刺葡萄白藜蘆醇合成酶基因?qū)Σ煌赓|(zhì)的響應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子篩選

賴恭梯，闕秋霞，賴譜富，高慧穎，王 琦，賴呈純*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003；2 福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003)

芪類化合物是植物生物和非生物脅迫下產(chǎn)生的一種植保素，白藜蘆醇(resveratrol，Res)又稱芪三酚，是天然芪類化合物的代表，化學(xué)名稱為3,4′,5-三羥基二苯乙烯，白藜蘆醇有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及心血管保護(hù)等作用[1-4]。白藜蘆醇和類黃酮生物合成途徑均源于苯丙烷類代謝途徑，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)作用下生成肉桂酸，再通過(guò)肉桂酸-4-羥化酶(C4H)作用下生成4-香豆酸，隨后在香豆酰CoA連接酶(4CL)作用下生成4-香豆酰CoA和丙二酰CoA，最后在芪合酶(STS)和查爾酮合成酶(CHS)催化下分別進(jìn)入白藜蘆醇和類黃酮合成代謝途徑[5-6]。STS與CHS同屬于聚酮化合物合酶(PKS)超家族，因此STS與CHS同源性高，同時(shí)STS和CHS的催化功能具有一定的可變性[7]。STS是芪類化合物生物合成的關(guān)鍵酶，根據(jù)作用的底物及生成的產(chǎn)物不同可將其分為2類，一類是以肉桂酰輔酶A為底物生成銀松素的銀松素合成酶(pinosylvin synthase, PS)，PS主要存在于裸蕨植物中；另一類是以4-香豆酰輔酶A為底物生成白藜蘆醇的白藜蘆醇合成酶(resveratrol synthase, RS)[8]，RS僅存在于葡萄、花生、藜蘆等有限植物中[9]。

從植物中提取的白藜蘆醇安全可靠，但是受植物材料限制、前處理復(fù)雜、提取效率低、成本高，而通過(guò)離體細(xì)胞培養(yǎng)可避免天然植物提取所面臨的瓶頸。細(xì)胞工程結(jié)合基因工程在遺傳改良上的應(yīng)用，可針對(duì)某一特定代謝產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)行植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)研究。柳忠玉[10]將虎杖PcRS基因轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PcRS能夠促進(jìn)白藜蘆醇的合成，白藜蘆醇的合成積累受PcRS的表達(dá)和底物濃度的共同調(diào)控。張宇[11]研究了葡萄白藜蘆醇代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)及其調(diào)控的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)葡萄STS基因受多種生物和非生物誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)與多種不同信號(hào)途徑基因有較高的相關(guān)性。由于STS與CHS之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致葡萄果皮中白藜蘆醇含量與花色苷含量呈負(fù)相關(guān)[12]?；ㄉ张c白藜蘆醇的關(guān)系并不固定，而是處在動(dòng)態(tài)變化中[6]。轉(zhuǎn)錄因子是植物代謝產(chǎn)物生物合成的重要調(diào)控因子，能夠調(diào)控白藜蘆醇等代謝產(chǎn)物合成途徑中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[13-16]。因此，通過(guò)調(diào)控STS或RS表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)RS基因在底物利用中的競(jìng)爭(zhēng)力，進(jìn)而調(diào)節(jié)白藜蘆醇的合成和積累。此外，環(huán)境因素對(duì)RS的表達(dá)也具有重要的影響作用，光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因子，其中光質(zhì)能夠調(diào)控白藜蘆醇等次生代謝產(chǎn)物的合成及其合成代謝基因的表達(dá)[17]，因此光質(zhì)的篩選及其作用機(jī)理是葡萄白藜蘆醇光響應(yīng)研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)從刺葡萄中克隆RS1基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，對(duì)靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)刺葡萄愈傷組織進(jìn)行不同光質(zhì)培養(yǎng)處理，研究RS1及其候選轉(zhuǎn)錄因子基因在不同光質(zhì)下的表達(dá)，以明確RS1的表達(dá)模式及其轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特征，為細(xì)胞工程白藜蘆醇高效生產(chǎn)和白藜蘆醇生物合成分子調(diào)控機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)條件

刺葡萄愈傷組織細(xì)胞系為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所營(yíng)養(yǎng)科學(xué)與工程研究室繼代保存，對(duì)愈傷組織進(jìn)行不同光質(zhì)培養(yǎng)處理，光質(zhì)類型包括紫光、藍(lán)光、綠光、黃光、紅光、白光、暖白光和暖黃光，通過(guò)LED提供光源，采用HIPoint HR350光譜分析儀(中國(guó)臺(tái)灣)測(cè)定光照強(qiáng)度和波長(zhǎng)峰值，通過(guò)調(diào)整LED燈數(shù)量，使不同可見(jiàn)光質(zhì)的光強(qiáng)盡可能處于2 000 Lx。每個(gè)處理的愈傷組織接種5瓶，每瓶接種6個(gè)細(xì)胞團(tuán)，每團(tuán)約0.05 g，3次重復(fù)。培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg/L 2,4-D + 3%蔗糖 + 0.6%瓊脂(pH 5.8)，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光周期為12 h光照/12 h黑暗。

1.2 方 法

1.2.1 刺葡萄RS基因克隆與分析以刺葡萄愈傷組織為材料，總RNA提取采用北京天根提供的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，cDNA合成采用北京全式金提供的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以葡萄基因組數(shù)據(jù)和NCBI已經(jīng)登錄的RS基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物用于RS基因克隆，引物信息見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、切膠回收、連接克隆載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌落PCR，最后委托白鯨生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證正確的序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2RS1基因生物信息學(xué)分析通過(guò)Gene Structure Display Server 2.0、ProtParam、SignalP-5.0、NetPhos、SWISS-MODEL、CELLO、WoLFPSORT、iPSORT在線軟件，進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、信號(hào)肽、磷酸化、蛋白質(zhì)三維模型、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析；采用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)和MEME進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和保守基序預(yù)測(cè)；采用Mega5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建；提取RS1基因起始密碼子上游2 000 bp序列，采用PlantCARE在線軟件進(jìn)行RS1啟動(dòng)子順式作用元件分析。

1.2.3 靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和共線性分析以RS1啟動(dòng)子序列，通過(guò)PlantTFDB在線軟件進(jìn)行靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)；從EnsemblPlants下載葡萄、擬南芥、水稻和毛果楊的基因組及其注釋數(shù)據(jù)，通過(guò)TBtools軟件構(gòu)建靶向葡萄RS1的轉(zhuǎn)錄因子基因與其他物種的基因共線圖譜，并篩選出關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子候選成員進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4RS1及其轉(zhuǎn)錄因子在不同光質(zhì)下的表達(dá)模式刺葡萄愈傷組織于不同光質(zhì)下培養(yǎng)，總RNA提取同1.2.1，cDNA合成和熒光定量PCR采用寶生物工程有限公司提供的PrimeScriptMTRT reagent Kit和TB Green?Premix Ex TaqMT，定量PCR引物經(jīng)NCBI-Primer-BLAS進(jìn)行特異性驗(yàn)證(表1)，試驗(yàn)于Roche LightCycler 480中進(jìn)行，通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平分析明確RS1在不同光質(zhì)下的表達(dá)模式，并驗(yàn)證候選轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控特征。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理熒光定量PCR基因表達(dá)水平計(jì)算采用雙內(nèi)參基因分析方法，雙內(nèi)參基因?yàn)棣?Tublin和60SRP[18-19]。數(shù)據(jù)分析和作圖采用Excel和GraphPad Prism 8進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺葡萄RS1基因克隆與序列分析

從刺葡萄愈傷組織中克隆到RS1基因，將其命名為VdRS1，序列信息提交到GenBank，登錄號(hào)為OM339527，基因序列長(zhǎng)度為1 206 bp，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成(圖1，A)，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 179 bp，編碼392個(gè)氨基酸，分子量為42.9 kD，理論等電點(diǎn)為5.97，為親水性無(wú)信號(hào)肽蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì)定位蛋白，NetPhos預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)27個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾(圖1，B)，其中13個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，11個(gè)絲氨酸位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，因此磷酸化修飾主要發(fā)生于蘇氨酸和絲氨酸位點(diǎn)上。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)模型見(jiàn)圖1，C、D，該蛋白主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成。

2.2 啟動(dòng)子順式作用元件分析

啟動(dòng)子是下游基因表達(dá)的開(kāi)關(guān)，因此啟動(dòng)子的活性及作用是參與基因表達(dá)的關(guān)鍵因素，通過(guò)PlantCARE對(duì)RS1基因上游啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，除了具有啟動(dòng)子基礎(chǔ)元件如CAAT-box、TATA-box等還具有其他多種啟動(dòng)子順式作用元件(圖2，A)。RS1啟動(dòng)子上分布最多的為參與光響應(yīng)的順式作用元件，數(shù)量達(dá)到20個(gè)；其次為2類轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合元件，分別為MYB和MYC識(shí)別和結(jié)合元件，數(shù)量均為6個(gè)；第三類為激素響應(yīng)元件，包括茉莉酸甲脂和生長(zhǎng)素，均為2個(gè)；此外還有參與防御與脅迫、低溫和胚乳表達(dá)響應(yīng)的元件各1個(gè)(圖2，B)。綜上，RS1的啟動(dòng)子可能主要參與了葡萄光響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別與結(jié)合、激素調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境條件響應(yīng)，其中具有多個(gè)光響應(yīng)、MYB和MYC識(shí)別和結(jié)合元件。

2.3 靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子分析

靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子及其在啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖3，A；表2)顯示：具有23個(gè)靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子，MYB及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子8個(gè)、Dof 轉(zhuǎn)錄因子6個(gè)、BBR-BPC和C2H2轉(zhuǎn)錄因子各2個(gè)，AP2、MIKC_MADS、GRAS、Trihelix和WRKY各1個(gè)。轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和保守基序(圖3，B—E)，其中6個(gè)MYB含有3種motif的被聚為一類，而另外2個(gè)MYB僅有motif1自成一類，因此上述8個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子可劃分為2個(gè)類別。轉(zhuǎn)錄因子Dof雖然也預(yù)測(cè)獲得3個(gè)保守基序，但是E值顯示Motif2和Motif3并不顯著，因此Dof具有非常保守的Motif1基序，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示6個(gè)Dof相似性較高。

進(jìn)一步挖掘轉(zhuǎn)錄因子的基因信息，結(jié)果(表2)顯示，23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因分布于葡萄19對(duì)染色體中的15對(duì)，14個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因位于正鏈，另外9個(gè)位于負(fù)鏈，不同家族間的基因長(zhǎng)度差異較大，ORF長(zhǎng)度介于480～1 773 bp之間，平均為892 bp。預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子在RS1的啟動(dòng)子上具有多達(dá)93個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，MYB、Dof和BBR-BPC分別具有11、30和8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，雖然靶向RS1的AP2和MIKC_MADS均只有1個(gè)，但是其結(jié)合位點(diǎn)分別達(dá)到了18和19個(gè)，因此MYB、Dof、BBR-BPC、AP2和MIKC_MADS可能在RS1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

表2 靶向RS1的轉(zhuǎn)錄因子基因信息Table 2 Information of transcription factor genes targeting at RS1

2.4 轉(zhuǎn)錄因子基因共線性分析

以葡萄、擬南芥、水稻和毛果楊的基因組及其注釋數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，靶向葡萄RS1的23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因中有18個(gè)成員在其他物種中具有共線基因(圖4，A、B)，在擬南芥、水稻和毛果楊中的共線基因分別為29、15和44個(gè)，因此葡萄轉(zhuǎn)錄因子與毛果楊具有較高的共線性，其次為擬南芥，而與單子葉禾本科的水稻基因共線性最低。由圖4，B可知，具有共線性的18個(gè)靶向葡萄RS1的轉(zhuǎn)錄因子分布于葡萄19對(duì)染色體中的13對(duì)，染色體8號(hào)、1號(hào)和17號(hào)上的轉(zhuǎn)錄因子具有較多共線基因，分別達(dá)到22、13和11個(gè)。進(jìn)一步對(duì)染色體上的共線基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)位于8號(hào)染色體上的MYB-DIV(VIT_08s0007g01920)和Dof5.1 (VIT_08s0007g00180)，以及位于1號(hào)染色體上的BBR-BPC1-like (VIT_01s0011g06380)分別具有11、9和9個(gè)共線基因，并且在其他每個(gè)物種中的共線基因達(dá)2～5個(gè)，因此上述3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在不同物種間的共線性高，功能保守。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4，C-E)顯示，MYB-IDV具有SANT和MYB保守結(jié)構(gòu)域，Dof5.1具有zf-Dof保守結(jié)構(gòu)域，BBR-BPC1-like具有GAGA保守結(jié)構(gòu)域，基因結(jié)構(gòu)特征顯示MYB-DIV基因具有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，而Dof5.1和BBR-BPC1-like均具3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。分析表明，MYB-DIV、Dof5.1和BBR-BPC1-like轉(zhuǎn)錄因子具有多個(gè)RS1啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，而且在不同物種間共線性高、功能保守，推測(cè)其在白藜蘆醇生物合成過(guò)程中參與RS1的表達(dá)調(diào)控。

2.5 RS1及其轉(zhuǎn)錄因子在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)模式

RS1啟動(dòng)子具有大量光響應(yīng)元件，推測(cè)RS1可能受光調(diào)控表達(dá)，通過(guò)不同光質(zhì)處理進(jìn)一步揭示RS1的表達(dá)特征，并驗(yàn)證候選轉(zhuǎn)錄因子基因(MYB-DIV、Dof5.1和BBR-BPC1-like)的表達(dá)模式。轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果見(jiàn)圖5，短波光(紫光、藍(lán)光、綠光)處理下，RS1的表達(dá)水平總體低于長(zhǎng)波光(黃光、紅光)和混合光質(zhì)(白光、暖白光和暖黃光)處理，當(dāng)培養(yǎng)45 d時(shí)，紅光和白光下RS1的表達(dá)水平較低，可能由于白光主峰波的波長(zhǎng)為短波光在此時(shí)起主導(dǎo)作用。RS1與MYB-DIV基因在7種光質(zhì)下具有相同的表達(dá)特征(表3)，僅在暖白光下的表達(dá)模式不同，分別呈先升后降和下調(diào)表達(dá)模式。RS1和MYB-DIV在紫光下呈上調(diào)表達(dá)，在藍(lán)光和綠光下呈先降后升，二者在3種短波光下總體呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在長(zhǎng)波光的黃光和紅光下，其表達(dá)模式呈先升后降，在混合光質(zhì)白光和暖黃光下分別呈下調(diào)和上調(diào)表達(dá)。RS1和MYB-DIV的表達(dá)模式總體相同，在短波和長(zhǎng)波光質(zhì)下總體呈上調(diào)和先升后降的變化，因此，MYB-DIV在RS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起正調(diào)控作用。

靶向RS1的另一轉(zhuǎn)錄因子基因Dof5.1與RS1總體呈相反的表達(dá)模式(表3，圖5)，短波光下Dof5.1的表達(dá)水平高于RS1，在長(zhǎng)波光質(zhì)下Dof5.1總體呈上調(diào)表達(dá)，在混合光質(zhì)暖白光和暖黃光下亦呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)模式，可能是由于該兩種混合光質(zhì)的主波峰為長(zhǎng)波特性，因此長(zhǎng)波光起主導(dǎo)作用。雖然Dof5.1基因與RS1在紫光和暖黃光下亦為上調(diào)表達(dá)，但是在紫光下上調(diào)幅度較小，趨于平緩狀態(tài)；而在暖黃光下，Dof5.1表現(xiàn)為培養(yǎng)后期急劇上調(diào)，而RS1的表達(dá)呈培養(yǎng)前期上調(diào)。由于Dof5.1與RS1的表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)，因此，Dof5.1在RS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起負(fù)調(diào)控作用。此外，通過(guò)3對(duì)特異引物對(duì)BBR-BPC1-like基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，均未采集到擴(kuò)增信號(hào)。綜上，轉(zhuǎn)錄因子MYB-DIV和Dof5.1分別通過(guò)正負(fù)效應(yīng)調(diào)控RS1的表達(dá)參與刺葡萄白藜蘆醇的生物合成。

表3 光質(zhì)類型及基因表達(dá)模式Table 3 Types of light quality and gene expression pattern

3 討 論

3.1 長(zhǎng)波光質(zhì)促進(jìn)刺葡萄RS1的高表達(dá)

光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成積累過(guò)程中最重要的環(huán)境因素之一[20]，不同植物不同組織及其基因?qū)赓|(zhì)的響應(yīng)效應(yīng)不同，張真認(rèn)為最有利于提高葡萄白藜蘆醇的含量和產(chǎn)量的光質(zhì)依次為：白光、黃光、紅光、藍(lán)光和綠光[21]，其結(jié)果表明長(zhǎng)波光利于白藜蘆醇的合成積累。也有研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光明顯促進(jìn)‘黑比諾’葡萄愈傷組織白藜蘆醇的含量和產(chǎn)量，而紅光不利于白藜蘆醇的積累[22]。在虎杖中，黃光和綠光均有利于愈傷組織的增殖，但是藍(lán)光有利于白藜蘆醇的積累[23]。白藜蘆醇合成及其基因的表達(dá)具有物種特異性，此外，紫外線UV-C也被認(rèn)為在白藜蘆醇的合成積累中具有強(qiáng)誘導(dǎo)作用，通過(guò)誘導(dǎo)PAL、C4H、4CL和STS的上調(diào)表達(dá)，同時(shí)抑制CHS，從而促進(jìn)白藜蘆醇的合成[24]。

本研究結(jié)果表明，短波光質(zhì)包括紫光、藍(lán)光和綠光處理下的RS1的表達(dá)水平顯著低于長(zhǎng)波光質(zhì)的黃光和紅光以及混合光質(zhì)的白光、暖白光和暖黃光，因此長(zhǎng)波光促進(jìn)RS1的表達(dá)，以上結(jié)果間接說(shuō)明長(zhǎng)波光有利于白藜蘆醇的生物合成。光質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝積累具有不同的效應(yīng)[21]，因此應(yīng)該根據(jù)不同植物不同組織器官的特性，在不同階段選擇適宜的光質(zhì)培養(yǎng)。葡萄細(xì)胞工程生產(chǎn)白藜蘆醇應(yīng)首先進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，此階段宜選擇促進(jìn)愈傷組織增殖的光質(zhì)類型，以獲得充足的提取原料；其次，篩選出白藜蘆醇積累的最佳光質(zhì)和時(shí)間，進(jìn)行白藜蘆醇合成和積累培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究RS1在不同光質(zhì)下的表達(dá)模式，提出長(zhǎng)波光促進(jìn)刺葡萄RS1的表達(dá)，為建立一套葡萄愈傷組織白藜蘆醇生產(chǎn)的最佳光質(zhì)培養(yǎng)方案提供理論基礎(chǔ)。

3.2 MYB-DIV和Dof5.1通過(guò)正負(fù)調(diào)控參與RS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子的順式作用元件，調(diào)控下游基因的表達(dá)。本研究通過(guò)啟動(dòng)子順式作用元件分析、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和基因共線性比對(duì)，篩選出靶向RS1的3個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子，分別是MYB-DIV、Dof5.1和BBR-BPC1-like。MYB轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，MYB參與白藜蘆醇合成上游途徑的苯丙烷代謝，以及具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的類黃酮代謝途徑，也在白藜蘆醇代謝中發(fā)揮重要功能。

研究表明R2R3類型的MYB14和MYB15能夠特異性地激活STS的表達(dá)參與白藜蘆醇生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[25]，同時(shí)MYB15還在芪類化合物合成過(guò)程中參與調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[26]。本實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR結(jié)果表明，RS1及其轉(zhuǎn)錄因子基因MYB-DIV在不同光質(zhì)下具有相同的表達(dá)模式(暖白光除外)，兩者的表達(dá)特征呈正相關(guān)，因此，MYB-DIV在RS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起正調(diào)控作用。

Dof是一類植物轉(zhuǎn)錄因子，由200～400個(gè)氨基酸組成，N端為高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C末端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。研究表明在大豆、大白菜和香蕉中的Dof家族成員分別達(dá)到78、76和74個(gè)[27-29]，在葡萄中亦具有25個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子成員[30]，以上不同物種的Dof成員有待進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。Dof家族基因涉及脅迫響應(yīng)[31]、激素信號(hào)傳遞[32-34]、種子萌發(fā)[35-36]、生物合成[37-38]、細(xì)胞周期調(diào)控[39]等。通過(guò)利用酵母單雜交和煙草共轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證了葡萄VvDof14可以負(fù)調(diào)控VvABCG20基因的表達(dá)[40]。玉米ZmDof30可通過(guò)結(jié)合花粉特異表達(dá)基因Zm908啟動(dòng)子-126～+58區(qū)域的AAAG順式作用元件，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)控[41]。在擬南芥中，Dof5.1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致野生型出現(xiàn)葉片下卷表型，而Dof5.1突變會(huì)導(dǎo)致葉片上卷，并且促進(jìn)葉片近軸-遠(yuǎn)軸極性基因REV表達(dá)，同時(shí)下調(diào)植物生長(zhǎng)素基因IAA6和IAA19的表達(dá)[42]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和共線性分析，篩選到靶向RS1的候選轉(zhuǎn)錄因子Dof5.1，進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR表達(dá)分析驗(yàn)證，結(jié)果表明Dof5.1基因與靶基因RS1的表達(dá)模式總體呈相反趨勢(shì)，Dof5.1在RS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中起負(fù)調(diào)控作用。由于候選轉(zhuǎn)錄因子基因BBR-BPC1-like在不同光質(zhì)處理下無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，因此不參與RS1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究結(jié)果表明MYB-DIV和Dof5.1通過(guò)正負(fù)調(diào)控參與RS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)節(jié)葡萄白藜蘆醇的生物合成。