用可能是通過AKT/mTOR 及NF-κB 信號通路來實(shí)現(xiàn)的。除了AKT/mTOR 信號通路外，Marek-Iannucci 等［22］提出AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑可能也參與了KD 內(nèi)皮細(xì)胞自噬的發(fā)生。在干酪乳桿菌細(xì)胞壁提取物誘導(dǎo)的小鼠KD 心血管損傷中，促進(jìn)自噬的AMPK途徑相關(guān)蛋白表達(dá)減少，自噬和線粒體清除功能障礙，并導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體失控激活和IL-1β的產(chǎn)生。

Figure 6.Rapamycin（Rapa）significantly inhibited the mRNA expression of AKT（A）and mTOR（B）in HCAEC.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs TNF-α group.圖6 RT-qPCR檢測HCAEC中AKT和mTOR的mRNA表達(dá)水平

Figure 7.Rapamycin（Rapa）significantly decreased the protein levels of p-AKT and p-mTOR in HCAEC.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs control group；**P＜0.01 vs TNF-α group.圖7 Western blot檢測HCAEC中p-AKT和p-mTOR的蛋白水平

總的來說，我們的研究首次證明了在KD 冠脈損害的細(xì)胞模型中，自噬水平下降，炎癥因子大量表達(dá)；Rapa 可以通過自噬依賴的機(jī)制減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，且AKT/mTOR 及NF-κB 信號通路在這一過程中起重要作用。這些結(jié)果可能為KD 的病理生理學(xué)研究提供重要見解。但本研究僅涉及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)本課題組還將進(jìn)一步完善體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以深入探索自噬調(diào)節(jié)在KD 中的作用，以期為KD 的治療提供參考資料。