代謝組學(xué)在篩選奶牛酮病生物標(biāo)志物中的應(yīng)用

安彥昊 馬學(xué)虎 孫奕爍 馬燕芬,2*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031)

近年來，隨著我國奶牛存欄量的增多以及畜牧業(yè)集約化、標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化水平的不斷提高，奶牛群體中營養(yǎng)代謝疾病的發(fā)病率在逐年增高，尤其是在高產(chǎn)奶牛。高產(chǎn)奶牛群體中酮病的發(fā)病率極高，酮病不僅會(huì)造成產(chǎn)奶量的下降，還會(huì)引發(fā)產(chǎn)后奶牛的一系列疾病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致奶牛死亡。據(jù)報(bào)道，美國圍產(chǎn)后期奶牛的臨床型酮病發(fā)病率為43%[1]，我國圍產(chǎn)后期奶牛的臨床型酮病發(fā)病率為2%～20%，亞臨床型酮病發(fā)病率為10%～30%[2]。酮病作為一種高風(fēng)險(xiǎn)疾病，其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，特別是亞臨床型酮病，由于其沒有明顯的病理變化和臨床癥狀，在診斷和預(yù)防過程中困難相對較大，會(huì)對奶牛健康、生產(chǎn)性能和繁殖性能產(chǎn)生負(fù)面影響[3-4]，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和危害[5]。截止到目前，奶牛酮病的發(fā)病機(jī)理還沒有完全了解清楚，之前有很多研究主要是通過對酮病奶牛的某一代謝途徑進(jìn)行研究[6-7]，得到的結(jié)果只能單方面作為奶牛代謝狀況的依據(jù)，仍然缺乏對奶牛酮病代謝的全景式研究。代謝組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用[8]，使人們將病理學(xué)的表觀認(rèn)識和代謝物分子之間的動(dòng)態(tài)變化結(jié)合在一起，可以從分子水平層面更好地、更全面地、更系統(tǒng)地揭示疾病的病理變化和發(fā)病機(jī)理[9]。代謝組學(xué)作為基因表達(dá)的最下游，逐漸被用于分析奶牛酮病的發(fā)生，因?yàn)樗梢苑从成锵到y(tǒng)的現(xiàn)狀，而且應(yīng)用起來相對便宜。代謝組學(xué)技術(shù)可以全面系統(tǒng)地呈現(xiàn)出動(dòng)物不同組織和體液中所有差異性代謝物數(shù)量上的動(dòng)態(tài)變化[10]。組織和體液中差異性代謝物不僅可以對奶牛酮病的發(fā)病機(jī)理研究提供一定的理論基礎(chǔ)，還可作為奶牛酮病早期診斷的生物標(biāo)志物。本文綜述了應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)篩選酮病奶牛體液中生物標(biāo)志物的相關(guān)研究，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中快速精準(zhǔn)診斷奶牛酮病提供技術(shù)支撐。

1 奶牛酮病

酮病是由于奶牛圍產(chǎn)期能量供應(yīng)不足和泌乳期間大量的能量需求，導(dǎo)致奶牛進(jìn)入能量負(fù)平衡(negative energy balance，NEB)狀態(tài)而引起的以能量代謝障礙為基礎(chǔ)的代謝性疾病[11]，臨床表現(xiàn)為食欲減退、昏睡、產(chǎn)奶量下降，呼出氣體、乳汁、尿液中有酮味，消化代謝發(fā)生紊亂，血液、乳汁、尿中酮體濃度增高，并且會(huì)出現(xiàn)低血糖癥、酮血癥、酮尿癥和酮乳癥等臨床病理特征。酮體的主要成分為乙酰乙酸、β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid，BHBA)和丙酮。酮病多見于分娩后6周內(nèi)的高產(chǎn)奶牛和日產(chǎn)奶量高于30 kg的高產(chǎn)奶牛[12]。酮病通常分為臨床型酮病和亞臨床型酮病。正常情況下健康奶牛血液中葡萄糖(glucose，GLU)濃度低于500 mg/L，BHBA濃度低于1.2 mmol/L，尿酮濃度為3～30 mg/L；如果血液中BHBA濃度在1.2～3.0 mmol/L，尿酮濃度高于100 mg/L，可診斷為亞臨床型酮??；若血液中BHBA濃度≥3.0 mmol/L，則診斷為臨床型酮病[13-14]，其中高濃度的BHBA、非酯化脂肪酸(non esterified fatty acid，NEFA)和低濃度的GLU是診斷酮病發(fā)生的黃金指標(biāo)[15]。

奶牛酮病發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，目前對其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但基本可以確定是糖脂代謝紊亂導(dǎo)致的。當(dāng)圍產(chǎn)期奶牛攝入的能量無法滿足泌乳需求時(shí)，機(jī)體就會(huì)動(dòng)員脂質(zhì)產(chǎn)生甘油和脂肪酸來彌補(bǔ)GLU的缺乏[16-18]，但脂質(zhì)的大量動(dòng)員增加了血液中NEFA的濃度[19]。被動(dòng)員的脂質(zhì)首先被分解為NEFA，然后經(jīng)β-氧化分解生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A最終被草酰乙酸氧化產(chǎn)生能量來滿足機(jī)體能量的需求。如果GLU和草酰乙酸的含量不能夠滿足機(jī)體能量的需求，生酮氨基酸經(jīng)丙酮酸的氧化脫羧產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A聚集在肝臟，在酶的作用下生成丙酮[20]，進(jìn)一步生成酮體[21]。此外，肝臟從血漿中吸收的過量脂肪酸也可以在肝細(xì)胞中代謝生成酮體，從而誘發(fā)酮病[11,22]。由此可以看出，奶牛酮病的發(fā)生與奶牛飼糧的配制、機(jī)體自身的體況有很大關(guān)系。酮病作為高產(chǎn)奶牛圍產(chǎn)期極度易發(fā)、危害性最大的一種營養(yǎng)代謝性疾病，雖然死亡率很低，但誘發(fā)的炎性疾病和較高的治療成本會(huì)給養(yǎng)殖戶帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失和危害，在一定程度上制約著我國奶牛業(yè)的發(fā)展。

2 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是對細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物進(jìn)行系統(tǒng)地研究的一門科學(xué)，它可以直接揭示生物機(jī)體中的化學(xué)過程和代謝狀態(tài)[23]。代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用在人和動(dòng)物研究中，如毒理學(xué)、藥理學(xué)、先天代謝缺陷疾病、食品科學(xué)等。當(dāng)機(jī)體受到病理生理刺激或環(huán)境因素影響，體內(nèi)糖類、脂質(zhì)、核苷酸和氨基酸等內(nèi)源性小分子代謝物(相對分子質(zhì)量小于1 000)種類和數(shù)量就會(huì)發(fā)生變化[24]，通過分析其代謝途徑就能明確代謝物之間的相互關(guān)系，從而確定疾病之間潛在的途徑。機(jī)體體液中代謝產(chǎn)物成分的變化可以很好反映出機(jī)體的健康狀態(tài)或疾病情況[25]，通過代謝組學(xué)可以發(fā)現(xiàn)在疾病診斷、疾病發(fā)病機(jī)制、疾病治療中存在的潛在生物標(biāo)志物，結(jié)合多組學(xué)技術(shù)平臺(如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等)提供最全面的生物學(xué)狀態(tài)圖譜[26]。目前，基于核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography/mass spectrometry，GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography/mass spectrometry，LC-MS)等代謝組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用[27]，代謝組學(xué)主要研究的對象包括血液[28]、乳液[29]、尿液[30]等。

3 代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛上的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到毒理學(xué)、藥理學(xué)、先天性代謝缺陷以及營養(yǎng)學(xué)的研究中[31]。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛營養(yǎng)代謝疾病、繁殖障礙疾病、肢蹄病等方面的應(yīng)用報(bào)道逐漸增多[32-35]。Xu等[36]基于NMR技術(shù)鑒定出脂肪肝奶牛血漿代謝物的變化，共鑒定出31種代謝產(chǎn)物，采用1H-NMR技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)總蛋白(total protein，TP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)可作為診斷奶牛脂肪肝的潛在生物標(biāo)志物。Luo等[37]使用靶向代謝組學(xué)技術(shù)鑒定奶牛分娩期間血漿代謝物的變化，鑒定出67種差異性代謝物，包括氨基酸、脂質(zhì)、糖類和核苷酸，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)前期到泌乳期間增加的代謝物主要參與脂質(zhì)代謝和能量代謝，而圍產(chǎn)前期到泌乳期間減少的代謝物則與氨基酸代謝有關(guān)。Zhang等[38]應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究了跛行前、跛行和瘸后奶牛血清代謝物的變化，篩選出跛行奶牛血清中的潛在生物標(biāo)志物二?；字Ｄ憠A、磷脂酰膽堿?；榛⑶柿字?、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸，通過檢測這些代謝物即可區(qū)分出跛行奶牛和健康奶牛。

3.1 血液代謝組學(xué)分析

近幾年來，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)篩選奶牛血漿差異性代謝物來判定奶牛疾病發(fā)病機(jī)制的研究越來越多。通過對健康、亞臨床型酮病及臨床型酮病奶牛血漿差異性代謝物的分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生亞臨床型酮病時(shí)，血液中膽堿含量的升高促進(jìn)了肝臟中脂肪酸以卵磷脂的形式被運(yùn)輸和氧化利用[39]，而膽堿含量的降低與脂類物質(zhì)含量的升高呈負(fù)相關(guān)[40]，說明奶牛發(fā)生亞臨床型酮病時(shí)能量負(fù)平衡不是很嚴(yán)重，但肌酸間接提供的能量不僅減少體內(nèi)糖原利用，而且滿足機(jī)體能量的需求，同時(shí)也能緩解能量負(fù)平衡[41]。能量負(fù)平衡嚴(yán)重時(shí)，肌酸的含量顯著升高，此時(shí)需要更多的肌酸來緩解這種負(fù)平衡[42]，肌酸含量的變化為緩解酮病奶牛能量負(fù)平衡的研究提供了一定的技術(shù)依據(jù)，可以進(jìn)一步驗(yàn)證將膽堿和肌酸作為診斷亞臨床型酮病的特異性生物標(biāo)志物。此外，碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、谷甾醇和維生素E異構(gòu)體等也可作為判定奶牛酮病的潛在生物標(biāo)志物，其中2-哌啶羧酸和順-9-十六烯酸與酮病代謝紊亂密切相關(guān)，GLU、BHBA和NEFA在臨床實(shí)踐中用于檢測酮病代謝紊亂[43]。Sun等[44]發(fā)現(xiàn)，亞臨床型酮病和臨床型酮病奶牛血漿中乳酸鹽、谷氨酸鹽、谷氨酰胺和苯丙氨酸的含量高于健康奶牛，說明奶牛酮病的發(fā)生與糖異生底物的缺乏有很大關(guān)系，推測三羧酸循環(huán)發(fā)生異常可能是導(dǎo)致奶牛酮病發(fā)生的重要原因。此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)奶牛發(fā)生酮病時(shí)糖類代謝、脂類代謝、氨基酸代謝、維生素和微量元素代謝等多個(gè)代謝途徑均發(fā)生了代謝紊亂[45-47]。李影[48]應(yīng)用1H-NMR技術(shù)驗(yàn)證了Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病發(fā)生過程中奶牛糖類代謝、脂類代謝和氨基酸代謝發(fā)生紊亂，并發(fā)現(xiàn)檸檬酸的形成是三羧酸循環(huán)發(fā)生異常的主要原因，乳酸可以作為區(qū)分Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病奶牛的參考指標(biāo)，膽堿磷酸甘油酯可作為診斷酮病奶牛脂類代謝發(fā)生紊亂的生物標(biāo)志物，其中酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸等可為奶牛酮病的治療提供新的策略。

采用1H-NMR和GC/MS技術(shù)分析臨床型酮病奶牛和亞臨床型酮病奶牛血漿差異性代謝物，發(fā)現(xiàn)脂類代謝發(fā)生異常時(shí)十六酸、十七酸、十八酸、十四酸、油酸、9-十六碳烯酸和氨基丙二酸含量升高[39]，通過對比組間差異性代謝物發(fā)現(xiàn)BHBA、GLU、乳酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、檸檬酸為共同代謝物，其中BHBA和GLU是奶牛酮病監(jiān)測的首選指標(biāo)，同時(shí)胎次、泌乳量、體況和干物質(zhì)攝入量也可作為奶牛酮病群體監(jiān)測的輔助參數(shù)[49]，因此，可以考慮將奶牛血漿中部分脂肪酸作為奶牛酮病診斷的生物標(biāo)志物。Hailemariam等[50]采用液相色譜質(zhì)譜靶向技術(shù)分析了6頭健康奶牛和6頭酮病奶牛分娩前4周、分娩前1周、分娩后1周和分娩后4周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康奶牛和酮病奶牛在以上4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿代謝物均有明顯差異，并發(fā)現(xiàn)肉毒堿、丙酰肉毒堿和溶血磷脂酰膽堿可以作為奶牛圍產(chǎn)期酮病預(yù)防的生物標(biāo)志物，其敏感性高達(dá)87%，特異性高達(dá)85%。

奶牛體內(nèi)GLU極度缺乏的狀態(tài)下，與健康奶牛對比，臨床型酮病奶牛血漿中生糖氨基酸含量降低，機(jī)體才將生糖氨基酸作為生糖物質(zhì)來補(bǔ)充GLU的缺乏，可以考慮將其作為診斷臨床型酮病與亞臨床型酮病的生物標(biāo)志物[40]。臨床型酮病奶牛血液中極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)與低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的含量是降低的，之前也有研究指出酮病奶牛體內(nèi)脂肪動(dòng)員增多會(huì)造成LDL和VLDL含量下降[16,39]，說明在臨床型酮病奶牛血液中脂蛋白代謝異常，可以考慮將LDL和VLDL作為奶牛臨床型酮病診斷的生物標(biāo)志物。此外，Wu等[19]采用代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全面揭示了圍產(chǎn)期奶牛酮病的發(fā)生和發(fā)展過程，并發(fā)現(xiàn)4-羥基-6-甲基吡喃-2-酮和肉桂酰甘氨酸的代謝產(chǎn)物可作為診斷奶牛酮病的潛在生物標(biāo)志物。

3.2 乳汁代謝組學(xué)分析

牛乳中的差異性代謝物也可以作為判定奶牛酮病的生物標(biāo)志物。Lu等[51]采用非靶向代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對泌乳期奶牛乳汁的能量平衡狀態(tài)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)奶牛重度能量負(fù)平衡狀態(tài)下牛乳中的急性期反應(yīng)蛋白、不飽和脂肪酸和半乳糖含量較高，能量正平衡狀態(tài)下牛乳中的膽固醇及相關(guān)蛋白和胃抑素含量較高，這為評估能量負(fù)平衡奠定了理論基礎(chǔ)。利用NMR技術(shù)對酮病奶牛的牛乳差異性代謝物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，泌乳前4周甘油磷酸膽堿與磷酸膽堿的比率以及泌乳中期甘油磷酸膽堿的含量可作為奶牛應(yīng)對代謝應(yīng)激的生物標(biāo)志物[52]。眾所周知，血漿中酮體(丙酮、乙酰乙酸和BHBA)與被動(dòng)員的體脂肪的不完全β-氧化有關(guān)[53]，從而引發(fā)酮病。因此，血漿和牛乳中的酮體都可作為診斷泌乳期奶牛臨床型酮病或亞臨床型酮病的生物標(biāo)志物[54-55]。Xu等[29]采用代謝組學(xué)技術(shù)分析了牛乳中差異性代謝物，發(fā)現(xiàn)牛乳中高含量的甘氨酸和低含量的膽堿與泌乳奶牛的能量負(fù)平衡有一定關(guān)系，可以作為診斷奶牛酮病的生物標(biāo)志物。

3.3 尿液代謝組學(xué)分析

采用代謝組學(xué)技術(shù)分析尿液差異性代謝物可以反映出動(dòng)物機(jī)體代謝與飼糧之間的相互關(guān)系。為了區(qū)分酮病奶牛與健康奶牛，采用NMR和質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)識別尿液中的代謝特征物，發(fā)現(xiàn)某些脂肪酸(C5-M-DC、C18∶2、C14∶1-OH、C16∶2)和甘油磷脂(PC aa C36∶4、PC ae C42∶1、PC ae C30∶2、PC aa C40∶4、PC aa C38∶3)可作為酮病發(fā)病早期的生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物有可能便于更早地診斷出分娩后易患酮病的奶牛，也可作為早期酮病生物標(biāo)志物來區(qū)分酮病奶牛和健康奶牛[56]。在肝組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，精氨酸酶活性在酮病奶牛中降低[57]。Xu等[57]研究發(fā)現(xiàn)，酮病奶牛肝臟中精氨酸酶活性的下調(diào)抑制了精氨酸的降解，Zhang等[56]的研究結(jié)果與此研究結(jié)果一致。此外，Zhang等[56]還發(fā)現(xiàn)尿液中不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)和對稱二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginine，SDMA)的含量在1個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上有所增加，特別是在分娩前8周和分娩前4周，ADMA和SDMA都是精氨酸的類似物。目前，SDMA已被用作腎功能和腎小球過濾的診斷生物標(biāo)志物[58]，而奶牛尿液中的ADMA/SDMA和L-精氨酸/ADMA的比值被用于區(qū)分健康奶牛和酮病奶牛[56]。

4 小結(jié)與展望

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，基于代謝組學(xué)的動(dòng)物營養(yǎng)代謝病研究還有待進(jìn)一步探究，采用動(dòng)物體液代謝生物標(biāo)志物解析營養(yǎng)代謝病的發(fā)病機(jī)制或許是揭示動(dòng)物代謝病發(fā)病機(jī)制的一種有效途徑。奶牛酮病的發(fā)病機(jī)制涉及多種致病因素(病理生理學(xué)、基因組學(xué)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、營養(yǎng)調(diào)控等)，以往的研究也涉及了多個(gè)方面，但一般只針對酮病某一代謝途徑或致病因素研究，盡管結(jié)果為奶牛酮病的代謝提供了一定的研究思路，但也存在一定的不足之處。

近年來，隨著代謝組學(xué)技術(shù)在闡明疾病發(fā)病機(jī)理、臨床疾病診斷和檢測疾病的治療情況等方面的研究報(bào)道逐漸增多，代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和臨床科研已成為各國科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。利用1H-NMR和GC/MS技術(shù)檢測臨床型酮病奶牛、亞臨床型酮病奶牛和健康奶牛的血漿、奶樣和尿樣，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，能夠全景式地展現(xiàn)出酮病奶牛體液特征代謝譜，獲得組間差異性代謝物，為研究奶牛酮病的發(fā)病機(jī)理，探索酮病奶牛的病理狀態(tài)和環(huán)境因素之間的關(guān)系提供了新的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，并具有極高的科學(xué)研究價(jià)值。