miRNA-218-5p通過HMGB1信號通路抑制RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥反應(yīng)*

李海濤，蔡 飛，胡國富，滕云飛

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，湖北武漢 430000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、慢性炎癥、氧化應(yīng)激失衡及脂質(zhì)代謝障礙等為主要特征的慢性疾?。?］。在AS發(fā)展的初期進(jìn)程中單核細(xì)胞通過向內(nèi)膜遷移聚集以分化成巨噬細(xì)胞。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）是AS 發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵因子，巨噬細(xì)胞通過其細(xì)胞膜上的跨膜蛋白如清道夫受體A（scavenger receptor-A，SR-A）、CD36等過度攝取ox-LDL，變成膽固醇負(fù)載的泡沫細(xì)胞［2］。泡沫細(xì)胞可以通過分泌炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定從而加重AS［3-4］。miRNA 是一種高度保守的長為20 個(gè)左右核苷酸序列的非編碼單鏈小分子RNA，其能通過靶向mRNA 而介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。近年來大量文獻(xiàn)證明，微小RNA（microRNA，miRNA）在AS 的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中有著極其關(guān)鍵的作用［5］。miRNA-218-5p 與肺癌、宮頸癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌及前列腺癌等癌癥的發(fā)生緊密相關(guān)［6］。文獻(xiàn)表明，miRNA-218-5p在AS患者外周血中的表達(dá)顯著下降，可以作為AS 臨床診斷的生物標(biāo)志物［7-8］。但miRNA-218-5p 在AS 中的作用尚未有明確的闡述。高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種DNA 結(jié)合蛋白，在炎癥調(diào)節(jié)過程中有著極為關(guān)鍵的作用。研究表明，HMGB1 信號通路在AS 疾病中被異常激活，且通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)而影響疾病的進(jìn)展［9］。另外，我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)HMGB1 為miRNA-218-5p 的預(yù)測靶點(diǎn)。鑒于此，本研究通過構(gòu)建RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型探討miRNA-218-5p 對泡沫細(xì)胞形成及HMGB1信號通路的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞、試劑和儀器

RAW264.7 細(xì)胞（貨號：CL-0190）購自武漢普諾賽公司。

miRNA-218-5p mimics、miRNA mimics control、HMGB1-3' 端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'UTR）野生型（wild-type，WT）報(bào)告質(zhì)粒及HMGB1-3'UTR 突變型（mutant，MUT）報(bào)告質(zhì)粒均購自上海吉瑪生物有限公司；Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染試劑（貨號：11668027）購自Invitrogen；ox-LDL、蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：IO1300、BC3711 和PC0020）均購自北京索萊寶生物有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（貨號：RG027）購自上海碧云天生物公司；小鼠IL-1β、IL-6 和TNFα ELISA 檢測試劑盒（貨號：CSB-E08054m、CSBE04639m 和CSB-E04741m）均購自武漢華美生物科技有限公司；兔抗小鼠GAPDH、HMGB1、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 多克隆抗體（貨號：10494-1-AP、10829-1-AP、19811-1-AP 和10745-1-AP）均購自武漢三鷹生物有限公司；兔抗小鼠p-NF-κB p65單克隆抗體（貨號：3033）購自Cell Signaling Technology。

離心機(jī)購自Eppendorf；PCR 儀購自Applied Biosystems；超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Sanyo。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中生長，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況2～3 d 傳代1 次，用0.25%胰酶消化，取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞（1×106個(gè)）接種于6 孔板中，細(xì)胞生長密度至70%～90%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書分別轉(zhuǎn)染miRNA-218-5p mimics及miRNA mimics control。

2.3 油紅O 染色 實(shí)驗(yàn)分為4 組：對照組、模型組、miRNA mimics 組及miRNA NC 組。對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)；模型組細(xì)胞采用80 mg/L ox-LDL 誘導(dǎo)24 h 建立泡沫細(xì)胞模型；miRNA mimics 組及miRNA NC 組分別轉(zhuǎn)染miRNA-218-5p mimics 及miRNA mimics control 24 h 后再用80 mg/L ox-LDL 誘導(dǎo)24 h 建立泡沫細(xì)胞模型。將細(xì)胞接種在鋪有蓋玻片的6 孔板中，ox-LDL 誘導(dǎo)處理細(xì)胞24 h 后除去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞后4%多聚甲醛固定10 min，用新鮮配制的油紅O染液室溫下孵育15 min后，PBS沖洗后甘油封片，顯微鏡下觀察拍照。

2.4 ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達(dá)量 ox-LDL 誘導(dǎo)處理細(xì)胞24 h 后收集各組細(xì)胞，分別采用IL-1β、IL-6 及TNF-α 的ELISA 試劑盒檢測細(xì)胞中相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 qPCR 檢測 ox-LDL 誘導(dǎo)處理細(xì)胞24 h后收集各組細(xì)胞，按照TRIzol 試劑盒中說明書的步驟提取樣本總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA-218-5p 的上游引物序列為5'-GCCGAGTTGTGCTTGATCTAA-3'，下游引物序列為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；內(nèi)參照U6 的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。qPCR的總體積為20μL：10μL 的PCR 預(yù)混液，上、下游引物各0.8 μL，7.4 μL 的超純水，1.0 μL 的模板。采用三步法進(jìn)行qPCR，具體如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3 次重復(fù)檢測。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達(dá)情況。

2.6 Western blot 檢測 ox-LDL 誘導(dǎo)處理細(xì)胞24 h后收集對照組、模型組、miRNA mimics 組及miRNA NC 組細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取細(xì)胞總蛋白。然后定量30 μg 進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入Ⅰ抗（GAPDH 抗體，1∶10 000 稀釋；HMGB1 抗體，1∶500稀釋；TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65抗體，1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000 稀釋），室溫下孵育2 h，TBST清洗4次。加入ECL化學(xué)發(fā)光顯影后掃描膠片，采用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參照GAPDH條帶的灰度值。

2.7 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為4 組：HMGB1-3'UTR-WT+miRNA NC 組（RAW264.7 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染HMGB1-3'UTR-WT 報(bào)告質(zhì)粒和miRNA mimics control）、HMGB1-3'UTR-WT+miRNA-218-5p mimics 組（RAW264.7 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染HMGB1-3'UTR-WT 報(bào)告質(zhì)粒和miRNA-218-5p mimics）、HMGB1-3'UTR-MUT+miRNA NC組（RAW264.7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染HMGB1-3'UTRMUT 報(bào)告質(zhì)粒和miRNA mimics control）和HMGB1-3'UTR-MUT+miRNA-218-5p mimics組（RAW264.7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染HMGB1-3'UTR-MUT 報(bào)告質(zhì)粒和miRNA-218-5p mimics）。轉(zhuǎn)染48 h 后參照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測，計(jì)算螢光素酶相對活性（螢火蟲螢光素酶/海腎螢光素酶）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 油紅O 染色觀察各組RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化

油紅O 染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)過80 mg/L 的ox-LDL 誘導(dǎo)24 h 后可見細(xì)胞中存在大量紅色脂滴，表明成功建立了RAW264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型；與模型組相比，miRNA mimics組RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴染色較淡，見圖1。

Figure 1.Changes of intracellular lipids in RAW264.7 cell-derived foam cells of each group（oil red O staining，×400）.圖1 各組RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)變化

2 ELISA 試劑盒檢測各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α表達(dá)量

與對照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，miRNA mimics 組RAW264.7 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），而miRNA NC 組RAW264.7 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平無顯著變化（P＞0.05），見圖2。

3 qPCR檢測各組細(xì)胞中miRNA-218-5p的表達(dá)

與對照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞中miRNA-218-5p 表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，miRNA mimics 組RAW264.7細(xì)胞中miRNA-218-5p表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），而miRNA NC 組RAW264.7 細(xì)胞中miRNA-218-5p 表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05），見圖3。

Figure 2.Changes of IL-1β，IL-6 and TNF-α expression levels in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖2 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)量變化

Figure 3.Changes of miRNA-218-5p expression in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖3 各組細(xì)胞中miRNA-218-5p表達(dá)量變化

4 Western blot 檢測各組細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平

與對照組相比，模型組RAW264.7 細(xì)胞中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），NF-κB p65 無顯著變化（P＞0.05）；與模型組相比，miRNA mimics 組RAW264.7 細(xì)胞中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），NF-κB p65無顯著變化（P＞0.05），而miRNA NC 組RAW264.7 細(xì)胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 和NF-κB p65 蛋白水平均無顯著變化（P＞0.05），見圖4。

Figure 4.The protein levels of HMGB1，TLR4，NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖4 各組細(xì)胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 和p-NF-κB p65蛋白水平的變化

5 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miRNA-218-5p對HMGB1的靶向作用

經(jīng)TargetScan（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測，HMGB1-3'UTR 具有miRNA-218-5p 高度保守的結(jié)合位點(diǎn)，見圖5A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與HMGB1-3'UTR-WT+miRNA NC 組相比，HMGB1-3'UTR-WT+miRNA-218-5p mimics 組螢光素酶活性顯著下降（P＜0.05），而HMGB1-3'UTR MUT+miRNA NC 組與HMGB1-3'UTR MUT+miRNA-218-5p mimics 組中螢光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見圖5B。

討 論

Figure 5.Targeting relationship between miRNA-218-5p and HMGB1.A：TargetScan prediction result；B：relative luciferase activity in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs miRNA NC group.圖5 miRNA-218-5p對HMGB1的靶向作用

AS 是一種常見的慢性疾病，主要特點(diǎn)為動(dòng)脈血管管腔在粥狀脂質(zhì)斑塊沉積作用下變窄引起血流不暢，最終造成起下游組織缺血性損傷。AS 不僅直接危害機(jī)體健康，還能引發(fā)動(dòng)脈瘤，主動(dòng)脈夾層以及冠狀動(dòng)脈疾病等一系列高危疾病，具有較高的發(fā)病率及致死率，而且治療難度大，治療成本高［10］。隨著人們生活水平的逐漸提高，中老年人對于高脂食物的過量攝入，使AS 己成為中老年人容易患病的主要疾病之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2020年全球頸AS預(yù)估有近20億人，而估算我國可能有近2.7 億的患者，而且呈逐年上升的趨勢［11］。目前，臨床上對于AS 的治療一般通過調(diào)節(jié)機(jī)體反應(yīng)降低體內(nèi)血脂水平為主，治療藥物種類一般分為他汀類、煙酸類、貝特類及膽酸螯合劑類藥物等。這類藥物雖然對AS 具有一定的治療作用，但是也存在許多副作用，如損傷肝臟功能、導(dǎo)致胃腸道消化不良、過敏反應(yīng)等［12］。因此尋找開發(fā)AS 疾病中的新型有效治療靶點(diǎn)極其重要。miRNA是近年來研究非常熱門的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA 能通過與其相應(yīng)mRNA 靶標(biāo)堿基配對從而引導(dǎo)沉默復(fù)合體以降解mRNA 或阻止其翻譯的方式導(dǎo)致mRNA 沉默［13］。大量研究者證實(shí)，miRNA 影響著AS 的進(jìn)程及其可以作為診治AS 疾病中的靶點(diǎn)［14］。文獻(xiàn)表明，miRNA-218-5p在AS臨床患者外周血中表達(dá)顯著下降，其可以作為AS 臨床診斷的生物標(biāo)志物［7-8］。本研究中通過qPCR 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在ox-LDL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中miRNA-218-5p表達(dá)水平下降。另外本研究中油紅O 染色結(jié)果表明提高miRNA-218-5p 表達(dá)水平能抑制RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成。而巨噬源性泡沫細(xì)胞的形成是AS 疾病進(jìn)程的初始環(huán)節(jié)。在AS 疾病初期，巨噬細(xì)胞通過大量攝取ox-LDL 形成了泡沫細(xì)胞，后期泡沫細(xì)胞的過度沉積能導(dǎo)致AS 初期形狀不規(guī)則病理脂質(zhì)條紋的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)斑塊的形成［3］。所以miRNA-218-5p 能抑制泡沫細(xì)胞形成可作為其能防止AS發(fā)生發(fā)展的重要手段。

自Ross提出AS的炎癥學(xué)說以來，炎癥反應(yīng)已被證實(shí)于AS 的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要。大量研究文獻(xiàn)證明AS病灶處有大量炎癥因子存在，進(jìn)而推進(jìn)了AS的發(fā)展進(jìn)程［15］。HMGB1 炎癥通路于炎癥刺激和調(diào)節(jié)中有著極為關(guān)鍵的作用［16］。HMGB1 是一種高度保守的核DNA 結(jié)合蛋白，在細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)HMGB1 也是損傷相關(guān)模式分子家族主要成員之一，可從免疫細(xì)胞自主分泌或從損傷的細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)移到胞漿或胞外，通過作用于細(xì)胞膜上晚期糖基化終末產(chǎn)物受體和Toll樣受體如TLR4的激活完成信號傳導(dǎo)過程，這些激活的受體能進(jìn)而引發(fā)NF-κB 的活化從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［17-18］。近年來大量文獻(xiàn)證實(shí)HMGB1信號通路介導(dǎo)了AS疾病的進(jìn)展。de Souza 等［19］的研究表明，HMGB1 在AS 病變組織的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，并與AS 脂質(zhì)斑塊的形成有關(guān)。Xiao等［20］的研究表明，對ApoE基因敲除的AS小鼠給予丙酮酸乙酯治療能阻斷HMGB1 的表達(dá)進(jìn)而減少其下游炎癥因子表達(dá)，從而抑制小鼠AS 的發(fā)展進(jìn)程。Li等［21］的研究表明，HMGB1 是miR-141-5p的靶標(biāo)，miR-141-5p 通過靶向HMGB1 通路抑制AS 中血管平滑肌細(xì)胞的炎癥、增殖和遷移。所以，針對HMGB1炎癥途徑可能是診治AS 疾病的有效策略。本研究中，通過miRNA-218-5p mimics 提高RAW264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中miRNA-218-5p 表達(dá)水平能抑制HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達(dá)，同時(shí)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也表明了miRNA-218-5p 能直接靶向結(jié)合HMGB1 的3'UTR 從而調(diào)控其表達(dá)。上述結(jié)果提示，RAW264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中HMGB1 通路被激活，而miRNA-218-5p 可抑制HMGB1 通路激活，進(jìn)而減少RAW264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥因子分泌。

綜上所述，miRNA-218-5p 可以抑制RAW264.7細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，調(diào)節(jié)HMGB1通路減少炎癥因子分泌，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對防治AS 疾病有重要的意義。