飼糧中添加桉葉油和茴香油對肉羊甲烷產(chǎn)量及瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響

唐煒軒 趙 琛 賈 淼 李 燕 劉淑甜 李艷玲

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

反芻動物生產(chǎn)對大氣環(huán)境產(chǎn)生很大的影響，其攝取飼糧的總能量中有2%～15%會轉(zhuǎn)化為甲烷(CH4)并排放到大氣中[1]，這不僅降低了飼料的利用率，同時也污染了大氣。反芻動物的CH4排放量占全球溫室氣體排放量的16%～25%，占全球人為CH4排放量的33%，而其釋放到環(huán)境中的CH4主要來自胃腸道發(fā)酵(87%來自瘤胃，13%來自大腸)[1]。

同時，生產(chǎn)中往往需要提高飼料利用率來降低飼料的用量以達(dá)到降低成本的目的，其中降低CH4產(chǎn)量可以有效利用飼料中損耗的甲烷能，提高飼料利用率。近年來，植物提取物因來源廣泛、綠色無毒、生物活性較好的特點(diǎn)而受到人們關(guān)注，其中植物精油(EOs)因具有抗菌、抗氧化等活性而被認(rèn)為是具有潛力的廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物[2]。以往的體外研究發(fā)現(xiàn)，植物精油可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系和降低反芻動物CH4產(chǎn)量，如Jahani-Azizabadi等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，桉葉油、檀香精油、薰衣草精油等8種植物精油可以降低體外瘤胃CH4產(chǎn)量；Garcia等[4-5]的研究結(jié)果表明，馬鞭草和印加孔雀草精油可以顯著降低體外瘤胃CH4產(chǎn)量；Zhou等[6]的研究表明，牛至油具有降低CH4產(chǎn)量的效果；Lei等[7]的結(jié)果表明，混合植物精油具有調(diào)節(jié)山羊瘤胃微生物區(qū)系和降低CH4排放的效果；Lee等[8]的研究顯示，植物精油可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物群落。然而，植物精油具體是通過影響哪些微生物區(qū)系來影響瘤胃CH4產(chǎn)量的仍未可知。同時，由于動物體內(nèi)的瘤胃微生物具有一定的適應(yīng)性，體外試驗研究的結(jié)果還需要在體內(nèi)加以驗證。

桉葉油的主要成分為1,8-桉樹腦，茴香油的主要成分為茴香腦。我國的桉葉油和茴香油產(chǎn)量居世界首位，二者因具有廣譜抗菌、抗炎、抗氧化的活性而被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)療業(yè)[9-12]。研究發(fā)現(xiàn)，桉葉油和茴香油可以通過本身的疏水性來增加細(xì)胞的滲透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞成分的泄漏；同時，桉葉油具有影響細(xì)胞生物膜形成的效果，說明其可以通過影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及生理功能來實現(xiàn)抑菌[9,13]。目前，研究發(fā)現(xiàn)，利用植物精油的抗菌活性可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系及CH4產(chǎn)量，如Sallam等[14]發(fā)現(xiàn)桉葉油具有降低體外瘤胃CH4產(chǎn)量的潛力，另有研究發(fā)現(xiàn)桉葉油可以顯著降低體外瘤胃CH4產(chǎn)量以及古菌、原蟲及主要纖維分解菌的豐度[15]；茴香油在體外條件下降低綿羊瘤胃產(chǎn)氣量、提高瘤胃中內(nèi)毛蟲及其他原生動物總數(shù)的潛力也有見報道[16]。在上述體外研究的基礎(chǔ)上，本試驗開展了肉羊體內(nèi)試驗，旨在探究飼糧中添加桉葉油和茴香油對肉羊CH4產(chǎn)量、瘤胃微生物數(shù)量及產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響，以期為植物精油在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試精油

選擇2種天然植物精油開展本試驗，分別是桉葉油(純度為80%，產(chǎn)地為廣西)和茴香油(純度為89%，產(chǎn)地為廣西)。

1.2 試驗動物

選用體重為(64.45±8.56)kg的6只健康杜寒F1代雜交成年瘺管羊。

1.3 試驗設(shè)計

將6只瘺管羊隨機(jī)分為3組，分別為對照組(基礎(chǔ)飼糧，不添加植物精油)、桉葉油組[基礎(chǔ)飼糧+500 mg/(頭·d)桉葉油]、茴香油組[基礎(chǔ)飼糧+500 mg/(頭·d)茴香油]，每組2只。基礎(chǔ)飼糧依據(jù)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制，制作成顆粒料?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

采用3×3拉丁方設(shè)計，開展3期試驗，每期22 d，其中預(yù)試期14 d，正試期8 d。試驗羊只單籠飼養(yǎng)，每天飼喂2次，分別于08:00和18:00飼喂試驗飼糧，自由采食，試驗期間所有羊只自由飲水。在每日晨飼時，將試驗用植物精油按照劑量添加至顆粒料表面并保證肉羊在最短時間內(nèi)采食完畢。在第19～21天進(jìn)行CH4產(chǎn)量測定，其中第19天讓試驗羊適應(yīng)呼吸測熱室，第20～21天測定氣體中CH4含量；第22天取瘺管羊瘤胃食糜，用于提取DNA。

1.4 CH4產(chǎn)量測定

試驗采用美國Sable氣體代謝系統(tǒng)，連接6個氣體代謝室，可以同時測定6只羊的氣體交換量。試驗期間將試驗羊移入呼吸測熱室中，每個呼吸測熱室中都配有食槽和水槽，能夠保證羊只自由采食和飲水。羊只進(jìn)入呼吸測熱室后適應(yīng)24 h，隨后每隔1 h測定1次氣體成分，連續(xù)2 d(第20～21天)共48 h測定CH4含量。測定后計算過程由Sable氣體代謝系統(tǒng)的測定程序以及對應(yīng)宏文件于計算機(jī)統(tǒng)計分析生成。根據(jù)每日每只羊的CH4排放量(L/d)計算代謝體重基礎(chǔ)的CH4產(chǎn)量(L/kg W0.75)。

1.5 瘤胃微生物數(shù)量及產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的檢測

1.5.1 樣品采集

在每期試驗的最后1天(第22天)，晨飼前2 h從每只羊的瘤胃瘺管采集食糜，混合均勻后立即分裝于3個20 mL離心管，迅速放入液氮，運(yùn)回實驗室-80 ℃保存，用于樣本DNA提取。

1.5.2 DNA的提取

參考趙麗萍等[17]的方法對樣本瘤胃微生物的DNA進(jìn)行提取，使用NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies,美國)檢測基因組DNA濃度和純度。

1.5.3 絕對熒光定量PCR

采用熒光定量PCR法檢測樣本中總細(xì)菌、總真菌、總原蟲和總產(chǎn)甲烷菌的基因絕對含量，選用定量PCR試劑盒[ABI Prower SybrGreen qPCR Master Mix(2×)，ABI公司，美國]及定量PCR儀(ABI7500型熒光定量PCR儀，ABI公司，美國)進(jìn)行測定，擴(kuò)增所用引物見表2。構(gòu)建大小為2 692 bp的質(zhì)粒載體，構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質(zhì)粒在260 nm處的吸光度(OD260)值，通過公式換算成拷貝數(shù)。

表2 熒光定量PCR引物

1.5.4 Illumina MiSeq測序

16S rDNA PCR擴(kuò)增所用產(chǎn)甲烷菌的引物與絕對熒光定量PCR一致，對產(chǎn)甲烷菌16S rDNA的V2～V5可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，再對每個樣本分別加上8 bp的標(biāo)簽序列。每個樣品的擴(kuò)增均做3次重復(fù)，將同一樣品的3個PCR重復(fù)產(chǎn)物混合后用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific公司，美國)進(jìn)行DNA純度和濃度檢測，DNA完整性檢測方法為2%瓊脂糖凝膠電泳法。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用熒光定量系統(tǒng)(QuantiFluorTM-ST，Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣本測序量的要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，然后根據(jù)Illumina MiSeq測序平臺的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行雙端測序。用QIIME(version 1.17)軟件對原始fastq文件進(jìn)行處理，處理標(biāo)準(zhǔn)如下：1)以50 bp為一個滑動窗口，如果窗口內(nèi)平均質(zhì)量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，并過濾掉小于50 bp的序列。2)根據(jù)標(biāo)簽序列區(qū)分樣本，標(biāo)簽序列允許的錯配數(shù)為0，引物錯配數(shù)為2，且去掉包含模糊堿基的序列。3)相互拼接上的序列之間，重疊區(qū)不得少于10 bp，且去掉無法拼接的序列。用UPARSE(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)軟件聚類生成操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，相似度為97%。再用UCHIME軟件鑒別嵌合體序列，并將之去除。分類學(xué)比對時，用silva(SSU115)16S核糖體RNA數(shù)據(jù)庫，算法為RDP Classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)，置信閾值為70%[20]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0的Mix模型進(jìn)行3×3拉丁方設(shè)計的統(tǒng)計分析。處理(飼糧)作為固定效應(yīng)，試驗動物(肉羊)和試驗期作為隨機(jī)效應(yīng)，進(jìn)行方差分析和多重比較。顯著性水平為P<0.05，有顯著趨勢為0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油對肉羊CH4產(chǎn)量的影響

飼糧中添加桉葉油和茴香油對肉羊CH4產(chǎn)量的影響結(jié)果見表3。與對照組相比，飼糧中添加500 mg/(頭·d)的桉葉油對肉羊CH4產(chǎn)量沒有顯著影響(P>0.05)，而添加500 mg/(頭·d)的茴香油有降低CH4產(chǎn)量的趨勢(P=0.08)；飼糧中添加500 mg/(頭·d)的桉葉油或茴香油對肉羊以代謝體重為基礎(chǔ)的CH4產(chǎn)量均無顯著影響(P>0.05)。

表3 植物精油對肉羊CH4產(chǎn)量的影響

2.2 植物精油對肉羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

飼糧中添加桉葉油和茴香油對肉羊瘤胃微生物數(shù)量的影響結(jié)果(表4)顯示，飼糧中添加500 mg/(頭·d)的桉葉油或茴香油對肉羊瘤胃總細(xì)菌、總真菌、總原蟲及總產(chǎn)甲烷菌數(shù)量均沒有顯著影響(P>0.05)。

表4 植物精油對肉羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

2.3 植物精油對肉羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響

2.3.1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

3個組共18個瘤胃食糜樣品的DNA純度和濃度均符合定量檢測標(biāo)準(zhǔn)，16S rDNA基因V1～V3可變區(qū)和V6～V8可變區(qū)擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示：各泳道擴(kuò)增的條帶單一且清晰，個別泳道因DNA濃度較小(第5泳道)及DNA彌散至條帶下方(第9、11泳道)的原因?qū)е聴l帶較淡。以上結(jié)果說明擴(kuò)增的DNA條帶符合測序標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行下一步測序。

ck+為空白對照，1kb表示電泳Marker，1、2、11、12、15、16為對照組瘤胃食糜樣品，3、4、7、8、17、18為桉葉油組瘤胃食糜樣品，5、6、9、10、13、14為茴香油組瘤胃食糜樣品。

2.3.2 稀釋曲線

試驗根據(jù)OTUs的數(shù)量(97%相似度)構(gòu)建了18個瘤胃樣品微生物的稀釋曲線(圖2)。樣本測序量為40 000個序列，說明樣本測序的數(shù)據(jù)量合理。測序量在10 000以下時，樣本中仍有未被檢測的產(chǎn)甲烷菌，隨著樣本測序量增加至40 000，曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTUs，樣本數(shù)據(jù)量已符合產(chǎn)甲烷菌多樣性分析的要求。

由字母與數(shù)字組成的編號為樣本名稱。下圖同。

2.3.3 植物精油對瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成的影響分析

主成分分析分析(principal component analysis，PCA)是一種對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的方法，常用來反映群落的β多樣性。PCA圖中X軸和Y軸表示2個選定的主成分軸，百分比表示主成分對樣本組成差異的解釋度值；X軸和Y軸的刻度是相對距離，無實際意義；不同形狀及顏色的圖例代表了不同處理肉羊瘤胃內(nèi)采集的微生物樣本?；贏NOSIM組間差異檢驗得出的PCA結(jié)果(圖3)顯示，對照組、桉葉油組和茴香油組間的瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成差異明顯，說明產(chǎn)甲烷菌的組成會隨著不同植物精油的處理而變化。

圖中CON為對照組，EUC為桉葉油組，ANI為茴香油組。下圖同。

2.3.4 植物精油對瘤胃產(chǎn)甲烷菌相對豐度的影響分析

飼糧添加桉葉油和茴香油對不同產(chǎn)甲烷菌相對豐度的影響見圖4。3個組中的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌均由未分類的甲烷短桿菌屬(unclassifiedMethanobrevibacter)、瘤胃甲烷短桿菌(Methanobrevibacterruminantium)和Methanobrevibactereuryarchaeote組成，占總產(chǎn)甲烷菌的98%(表5)；與對照組相比，桉葉油組中Methanobrevibactereuryarchaeote相對豐度顯著提高(P<0.05)，unclassifiedMethanobrevibacter和Methanobrevibacterruminantium相對豐度顯著降低(P<0.05)；而茴香油組中unclassifiedMethanobrevibacter和Methanobrevibactereuryarchaeote相對豐度顯著提高(P<0.05)，Methanobrevibacterruminantium相對豐度顯著降低(P<0.05)，且降低幅度在3個組中最大。

圖4 植物精油對肉羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌豐度的影響

表5 桉葉油和茴香油對肉羊瘤胃甲烷菌群在種水平相對豐度的影響

2.3.5 植物精油對瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響相關(guān)性分析

3組肉羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成熱圖和樣本聚類樹分析結(jié)果如圖5所示，圖中根據(jù)不同分組的樣本之間和不同產(chǎn)甲烷菌之間的物種相對豐度相似性進(jìn)行了聚類分析，將相對豐度大小接近的樣本或產(chǎn)甲烷菌分配到一個分支；圖中從藍(lán)色到紅色的顏色變化表示產(chǎn)甲烷菌的群落相對豐度由小到大的變化。3個組共檢測出13個優(yōu)勢菌種，相對豐度最大的3個菌種分別為Methanobrevibacterruminantium、Methanobrevibactereuryarchaeote和unclassifiedMethanobrevibacter；3個組內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的相對豐度具有較大的相似性，然而桉葉油組與對照組之間Methanobrevibactereuryarchaeote和unclassifiedMethanobrevibacter的相對豐度具有較大差異，茴香油組和對照組之間Methanobrevibacterruminantium和unclassifiedMethanobrevibacter的相對豐度具有較大差異，其中茴香油組中Methanobrevibacterruminantium的相對豐度低于桉葉油組和對照組。

圖5 飼糧中添加植物精油與瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系變化的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 植物精油對肉羊CH4產(chǎn)量的影響

CH4產(chǎn)量是評價反芻動物能量代謝的重要指標(biāo)之一，因為CH4主要由產(chǎn)甲烷菌在瘤胃發(fā)酵過程中利用代謝氫產(chǎn)生，同時細(xì)菌、原蟲以及真菌產(chǎn)生的代謝氫傳遞給產(chǎn)甲烷古菌，通過氫營養(yǎng)途徑還原二氧化碳(CO2)也會生成CH4[21]。當(dāng)瘤胃中代謝氫從CH4轉(zhuǎn)移到揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的量增大時，反芻動物的能量利用率及生產(chǎn)性能會得到提升，反芻動物對環(huán)境的不良影響(CH4的產(chǎn)生)也會相應(yīng)降低[22]。飼糧的精粗比很大程度上會影響瘤胃CH4產(chǎn)量，通常高精飼糧會降低反芻動物CH4的排放[23]。本研究中，各組飼糧的精粗比均為60∶40，故CH4產(chǎn)量的結(jié)果主要受不同精油的影響，而不受飼糧精粗比的影響。目前，植物精油對反芻動物CH4產(chǎn)量的影響所得研究結(jié)果不盡相同，例如，Chaves等[24]的體外試驗發(fā)現(xiàn)肉桂油、大蒜油和杜松子油可以顯著降低瘤胃CH4產(chǎn)量；Ye等[25]的體外研究表明在909 kg底物中添加11 g的肉桂油和大蒜油混合物可以顯著降低瘤胃CH4產(chǎn)量；El-Zaiat等[26]的體外試驗顯示了90 μg/g DM的廣藿香精油降低了瘤胃CH4總產(chǎn)量；另有研究發(fā)現(xiàn)植物精油對瘤胃CH4產(chǎn)量沒有顯著影響，如Castaeda-Correa等[27]的研究顯示體外單獨(dú)或聯(lián)合使用200 mg/L百里香酚和香芹酚對瘤胃CH4的產(chǎn)量沒有顯著影響；Kouazounde等[28]的體外研究結(jié)果表明400 mg/L的薄荷精油對瘤胃CH4產(chǎn)量沒有顯著影響。上述研究結(jié)果表明，植物精油對瘤胃CH4產(chǎn)量的影響可能與種類和劑量有關(guān)。在以往的研究中，桉葉油對瘤胃CH4產(chǎn)量的影響效果也沒有一致結(jié)論，部分體外研究發(fā)現(xiàn)400～1 000 mg/L的桉葉油具有降低瘤胃CH4產(chǎn)量的效果[29-30]；而另有體外研究顯示100～300 mg/L的桉葉油對瘤胃CH4產(chǎn)量沒有顯著影響[31]，可能是濃度較低時桉葉油不能影響CH4產(chǎn)量，而在高濃度時，桉葉油對CH4產(chǎn)量具有較好的降低效果。在茴香油的研究中，陸燕[32]的體外研究發(fā)現(xiàn)30 mg/L的茴香油可以降低CH4產(chǎn)量，表明茴香油在較低濃度下就可以降低瘤胃CH4的產(chǎn)量。

本實驗室前期對桉葉油、山蒼子油、肉桂油和茴香油4種植物精油不同濃度的體外產(chǎn)氣試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除桉葉油外的其他3種植物精油在高濃度(400 mg/L)時均顯著降了24 h產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量，但同時也顯著降低了體外發(fā)酵培養(yǎng)24 h的總VFA濃度，且總VFA濃度隨植物精油濃度的增加呈線性下降的趨勢，尤其是在高濃度時，下降最多的達(dá)到28.19%，而桉葉油雖然降低了24 h的CH4產(chǎn)量，但對總產(chǎn)氣量和總VFA濃度沒有顯著影響，且在不同濃度梯度下，總VFA濃度均沒有下降，甚至在數(shù)值上還有所增加，表明桉葉油在降低CH4產(chǎn)量的同時對體外瘤胃發(fā)酵沒有產(chǎn)生抑制作用，這在動物生產(chǎn)中具有重要價值；另外，由于茴香油降低CH4產(chǎn)量的效果最顯著，24 h體外發(fā)酵的CH4產(chǎn)量在濃度為400 mg/L時比對照組降低了47.75%，預(yù)測在動物生產(chǎn)中將具有較好的降低CH4的效果[33]。根據(jù)體外試驗的結(jié)果，本實驗室后續(xù)選擇了桉葉油和茴香油開展體內(nèi)動物試驗，旨在探討其對肉羊CH4產(chǎn)量和瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量及組成的影響。由于動物體內(nèi)微生物的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體外發(fā)酵試驗，故本試驗中植物精油在肉羊中的添加劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體外發(fā)酵試驗。研究結(jié)果顯示，肉羊飼糧中添加500 mg/(頭·d)的桉葉油對CH4產(chǎn)量無顯著影響，原因可能是桉葉油的添加劑量不足以達(dá)到降低體內(nèi)CH4產(chǎn)量的效果；另外，肉羊飼糧中添加500 mg/(頭·d)的茴香油有降低CH4產(chǎn)量的趨勢，在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著，可能是由于500 mg/(頭·d)的茴香油添加量沒有達(dá)到足夠抑制產(chǎn)甲烷菌的效果，但每日CH4排放量降低了12.12%，在生產(chǎn)中仍具有一定的應(yīng)用價值。

3.2 植物精油對肉羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

反芻動物CH4的產(chǎn)生，除了產(chǎn)甲烷古菌起主要作用外，瘤胃微生物中細(xì)菌、真菌、原蟲等微生物之間的相互作用也是重要原因[22]，瘤胃微生物的代謝活動也可以直接影響瘤胃中CH4、CO2等氣體的產(chǎn)量[27]。利用植物精油的抗菌活性改變瘤胃微生物的數(shù)量是調(diào)控瘤胃產(chǎn)氣量的手段之一。目前，植物精油對瘤胃微生物數(shù)量的影響研究結(jié)果并不一致，如Paraskevakis[34]的報道顯示1 mL牛至油與20 g牛至干葉可以降低瘤胃總產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量，而對總真菌、總原蟲和部分纖維分解菌的數(shù)量均沒有顯著影響；而Chahaardoli等[16]的體外研究顯示25 μL/mL的茴香油和茴香醇均可隨濃度增加線性降低瘤胃總原蟲數(shù)量。此外，植物精油是否可以通過改變瘤胃微生物數(shù)量而降低CH4產(chǎn)量也未見一致的研究報道，如Castaeda-Correa等[27]的研究顯示體外添加200 mg/L百里香酚和香芹酚混合精油可以降低瘤胃總細(xì)菌數(shù)量，然而瘤胃CH4產(chǎn)量沒有顯著變化；而Vargas等[35]的體外研究卻表明6%的向日葵精油可以顯著降低瘤胃總細(xì)菌數(shù)量和瘤胃CH4產(chǎn)量。以上研究結(jié)果表明，不同植物精油對瘤胃微生物的影響不同，而CH4產(chǎn)量的降低具體受哪些瘤胃微生物區(qū)系變化的影響也需要進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果中，添加2種植物精油對肉羊瘤胃總細(xì)菌、總真菌、總原蟲和總產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均沒有產(chǎn)生顯著影響，這可能也是本試驗中CH4產(chǎn)量沒有顯著變化的原因所在。分析其原因，一方面可能是植物精油的添加劑量未達(dá)到抑制微生物數(shù)量的程度，另一方面可能是瘤胃微生物具有適應(yīng)性，隨著植物精油添加時間的延長，微生物數(shù)量達(dá)到了新的平衡。此外，高濃度的植物精油所表現(xiàn)的抗菌活性常常會降低瘤胃微生物的數(shù)量，從而降低反芻動物消化代謝的效率，而本研究所采用的濃度并未影響到肉羊瘤胃微生物總數(shù)，說明這2種植物精油的添加未改變瘤胃中的發(fā)酵環(huán)境。在此前提下，茴香油在數(shù)值上對CH4產(chǎn)量的降低效果可能更具有生產(chǎn)價值。

3.3 植物精油對肉羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響

產(chǎn)甲烷古菌主要存在于反芻動物的瘤胃和腸道下部，它們利用瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的還原力將CO2、甲酸或甲胺還原為CH4，因此，人們通常認(rèn)為改變產(chǎn)甲烷菌區(qū)系可以很大程度影響反芻動物的CH4排放量[34]。高通量測序技術(shù)在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用使得人們可以便捷和精準(zhǔn)地揭示植物精油對瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響[36-37]。Patra等[31]的研究表明，牛至油、大蒜油和薄荷油能有效降低CH4產(chǎn)量，減少產(chǎn)甲烷菌的豐度；Kala等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，給水牛飼喂由青蒿油、檸檬草油和丁香油樹脂按等比例混合而成的混合精油可以降低甲烷球菌屬(Methanococcus)和熱原體屬(Thermoplasma)的豐度，而原蟲和細(xì)菌的數(shù)量變化不顯著。這些結(jié)果表明，植物精油的添加具有改變瘤胃中產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的效果，然而不同產(chǎn)甲烷菌豐度的變化是否必然導(dǎo)致CH4產(chǎn)量的變化卻并沒有統(tǒng)一的結(jié)論。在本研究中，添加500 mg/(頭·d)的桉葉油或茴香油均沒有改變?nèi)馀Ａ鑫钢锌偖a(chǎn)甲烷菌的數(shù)量，而改變了unclassifiedMethanobrevibacter、Methanobrevibacterruminantium和Methanobrevibactereuryarchaeote的相對豐度，該結(jié)果體現(xiàn)了植物精油對瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響。Ohene等[39]研究了肉桂醛、大蒜和杜松子油對肉羊瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的影響，結(jié)果表明，植物精油處理后古生菌16S rRNA的總拷貝數(shù)沒有顯著變化，而斯塔曼甲烷球形菌(Methanosphaerastadtmaniae)、史密斯氏甲烷短桿菌(Methanobrevibactersmithii)和部分未命名的產(chǎn)甲烷古菌的多樣性有增加的趨勢，也表明植物精油的添加可能對產(chǎn)甲烷菌總數(shù)沒有影響，但影響產(chǎn)甲烷菌區(qū)系。本研究中，產(chǎn)甲烷菌群PCA的結(jié)果體現(xiàn)了2種植物精油對瘤胃產(chǎn)甲烷菌群組成的影響效果，其中茴香油處理下的產(chǎn)甲烷菌群組成與對照組和桉葉油組不同；從產(chǎn)甲烷菌群相對豐度變化的結(jié)果與產(chǎn)甲烷菌群熱圖分析結(jié)果可見，茴香油組中Methanobrevibacterruminantium的相對豐度小于其他2組。因此，我們推測茴香油在數(shù)值上降低CH4產(chǎn)量可能是由于其使Methanobrevibacterruminantium數(shù)量大幅降低所致。

4 結(jié) 論

飼糧中添加500 mg/(頭·d)的桉葉油或茴香油對肉羊瘤胃總細(xì)菌、總真菌、總原蟲和總產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均沒有顯著影響，但茴香油在數(shù)值上降低了肉羊CH4產(chǎn)量。桉葉油和茴香油的添加影響了肉羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌區(qū)系，其中茴香油在數(shù)值上對CH4產(chǎn)量的降低可能是由于其較大程度地降低了Methanobrevibacterruminantium的數(shù)量。