同株紫斑牡丹中單瓣與重瓣花芽分化及內(nèi)源激素含量比較

張 瑞，唐 紅*，何麗霞

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，蘭州 730070；2 甘肅省牡丹工程研究中心，蘭州 730046)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)屬芍藥科芍藥屬樹種，主要分布于甘肅南部、陜西南部和四川北部等地區(qū)，因其花瓣基部有一個明顯的紫斑而得名[1]。紫斑牡丹植株高大、花色鮮艷、香味濃郁、抗旱耐寒，既是觀賞植物，又是藥用和食用的名貴花卉[2]。紫斑牡丹品種群由野生的單瓣花經(jīng)過不斷的自然進(jìn)化，具有以雄蕊瓣化為主的半重瓣、重瓣、極重瓣等豐富的花型，且在同株紫斑牡丹中既有單瓣花型又有重瓣花型。

花芽分化是有花植物生長發(fā)育過程中最重要的階段，影響著植物開花的數(shù)量和質(zhì)量,花芽分化過程由環(huán)境因子和內(nèi)源激素共同調(diào)控，其中，內(nèi)源激素是影響花芽分化的重要因素。因而研究紫斑牡丹花芽分化過程對其花期調(diào)控及栽培有重要意義[3]。目前，對紫斑牡丹花芽的研究多集中在花芽分化形態(tài)及分化時間上。王蓮英[4]通過觀察形態(tài)進(jìn)程得出，牡丹的芽為混合芽，生長到一定程度形成花芽，牡丹品種的花芽分化一般始于6月上旬，結(jié)束于9月下旬至10月中旬；賀丹等[5]研究結(jié)果顯示，牡丹品種‘鳳丹’花芽分化開始于6月初，結(jié)束于9月中旬，總共100 d左右；董曉曉等[6]通過蒽酮比色法測定發(fā)現(xiàn)，牡丹花芽分化過程中葉片可溶性糖含量的變化為先升高后下降，而淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)剛開始保持平穩(wěn)，8月初開始下降。

花芽分化是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的重要標(biāo)志，包含著許多復(fù)雜的化學(xué)變化，內(nèi)源激素的變化是花芽分化的關(guān)鍵[7]。前人研究表明，GA3能夠抑制果樹的花芽分化，ABA、CTK和乙烯能加快花芽分化，而IAA對花芽分化的作用不太一致[8]；果樹成花取決于多種激素之間的一種平衡關(guān)系[9]，高CTK/GAs比值有益于開花[10]。目前，國內(nèi)外對紫斑牡丹的形態(tài)解剖學(xué)、組織培養(yǎng)和細(xì)胞學(xué)等方面的研究已有一些報道，但對同株紫斑牡丹單、重瓣兩種不同花型的花瓣形態(tài)結(jié)構(gòu)、花芽分化及分化過程中內(nèi)源激素含量變化的研究較少。為進(jìn)一步認(rèn)識紫斑牡丹成花機制，本研究通過調(diào)查同株紫斑牡丹‘關(guān)公紅’不同花型的開花期，對比同株紫斑牡丹單、重瓣花型的花器官形態(tài)分化差異，測定其花芽分化各個時期內(nèi)源激素的含量，并分析內(nèi)源激素變化與不同花型的關(guān)系，為同株紫斑牡丹不同花型開花的化學(xué)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本試驗于2020年6月上旬至2021年1月中旬進(jìn)行，選取于甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝牡丹園生長健壯、花枝發(fā)育良好的同株紫斑牡丹‘關(guān)公紅’品種為研究材料。

1.2 實驗方法

2020年6月上旬至下旬，觀察并調(diào)查紫斑牡丹單、重瓣花型的開花期，選取成熟單瓣、重瓣的花瓣在專用電鏡固定液中固定，后經(jīng)梯度脫水干燥，經(jīng)MSP-1S型離子濺射儀噴金后，于型號為S-3400N掃描電鏡下觀察拍攝花瓣的超微結(jié)構(gòu)。

2020年7月上旬至10月下旬，每10～15 d剪取適量紫斑牡丹花芽，帶回實驗室。通過石蠟切片觀察花芽分化的材料剝除外層芽鱗，用FAA固定，固定72 h后脫水包埋，切片機切片，切片厚度8～10 μm，番紅-固綠染色，中性樹膠封片，切片在顯微鏡下觀察并拍照；用于測定內(nèi)源激素的材料裝冰盒帶回實驗室，各分3次稱取 ‘關(guān)公紅’單瓣、重瓣花芽，每次0.5 g，用錫箔紙包好，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法(ELISA)測定花芽分化期生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)等4種內(nèi)源激素的含量。所使用的試劑盒選購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，依照說明書進(jìn)行相應(yīng)的操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和匯總，采用SPSS和Origin 2019統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和作圖，單因素方差分析采用Anova分析法，檢驗水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單瓣和半重瓣紫斑牡丹花器官形態(tài)學(xué)比較

通過花期調(diào)查可知，‘關(guān)公紅’花紫紅色，花藥多，花絲粉色或紅色，基部色斑大，黑色，斑緣輻射狀，花瓣內(nèi)側(cè)斑塊形狀為卵形。其中，‘關(guān)公紅’單瓣花朵在6月2日進(jìn)入初花期，6月10日進(jìn)入盛花期，6月23日進(jìn)入末花期，花期為21 d左右；在盛花期所測得單瓣花花徑在123.61～127.34 mm之間(圖1，a)，花瓣數(shù)10，雄蕊多，內(nèi)側(cè)斑塊的白色中肋明顯(圖1，c)?！P(guān)公紅’重瓣花朵在6月11日進(jìn)入初花期，6月17日進(jìn)入盛花期，6月26日進(jìn)入末花期，花期為15 d左右；在盛花期所測得重瓣花花徑在135.06～139.34 mm之間(圖1，b),花瓣總數(shù)21，瓣化花瓣數(shù)11，雄蕊較多，內(nèi)側(cè)斑塊沒有白色中肋(圖1，d)。進(jìn)一步比較‘關(guān)公紅’單瓣花瓣和重瓣花瓣表面形態(tài)超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，正常花瓣表皮細(xì)胞表面光滑平整無明顯褶皺(圖1，e)，而‘關(guān)公紅’瓣化花瓣的表皮細(xì)胞表面有明顯的褶皺(圖1，f)。

2.2 單瓣和重瓣紫斑牡丹花芽形態(tài)分化比較

牡丹花芽為混合芽，試驗觀察結(jié)果表明，紫斑牡丹‘關(guān)公紅’單、重瓣花朵的花芽分化順序均可分為6個時期，即花芽分化初期、苞片原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期，但重瓣花朵的分化時期始終早于單瓣花朵(圖2)。其中，紫斑牡丹在花芽分化初期主要是葉原基的形態(tài)分化，頂端生長點逐漸向上凸起(圖2，a)，葉原基在生長點周圍呈螺旋狀。根據(jù)生長點的狀態(tài)來看，‘關(guān)公紅’重瓣花芽分化要早于單瓣(圖2，a、g)；在苞片原基分化期時，生長點慢慢下凹，逐漸變平變大，在其四周形成苞片原基，代表著花芽分化由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變(圖2，b、h)；重瓣花朵苞片原基分化始于7月28日，單瓣花朵在8月2日開始分化苞片原基。在萼片原基分化期，花芽的頂端生長點更加下凹，在苞片原基內(nèi)部形成萼片原基，萼片原基呈指狀(圖2，c、i)。重瓣花(8月15日)也比單瓣花(8月20日)更早進(jìn)入萼片原基分化期。之后，花芽的頂端生長點進(jìn)一步下凹，沿托盤內(nèi)側(cè)產(chǎn)生花瓣原基，外輪大，內(nèi)輪小，呈現(xiàn)圓形(圖2，d、j)。重瓣花花瓣原基分化始于8月28日，單瓣花朵在9月8日開始分化花瓣原基，且重瓣花形成的花瓣原基比單瓣花大。此后生長點進(jìn)一步下凹，變深，產(chǎn)生若干顆粒狀突起，從而形成雄蕊原基，此時為雄蕊原基分化期(圖2，e、k)。重瓣花雄蕊原基分化始于9月12日，單瓣花朵為9月26日。與單瓣花相比，重瓣紫斑牡丹的雄蕊原基彼此分離且存在異化；雄蕊原基在不斷生長，在花托盤底部出現(xiàn)較大的圓形突起，形成雌蕊原基(圖2，f、l)。重瓣花雌蕊原基分化始于9月28日，而單瓣花朵在10月5日進(jìn)入雌蕊原基分化期。

2.3 同株紫斑牡丹單、重瓣花朵花芽形態(tài)分化期內(nèi)源激素含量的變化

測定結(jié)果(圖3)顯示，在紫斑牡丹花芽分化過程中，單、重瓣花朵花芽中IAA和ABA含量遠(yuǎn)高于GA3和ZR的含量，各激素含量隨著花芽分化時期的變化趨勢不盡相同。

首先，同株紫斑牡丹單瓣和重瓣花芽中GA3含量較低，在花芽分化初期，單瓣花芽中GA3含量又低于重瓣花芽；隨著花器官的不斷發(fā)育，單瓣花芽中GA3含量在萼片原基形成時顯著增加(P<0.05)，表現(xiàn)為先升后降再升的變化趨勢，并分別在萼片原基分化期和雌蕊原基分化期達(dá)到峰值，且顯著高于其他時期；同時，重瓣花芽中GA3含量表現(xiàn)出先降后升的變化趨勢，在花瓣原基分化期GA3含量最低，而后顯著上升，在雄蕊原基形成時達(dá)到最高值(圖3，A)。由此可推測低濃度的GA3有利于單瓣、重瓣紫斑牡丹花芽分化的啟動，GA3含量的增加有利于單瓣花原基分化。

其次，圖3，B顯示，同株紫斑牡丹單、重瓣花芽中IAA的含量在花芽分化初期都處于較高水平，分別達(dá)到220和130 ng/g，而單瓣花芽明顯高于重瓣花芽；隨著花芽分化的啟動，重瓣紫斑牡丹IAA的含量開始緩慢減少，在花瓣原基形成時IAA的含量達(dá)到最小值；而單瓣紫斑牡丹的IAA含量顯著下降(P<0.05)，在苞片原基形成時出現(xiàn)最低值70 ng/g，這表明較低濃度的IAA有利于紫斑牡丹花芽分化。

再次，在紫斑牡丹花芽分化初期，單瓣、重瓣花芽中ABA含量分別為130和150 ng/g，隨著苞片原基的形成，單瓣花的花芽中ABA含量顯著下降(P<0.05)。在花瓣原基形成時重瓣紫斑牡丹花芽的內(nèi)源ABA含量最高，最高濃度達(dá)到190 ng/g(P<0.05)，說明高濃度的ABA可能促進(jìn)紫斑牡丹重瓣花原基的形成；紫斑牡丹單瓣花朵的內(nèi)源ABA濃度在苞片原基形成時降到最低值(60 ng/g)，之后又開始回升(圖3，C)。

另外，紫斑牡丹單瓣、重瓣花朵的花芽內(nèi)源ZR含量水平都比較低，但隨著花芽分化的進(jìn)行，單瓣紫斑牡丹花芽的內(nèi)源ZR含量先不斷下降，在苞片原基分化期出現(xiàn)最低值(6 ng/g)，然后不斷升高，在萼片原基形成時達(dá)到最大值(12 ng/g)；重瓣紫斑牡丹花芽的內(nèi)源ZR含量不斷在增加，于花瓣原基形成時達(dá)到最大值(17 ng/g)，隨后在雄蕊原基分化期與雌蕊原基分化期ZR含量小幅下降(圖3，D)。

2.4 同株紫斑牡丹單、重瓣花朵花芽形態(tài)分化期內(nèi)源激素比值變化

花芽分化是多種激素相互作用、綜合調(diào)控的結(jié)果，分析花芽形態(tài)分化期內(nèi)源激素比值變化趨勢有重要意義。首先，在紫斑牡丹花芽生長錐形成時，由于花芽中的IAA含量很高，ZR含量很低，花芽中的ZR/IAA的值比較低。隨著花器官的進(jìn)一步分化，重瓣‘關(guān)公紅’花朵ZR/IAA呈上升趨勢，在花瓣原基形成時達(dá)到最大值；而單瓣‘關(guān)公紅’花瓣ZR/IAA的變化趨勢呈先上升再下降最后上升的趨勢，在花芽分化初期達(dá)到最低值(圖4，a)。其次，單瓣‘關(guān)公紅’花朵ZR/GA3值在花芽分化初期達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢，在萼片原基形成時達(dá)到最小值，隨后又緩慢增加，于雄蕊原基分化期又出現(xiàn)一個小峰值，隨后又開始下降；而重瓣‘關(guān)公紅’花朵ZR/ GA3值在苞片原基分化期急劇增長，于萼片原基形成時達(dá)到最大值(圖4，b)。由此推測提高ZR/ GA3值有利于重瓣‘關(guān)公紅’花芽分化。再次，由于單瓣‘關(guān)公紅’花芽中ABA含量在苞片原基分化期減少，所以ABA/GA3值急劇下降，隨后又開始緩慢增加，在雄蕊原基形成時達(dá)到一個小峰值后又開始緩慢下降；而重瓣‘關(guān)公紅’花芽中ABA/GA3值先不斷增加，在花瓣原基分化期達(dá)到最大值(圖4，c)。由于重瓣‘關(guān)公紅’花芽在雄蕊原基形成時GA3的含量急劇上升，所以ABA/GA3比值最低，說明較低ABA/GA3值能促進(jìn)紫斑牡丹‘關(guān)公紅’重瓣花雄蕊原基的形成。此外，單瓣和重瓣‘關(guān)公紅’花芽中ABA/IAA的變化趨勢類似，均在花芽分化初期處于較低水平，后隨著花芽不斷地分化都開始增加。單瓣和重瓣花花芽的ABA/IAA值分別在萼片原基形成時和花瓣原基分化期先后出現(xiàn)最大值，它們在達(dá)到峰值之后均開始下降(圖4，d)。另外， ‘關(guān)公紅’花芽中(GA3+IAA+ZR)/ABA值總體表現(xiàn)為單瓣花高于重瓣花；單瓣花(GA3+IAA+ZR)/ABA比值在花芽分化初期達(dá)到最大，后隨著花芽不斷分化開始下降；而在重瓣花朵花芽中(GA3+IAA+ZR)/ABA比值基本趨于平穩(wěn)狀態(tài)，在花瓣原基形成時達(dá)到最小值(圖4，e)。說明重瓣花在花瓣原基形成時消耗大量的GA3和IAA，(GA3+IAA+ZR)/ABA比值降低有利于重瓣花的花瓣原基形成。最后，單瓣‘關(guān)公紅’花芽啟動分化后，其花芽GA3含量顯著增加，因而其 (IAA+ZR)/GA3比值在分化初期急劇下降，并且達(dá)到最小值，隨后開始緩慢增加；重瓣‘關(guān)公紅’花芽在雄蕊原基形成時(IAA+ZR)/GA3比值達(dá)到最小值，由此推測重瓣花在雄蕊原基分化期消耗更多的內(nèi)源IAA和ZR(圖4，f)。

3 討 論

3.1 單、重瓣紫斑牡丹花器官比較

前人研究中發(fā)現(xiàn)影響花瓣表皮細(xì)胞性狀的重要因素為花瓣材質(zhì)[11]，如蝴蝶蘭花瓣的材質(zhì)不同，其表皮細(xì)胞形態(tài)也有差異[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫斑牡丹花瓣的表面細(xì)胞排列致密，內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈狹長形，正常花瓣表皮細(xì)胞表面光滑平整無明顯褶皺，而重瓣花瓣化花瓣的表皮形態(tài)有明顯的褶皺，造成不同的原因可能是重瓣‘關(guān)公紅’瓣化的花瓣是由雄蕊變異而來，跟正?；ò陙碓床煌?、材質(zhì)不同。紫斑牡丹花芽分化是有花植物生長發(fā)育重要階段，研究牡丹花芽分化機理對牡丹栽培與花期調(diào)控具有重要意義。在本研究中，不管是紫斑牡丹單瓣花朵還是重瓣花朵，都依次經(jīng)歷了花芽分化初期、苞片原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期，不同花型的紫斑牡丹分化時間及花器官結(jié)構(gòu)存在一定的差異。重瓣花有較多的瓣化雄蕊，所以花瓣較多，演化程度較高，但重瓣花的花芽分化時間明顯早于單瓣紫斑牡丹，花瓣原基的體積也明顯增大。與單瓣花相比，重瓣紫斑牡丹的雄蕊原基彼此分離且存在異化，這可能與重瓣花中雄蕊瓣化有關(guān)系。此外，紫斑牡丹花芽分化是一個非常復(fù)雜的過程，花芽分化的形態(tài)規(guī)律不僅取決于紫斑牡丹自身的遺傳特性，而且還會受到外界環(huán)境的影響。

3.2 內(nèi)源激素對紫斑牡丹單、重瓣花朵的花芽分化的調(diào)控

植物花芽分化與體內(nèi)各類激素水平密切相關(guān)，不同階段激素水平及激素平衡對植物成花和花序構(gòu)建起重要作用[14]。研究表明，植物激素通過調(diào)控核酸、蛋白質(zhì)、酶活性等代謝過程進(jìn)而調(diào)控花芽分化。赤霉素對花芽分化的作用比較復(fù)雜，高濃度的GA3可有效解除牡丹芽的休眠[15]。在擬南芥中，GA突變體的GA合成過程及信號傳導(dǎo)受到影響，使得開花延遲[16]。前人研究表明GA3是一種抑制類激素[17-20]，GA3對葡萄、蘋果、梨子、荔枝等的花芽分化具有抑制作用[21]。艾軍等[22]研究進(jìn)一步表明，較高濃度的赤霉素對五味子的花芽分化具有促雄抑雌的作用，再次證明赤霉素在花芽分化中的復(fù)雜性。在本研究的花芽分化過程中，同株紫斑牡丹單、重瓣花芽中GA3的含量都比較低，說明較低濃度的GA3能夠促進(jìn)單、重瓣紫斑牡丹的花芽分化。

同時，IAA是影響植物成花的重要激素之一，但關(guān)于IAA與植物成花的關(guān)系一直存在爭議。有觀點認(rèn)為IAA可以抑制花芽分化，在大櫻桃的研究中發(fā)現(xiàn)，IAA含量在花芽分化初期較低，花芽分化后期有所增加，并且花芽中IAA的濃度低于葉芽，所以認(rèn)為IAA抑制花芽分化[16]；同時，勒杜鵑在開花之前必需較低濃度的IAA[23]。也有研究表明，生長素對花芽分化的影響并非生長素本身所起的作用，而是通過結(jié)合其他內(nèi)源激素共同影響花芽分化進(jìn)程。本研究中，內(nèi)源激素IAA在兩種花型紫斑牡丹花芽分化初期均大量積累；之后，單瓣花芽中的IAA含量在苞片原基形成時顯著下降，而在花芽分化后期含量逐漸上升，推測與IAA在花芽分化不同階段作用不同有關(guān)，同時說明單瓣花苞片原基形成時無需更多的IAA；重瓣‘關(guān)公紅’花芽中IAA含量在此過程中則呈緩慢下降趨勢，并保持在較低水平，在花瓣原基分化期達(dá)到最低值。

ABA是一種促進(jìn)成花的內(nèi)源激素，前人發(fā)現(xiàn)ABA能打破百合鱗莖休眠，啟動花芽分化[24]；李雯琪等[25]也報道，較高濃度的ABA有利于單重瓣榆葉梅花芽分化。本實驗發(fā)現(xiàn)，單瓣和重瓣‘關(guān)公紅’花瓣ABA含量在花芽分化初期都比較高，單瓣‘關(guān)公紅’ABA含量在萼片原基形成時有所下降，而在花瓣原基分化期顯著提高；重瓣‘關(guān)公紅’ABA含量在整個花芽分化過程中都保持較高水平，證明在花芽分化過程中ABA的積累有利于紫斑牡丹重瓣花朵的花芽分化。另外，重瓣‘關(guān)公紅’ABA含量在花瓣原基分化期達(dá)到最大值，此時重瓣花的花瓣原基較單瓣花的大，又說明高濃度的ABA能更加促進(jìn)重瓣花原基的發(fā)育。

ZR是植物內(nèi)存在的一種細(xì)胞分裂素，主要產(chǎn)生于植物根部，促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)在植物體內(nèi)的積累。前人研究表明，高水平的ZR能夠促進(jìn)陸地棉成花誘導(dǎo)[26]、野生萱草花器官組織生長[27]以及膏桐花梗、花柄和小花的伸長[28]。ZR對植物花芽分化起促進(jìn)作用，如花芽生理分化期高濃度的ZR有利于大櫻桃花芽的形成[16]。在本實驗中，單瓣和重瓣‘關(guān)公紅’花瓣的ZR含量在花芽分化過程中均也不斷升高，說明ZR含量的增加有助于紫斑牡丹的花芽分化。

3.3 多種激素平衡對單、重瓣紫斑牡丹花芽分化的影響

有關(guān)內(nèi)源激素與植物分化的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，激素間平衡也起到促進(jìn)成花或抑制成花的重要調(diào)控作用[29-30]。有研究表明，ABA/IAA、ABA/GA3值降低和GA3/IAA值升高，有利于花芽從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變[31-33]，ZR/GA3值升高可促進(jìn)花芽形態(tài)分化和花粉粒的形成[34]。曹尚銀等研究表明，在蘋果花芽分化中，提高ABA/IAA、ZR/IAA、ZR/GA3的比值，有利于蘋果成花率的提高[35]。前人在研究不同木本植物花芽分化發(fā)現(xiàn)，較高的ABA/IAA、ZR/IAA、ABA/GA3比值有利于花芽分化的進(jìn)行[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，較高的ZR/IAA、ABA/IAA比值對單瓣、重瓣花紫斑牡丹的花芽分化均有促進(jìn)作用；提高ZR/GA3、ABA/GA3比值對重瓣花的花芽分化亦有促進(jìn)作用；紫斑牡丹重瓣花的花芽中(GA3+IAA+ZR)/ABA比值在花瓣原基分化期顯著下降，該比值的降低可能促進(jìn)花瓣原基形成，而(IAA+ZR)/GA3比值減小則有利于重瓣花雄蕊原基的形成。