不同基因型普通菜豆再生能力研究

程 媛，馬朋濤，武 晶

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

普通菜豆(Phaseolus vulgarisL.)又稱蕓豆、四季豆，屬豆科、菜豆屬作物，是食用人群最多的食用豆類。普通菜豆籽粒富含鐵、鈣、鎂、錳和鉀等礦物質(zhì)元素[1]，具有高蛋白、中淀粉、低脂肪以及營養(yǎng)元素豐富等特點，是人類飲食中植物蛋白的重要來源[2]，深受消費者的喜愛。普通菜豆在l5世紀(jì)從歐洲引入中國，已有500多年的栽培歷史[3]。目前，中國種植的普通菜豆大多為地方品種，主要分布于云南、貴州、山西、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古和黑龍江等省區(qū)[4]，是中國主要的出口創(chuàng)匯商品之一[5]。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種生物技術(shù)手段，徹底打破了常規(guī)育種中物種間的限制，實現(xiàn)了不同物種之間遺傳物質(zhì)的重組。再生系統(tǒng)的建立是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵步驟，而普通菜豆是菜豆屬中再生和遺傳轉(zhuǎn)化最困難的作物[6]。在1976年O.J.Crocomo等[7]首次獲得了2株普通菜豆再生植株，隨后對普通菜豆的大量再生研究表明其存在兩種再生途徑：器官發(fā)生途徑和體細胞發(fā)生途徑[8]。其中，器官發(fā)生途徑包括直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑。

目前，建立的普通菜豆再生體系大部分是直接器官發(fā)生途徑。直接器官發(fā)生途徑是不經(jīng)過愈傷組織形成階段，直接從外植體的葉肉細胞、表層細胞或分生組織誘導(dǎo)形成不定芽。例如，M.Santalla等[9]挑選出10個優(yōu)良品種和7個地方品種，將胚軸作為外植體進行再生試驗，得到了再生植株。M.H.Cruz等[10]利用14 d齡菜豆植株的橫向薄細胞層實現(xiàn)了高頻率的再生。P.Delgado-Sa′nchez等[11]利用成熟種子胚軸對兩個商業(yè)菜豆品種實現(xiàn)了有效再生。此外，普通菜豆的再生體系還有子葉節(jié)再生體系[12]、芽頂端分生組織再生體系[13]、幼葉的葉柄再生體系等[14]。由于不同類型外植體生理狀態(tài)差異，對于外界誘導(dǎo)、分化和再生能力有所不同[15]。M.Saxena[16]比較了不同外植體的再生效率，發(fā)現(xiàn)帶腋芽的子葉節(jié)、葉柄和子葉節(jié)的再生效率分別為78%、62%和82%。2021年Yu Y.等[17]將子葉節(jié)、胚軸和根段作為外植體進行普通菜豆再生試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用胚軸的再生芽率達74.21%，高于另外兩種外植體的再生芽率。然而，關(guān)于普通菜豆間接器官發(fā)生途徑報道很少。間接器官發(fā)生途徑是通過脫分化形成愈傷組織再分化成植株。M.F.Mohamed等[18]首次利用花梗作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，獲得了再生植株；M.A.Zambre等[19]從普通菜豆育種品系Xan-159的子葉和胚軸誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)從子葉誘導(dǎo)愈傷組織上獲得了可育的再生植株，再生效率達39%。J.Arellano等[20]將子葉節(jié)作為外植體，在含有0.34 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織再生出芽，再生芽效率達50%左右。隨后，R.Collado等[21]利用不同的外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并且測定了不同濃度的TDZ和BAP對愈傷組織誘導(dǎo)再生芽的影響，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加2.25或4.50 mg/L的BAP的培養(yǎng)基再生效果最佳，建立了一種可以應(yīng)用于5種類型的普通菜豆的間接器官再生系統(tǒng)。Yu Y.等[17]發(fā)現(xiàn)添加0.5 mg/L的TDZ誘導(dǎo)愈傷組織能力最強，誘導(dǎo)率達到91.51%，在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加1.0 mg/L的BAP后，芽再生頻率高達93.33%。

與器官發(fā)生途徑相比，采用體細胞發(fā)生途徑對普通菜豆進行再生的報道較少。A.Allavena[22]和S.Martins等[23]分別從普通菜豆未成熟合子胚的小葉和頂芽誘導(dǎo)的愈傷組織中獲得了胚狀體，但后續(xù)均未得到發(fā)育。多年后，L.R.García等[8]從胚性愈傷組織中獲得再生植株，再生效率達32%，并且發(fā)現(xiàn)體細胞胚的形成和萌發(fā)取決于外植體、培養(yǎng)基和光照條件。隨后，J.L.Cabrera-ponce等[24]在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素（BAP），結(jié)合滲透脅迫誘導(dǎo)獲得不同階段的體細胞胚，并分化形成了完整植株。

本試驗擬通過直接器官再生途徑將帶有子葉節(jié)的胚軸作為外植體進行再生試驗，篩選高再生芽率的基因型，為建立普通菜豆遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料

普通菜豆經(jīng)過長期馴化和地理隔離，形成了安第斯和中美洲兩個多樣性中心[25]。兩個中心的普通菜豆在形態(tài)特征方面存在明顯的差異，安第斯中心的普通菜豆籽粒大(百粒重>40 g)；而中美洲中心材料為中小籽粒（≤40 g）[26]。據(jù)報道，普通菜豆大粒品種再生十分困難[27]。因此，本試驗從中美洲基因庫中選取17份普通菜豆種質(zhì)資源，從安第斯基因庫中選取兩份，總共19個品種，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供（表1、圖1）。

表1 所用普通菜豆詳細信息Table 1 Details of the common beans used

圖1 19份普通菜豆材料籽粒形態(tài)Figure 1 Grain morphology of 19 common beans

1.1.2 培養(yǎng)基

試驗所用的培養(yǎng)基（表2）需經(jīng)過121℃、0.12 MPa高壓滅菌20 min，冷卻至50℃～60℃時在無菌條件下加入激素（激素需經(jīng)過濾器除菌），混勻，備用。

表2 試驗所用培養(yǎng)基Table 2 Medium used in the experiment

1.2 試驗方法

1.2.1 種子滅菌

采用氯氣滅菌法。選取表面光滑、無病害且大小一致的普通菜豆種子于培養(yǎng)皿中。分散開以保證滅菌充足，培養(yǎng)皿敞開放在通風(fēng)櫥中的干燥器中，采用100 mL HClO+4 mL HCl氯氣法進行滅菌18 h。

1.2.2 外植體的獲得

外植體的獲取參考Che P.等[28]的方法，并稍作改動。將無菌種子平放于發(fā)芽培養(yǎng)基上萌發(fā)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照18 h。當(dāng)萌發(fā)的胚軸2～3 cm時獲得無菌苗。不同品種萌發(fā)至相同狀態(tài)時，統(tǒng)計不同基因型的發(fā)芽率。然后將萌發(fā)好的種子切除子葉、頂芽和胚根，只保留1～2 cm的胚軸及子葉節(jié)部位，即可獲得外植體。

1.2.3 不定芽的誘導(dǎo)

將獲得的外植體平放于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25℃，光照18 h進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第2周時觀察再生芽狀態(tài)，切除下胚軸處褐色愈傷并進行繼代處理。培養(yǎng)第5周時統(tǒng)計不同基因型的再生芽株數(shù)及個數(shù)，計算再生芽率以及平均再生芽個數(shù)。

1.2.4 不定根的誘導(dǎo)及再生植株的形成

芽誘導(dǎo)結(jié)束后，將≥1 cm的再生芽接種在生根培養(yǎng)基上。待其長出主根，煉苗2 d后，移栽于土中培養(yǎng)，繼而獲得再生植株。

1.2.5 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

發(fā)芽率=發(fā)芽粒數(shù)/接種總粒數(shù)×100%，再生芽率=再生芽株數(shù)/接種外植體數(shù)×100%，再生芽數(shù)=再生芽總個數(shù)/再生芽株數(shù)，再生芽株數(shù)是再生芽大于等于1 cm的株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型發(fā)芽率的比較

種子萌發(fā)是再生過程中的第一步，發(fā)芽率決定著生長過程中品質(zhì)優(yōu)劣情況，是再生過程中一個重要的指標(biāo)，因此首先對19份不同基因型的普通菜豆進行萌發(fā)試驗。種子經(jīng)過氯氣滅菌處理后，平放于發(fā)芽培養(yǎng)基上進行萌發(fā)。試驗發(fā)現(xiàn)不同基因型的普通菜豆發(fā)芽率存在差異，19份普通菜豆平均發(fā)芽率為87.4%，達90.0%以上的為細白羊角豆、BAT1198、F0003370、Preto Catarinense、IAPAR 57、Ouro Branco、F0005919、Michelite、Garbancillo Zarco、ICA Pijao、HR45、龍蕓豆12和龍蕓豆17等13個品種。其中，BAT1198、F0005919、Michelite、Garban?cillo Zarco、HR45和龍蕓豆12發(fā)芽率達100%，BAT93、灰蘭刀豆、英國紅蕓豆、黑蕓豆、龍蕓豆7號以及Centa Cuscatleco的發(fā)芽率低于平均值，并且F0004313的發(fā)芽率最低，僅為27.5%（圖2）。同時，不同基因型的普通菜豆發(fā)芽速率不同，大粒品種發(fā)芽速率低于小粒品種，小粒品種5～6 d萌發(fā)至需要的狀態(tài)（圖3a），而大粒品種萌發(fā)到相同的狀態(tài)需更長的時間，10～15 d。

圖2 不同基因型普通菜豆發(fā)芽率Figure 2 The germination rate of common beans of different genotypes

圖3 再生體系的關(guān)鍵技術(shù)流程Figure 3 Key technical process of the regeneration system

發(fā)芽率不同可能是因為種皮的硬度不同影響種子的吸水程度，種皮較硬的種子難以吸脹，影響發(fā)芽率。此外，種皮顏色對種子的萌發(fā)也有一定的影響，白色種皮的籽粒萌發(fā)能力較強，如BAT1198、Garbancillo Zarco和龍蕓豆12等。

2.2 不同基因型菜豆再生形態(tài)分析

將獲得的外植體平放于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（圖3b），在相同條件下對19份普通菜豆進行芽誘導(dǎo)試驗。芽誘導(dǎo)第二周時發(fā)現(xiàn)下胚軸處有愈傷生成，子葉節(jié)處伴有較小的再生芽長出（圖3c），進行繼代處理。在第5周時下胚軸愈傷膨大，再生芽伸長（圖3d）?？捎^察到不同基因型普通菜豆再生芽的形態(tài)、長勢情況也存在明顯差異（圖4）。BAT93、灰蘭刀豆、F0003370、英國紅蕓豆、黑蕓豆、IAPAR 57、Ouro Branco、龍蕓豆 7 號、Garbancillo、ICA Pijao、龍蕓豆17和HR45這12份材料再生芽較?。?1.5 cm），其中BAT93、英國紅蕓豆、Ouro Branco和HR45這4份材料在胚軸頂端伴隨著叢芽生成。而細白羊角豆 、BAT1198、Preto Catarinense、F0005919、Michelite、Centa Cuscatleco和龍蕓豆12等共7份材料再生芽較大（≥1.5 cm）。

圖4 19份材料再生5周后狀態(tài)Figure 4 19 materials status after 5 weeks of regeneration

2.3 不同基因型普通菜豆再生芽率和再生芽數(shù)分析

對19份普通菜豆進行2次重復(fù)再生試驗發(fā)現(xiàn)，不同基因型的普通菜豆在相同條件中芽誘導(dǎo)效果差異顯著。對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析，19份材料總平均再生芽率為56.8%。其中有8份材料平均再生芽率高于總平均再生芽率，從高到低依次為細白羊角豆、Ouro Branco、ICA Pijao、Garbancillo Zarco、F0005919、HR45、Centa Cuscatleco和龍蕓豆12。細白羊角豆再生效果明顯，再生芽率高達94.4%，平均再生芽率為90.8%。其次是Ouro Branco，平均再生芽率87.1%，而英國紅蕓豆再生芽率最低（表3）。統(tǒng)計再生芽株數(shù)和個數(shù)，計算平均再生芽個數(shù)發(fā)現(xiàn)，19份材料再生芽數(shù)差異不明顯。每株再生芽個數(shù)在0～3個之間，平均再生芽個數(shù)在1.00～2.00個之間，相比較而言細白羊角豆再生芽個數(shù)較多，平均再生芽數(shù)為1.54個。

表3 19份材料再生芽率、平均再生芽數(shù)的比較Table 3 Comparison of regeneration bud rate and average number of regenerated

2.4 不同基因型普通菜豆生根能力及再生能力分析

將長出的再生芽從基部切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，進行生根試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)再生芽越大，生根速率越快，再生苗成活率也越高，大約30 d能長出茁壯的根系。反之，再生芽越小，生根越困難，形成的根系也越少。與此同時，還發(fā)現(xiàn)基因型對于生根沒有直接影響，每個基因型較大的再生芽均能生根（圖3e），而與再生芽的大小、茁壯程度有直接關(guān)系。當(dāng)組培苗產(chǎn)生2～3個主根時，煉苗2 d，洗去培養(yǎng)基后移至土中培養(yǎng)大約60 d能結(jié)莢（圖3f）。

對19份材料進行兩次重復(fù)再生試驗，發(fā)現(xiàn)細白羊角豆萌發(fā)能力強，發(fā)芽率高。再生過程中再生芽較大、較壯，再生芽率高達94.4%，平均再生芽率為90.8%，平均再生芽個數(shù)達1.54個，生根能力較強，與其他品種比較，再生效果顯著。對多重數(shù)據(jù)進行分析認(rèn)為細白羊角豆在19份材料中再生能力最強。初步認(rèn)為細白羊角豆是這19份材料中最適宜的普通菜豆再生品種。

3 討論與結(jié)論

目前，普通菜豆遺傳轉(zhuǎn)化體系還處在探索階段，影響其轉(zhuǎn)化效率的因素很多，其中高效穩(wěn)定的再生體系是構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵一環(huán)。植物器官的分化與再生依賴于基因型，因此篩選再生能力較強的基因型是高效誘導(dǎo)普通菜豆再生植株的關(guān)鍵，也是普通菜豆高效再生體系建立的前提。

本論文對19份不同普通菜豆基因型的再生能力進行比較分析，發(fā)現(xiàn)細白羊角豆的再生能力較好，為94.4%。K.A.Malik等[29]對6種不同基因型的普通菜豆進行再生試驗，發(fā)現(xiàn)不同基因型的普通菜豆再生芽率存在差異。P.Delgado-sanchez等[30]將胚軸作為外植體，研究Flor de Junio Marcela（FJM）和Flor de Mayo Anita（FMA）這兩個普通菜豆品種的再生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FJM再生芽率達83.0%，而FMA再生芽率僅為50.0%。G.Mukeshimana等[31]優(yōu)化再生體系對4個普通菜豆品種進行再生試驗，其中Merlot再生芽率最高，為93.0%，而Zorro再生芽率僅為67.0%。大多數(shù)普通菜豆品種再生十分困難，尤其是大粒品種[32]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，大粒品種英國紅蕓豆再生困難，再生芽率最低，為22.2%，而小粒品種細白羊角豆再生芽率最高為94.4%。本研究結(jié)果進一步說明不同基因型普通菜豆再生能力差異顯著，在后續(xù)進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗之前篩選合適的基因型是必要的。細白羊角豆具有較高的再生芽率，此基因型可以作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化研究的受體材料，希望通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得普通菜豆轉(zhuǎn)基因植株，并為后續(xù)的基因功能驗證奠定基礎(chǔ)。