番鴨盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)及其發(fā)育性變化研究

申 宇 楊 華 樊 倩 許旖旎 肖英平 孫楊贏 呂文濤*

(1.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州 310021；2.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，寧波 315800)

我國是肉鴨生產(chǎn)和消費(fèi)大國，2020年肉鴨出欄量為40.72億羽[1]。肉鴨品種主要包括北京鴨、櫻桃谷鴨、番鴨等，其中番鴨原產(chǎn)于中南美洲的熱帶森林，17世紀(jì)傳入中國，成為水禽養(yǎng)殖業(yè)中的重要品種[2]。相較于其他肉鴨品種，番鴨具有較強(qiáng)的覓食能力和抗熱耐寒能力[3]。番鴨的瘦肉含量為產(chǎn)肉量的82%～85%[4]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。家禽腸道中有大量的微生物生存，能調(diào)控機(jī)體的生長發(fā)育、免疫和抗應(yīng)激等[6-7]。真菌(fungus)是腸道微生物的重要組成部分，是具有真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物，在《真菌詞典》(2010年版)中記錄在冊的真菌種類約10萬種[8-9]。但與腸道細(xì)菌相比，真菌的菌群結(jié)構(gòu)較簡單、相對豐度較低[10]。真菌在人體腸道微生物中的占比不到1%，卻是重要組成部分，與抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)和炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)等疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，同時(shí)在維持腸道微生態(tài)穩(wěn)態(tài)和機(jī)體健康方面發(fā)揮著重要作用[11]。白色念球菌屬、毛霉菌屬(Mucor)、念珠菌屬等真菌會引發(fā)禽類的真菌性炎癥，從而造成養(yǎng)殖業(yè)的損失[12-13]。部分酵母菌可能與家禽體內(nèi)的假單胞菌、克雷伯氏菌和沙門氏菌等病原體結(jié)合，刺激免疫系統(tǒng)，從而減少病原體[14]。只有清楚家禽各生長階段的真菌菌群變化，才能提前對一些疾病采取預(yù)防措施，最大程度地降低損失。目前，大多關(guān)于鴨腸道微生物的研究是針對腸道中的細(xì)菌開展的，對于鴨腸道中真菌的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以番鴨為研究對象，揭示其腸道中真菌菌群結(jié)構(gòu)及其發(fā)育性變化，擴(kuò)展對番鴨腸道中真菌菌群多樣性的認(rèn)識，進(jìn)一步為番鴨腸道真菌與生長發(fā)育關(guān)系的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

番鴨由浙江省蘭溪市禾旺禽業(yè)專業(yè)合作社提供，在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)房進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)選用1日齡健康番鴨70只，體重為(49.28±1.45)g，在相同環(huán)境下飼養(yǎng)70 d。分別在番鴨1、3、7、14、28、42和70日齡時(shí)，每組隨機(jī)選取6只番鴨，測定體重后屠宰取盲腸內(nèi)容物，提取盲腸內(nèi)容物中真菌DNA用于真菌菌群結(jié)構(gòu)測序分析。

番鴨在3日齡內(nèi)需晝夜24 h光照，28日齡后進(jìn)行自然光照，同時(shí)利用紅外線燈加熱保溫。1～3日齡舍溫30～33 ℃，3日齡后舍溫每天降0.5 ℃，14～21日齡舍溫在21 ℃左右，之后逐日降至室溫[15]。常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由飲水和采食。飼糧為全價(jià)配合飼料(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號：Q31/0117000507C003)[16]，飼糧營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 真菌菌群結(jié)構(gòu)測序分析

1.2.1 DNA的提取及擴(kuò)增

采用QIAGEN試劑盒提取番鴨盲腸內(nèi)容物微生物組DNA。以提取的DNA為模板，用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)2的上游引物(5′-GTGAATCATCGAATCTTTGAA-3′)和下游引物(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對番鴨盲腸內(nèi)容物真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

采用Illumina測序技術(shù)對番鴨盲腸內(nèi)容物中真菌ITS的ITS2區(qū)域進(jìn)行測序，再用QIIME軟件對序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾，得到高質(zhì)量的DNA序列[17]。根據(jù)相似性不小于97%的原則將通過質(zhì)控的有效序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)[18]，并利用QIIME軟件計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、Chao1指數(shù)(Chao1 index)和辛普森指數(shù)(Simpson index)。基于分類學(xué)信息，分別在門、屬水平上進(jìn)行番鴨盲腸內(nèi)容物真菌菌群結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)與分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行分析并使用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡番鴨的體重變化

番鴨在70日齡內(nèi)體重變化明顯，體重逐漸增加(圖1)。通過分析番鴨體重變化的趨勢發(fā)現(xiàn)，1～7日齡，相對生長速度緩慢；7～14日齡，相對生長速度加快；14～70日齡，相對生長速度明顯加快(圖2)。

D1：1日齡 1 day of age；D3：3日齡 3 days of age；D7：7日齡 7 days of age；D14：14日齡 14 days of age；D28：28日齡 28 days of age；D42：42日齡 42 days of age；D70：70日齡 70 days of age。下圖同 the same as below。

圖2 不同日齡番鴨相對生長速度

2.2 不同日齡番鴨盲腸內(nèi)真菌菌群多樣性分析

2.2.1 番鴨真菌菌群α多樣性分析

由表2可知，番鴨盲腸真菌香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)在42日齡時(shí)最高，顯著高于3、7、14、28日齡(P<0.05)；Chao1指數(shù)在42日齡時(shí)最低，顯著低于1、3、7日齡(P<0.05)。

表2 不同日齡番鴨盲腸真菌菌群α多樣性指數(shù)

2.2.2 主坐標(biāo)分析(PCoA)

為了明確比較番鴨盲腸真菌微生物之間的相似性，進(jìn)行了基于微生物組基因圖譜的β多樣性分析，并使用PCoA可視化。圖3顯示番鴨在1、3、7日齡時(shí)盲腸菌群結(jié)構(gòu)相近；28日齡時(shí)盲腸菌群結(jié)構(gòu)向14日齡時(shí)盲腸菌群結(jié)構(gòu)靠攏；42日齡時(shí)盲腸菌群結(jié)構(gòu)相對于其他日齡的布較離散，說明42日齡與其他日齡之間菌群組成差異較大；70日齡時(shí)盲腸菌群結(jié)構(gòu)與其他日齡的分布更加離散，說明70日齡與其他日齡之間菌群組成差異更大。由此可知，不同日齡番鴨盲腸菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。

圖3 不同日齡番鴨盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)PCoA

2.3 不同日齡番鴨盲腸真菌結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 番鴨盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)

通過對不同分類學(xué)水平上的真菌相對豐度進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同日齡番鴨盲腸真菌相對豐度不同(圖4)。

進(jìn)化樹顯示了番鴨盲腸真菌微生物在門水平和屬水平的相對豐度變化。最外面的環(huán)按門著色，里面的環(huán)和標(biāo)簽按門選擇性著色。圈最外側(cè)的點(diǎn)代表在不同日齡中不同菌屬的相對豐度大小。

2.3.2 番鴨盲腸真菌相對豐度變化

為探究番鴨盲腸真菌在不同分類學(xué)水平上的物種組成比例情況和群落結(jié)構(gòu)，分析了門和屬水平盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)的組成及變化。圖5總結(jié)了門水平上代表性真菌微生物相對豐度的變化，在飼喂的70 d內(nèi)，番鴨盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)主要由子囊菌門(Ascomycota)與擔(dān)子菌門(Basidiomycota)組成，2個(gè)菌門占比95%以上，為門水平上優(yōu)勢菌門。子囊菌門相對豐度在1～14日齡內(nèi)從77.5%上升至93.39%，14～70日齡下降至42.05%，其中以14日齡的相對豐度最高；擔(dān)子菌門的相對豐度在1～14日齡內(nèi)從18.38%下降至6.22%，14～70日齡上升至54.85%。

圖5總結(jié)了屬水平上真菌微生物相對豐度的變化，1日齡時(shí)，番鴨盲腸菌群主要由小戴維霉屬(Davidiella)和念球菌屬(Candida)組成；3日齡時(shí)，赤霉菌屬(Gibberella)和小戴維霉屬為盲腸優(yōu)勢菌屬；7～14日齡時(shí)，念球菌屬和赤霉菌屬為盲腸優(yōu)勢菌屬；28日齡時(shí)，念球菌屬成為盲腸第1優(yōu)勢菌屬；42日齡時(shí)，赤霉菌屬和念球菌屬不再是盲腸優(yōu)勢菌屬，小戴維霉屬和毛芽孢子菌屬(Trichosporon)的相對豐度增加；70日齡時(shí)番鴨盲腸微生物以紅酵母菌屬(Rhodotorula)、毛芽孢子菌屬和赤霉菌屬為優(yōu)勢菌屬，其中紅酵母菌屬的相對豐度明顯增加。德巴利酵母屬(Debaryomyces)在1～14日齡相對其他日齡占比較大，14日齡后相對豐度逐漸降低。

Ascomycota：子囊菌門；Basidiomycota：擔(dān)子菌門；Zygomycota：接合菌門；Chytridiomycota：壺菌門；Glomeromycota：球囊菌門；Candida：念球菌屬；Gibberella：赤霉菌屬；Davidiella：小戴維霉屬；Rhodotorula：紅酵母菌屬；Trichosporon：毛芽孢子菌屬；Malassezia：馬拉色菌屬；Debaryomyces：德巴利酵母屬；Sterigmatomyces：梗孢酵母菌屬；Cryptococcus：隱球菌屬；Acremonium：頂孢菌屬；Others：其他。

2.4 不同日齡番鴨真菌菌群發(fā)育性變化

2.4.1 番鴨盲腸中真菌菌群結(jié)構(gòu)差異分析

為探究番鴨盲腸真菌在屬水平上相對豐度的差異性，進(jìn)行了效應(yīng)大小測量(LEfSe)分析。結(jié)果顯示，15、10、6、21、6、16和24個(gè)特征分別在1、3、7、14、28、42和70日齡中顯著不同(P<0.05)，表明7組之間的分類存在明顯差異。在屬水平上，70日齡時(shí)的紅酵母菌屬和毛霉菌屬，7日齡時(shí)的馬拉色菌屬(Malassezia)，42日齡時(shí)的鏈格孢屬(Alternaria)，3日齡時(shí)的赤霉菌屬，28日齡時(shí)的念球菌屬，14日齡時(shí)的畢赤酵母屬(Pichia)和節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)，1日齡時(shí)的小戴維霉屬和梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)相對豐度富集并且顯著不同(P<0.05)(圖6)。

縱軸為屬水平菌種的名稱。顏色對應(yīng)不同日齡，線性判別分析(LDA)與效應(yīng)大小測量(LEfSe)相結(jié)合揭示了不同日齡之間的一系列特征。

2.4.2 番鴨盲腸中真菌屬水平熱圖分析

為進(jìn)一步探究番鴨真菌在屬水平上的結(jié)構(gòu)和相對豐度的差異，將LEfSe分析所得差異菌屬進(jìn)行熱圖分析。結(jié)果表明，番鴨盲腸真菌微生物出現(xiàn)明顯的屬間差異。盡管擁有相同的主要菌群，但它們的相對豐度差異很大。在70 d的飼喂過程中，隨著番鴨的生長發(fā)育，其盲腸中紅酵母菌屬、隱球菌屬(Cryptococcus)和念球菌屬的相對豐度顯著增加(P<0.05)，赤霉菌屬和小戴維霉屬的相對豐度顯著降低(P<0.05)(圖7)。

縱坐標(biāo)代表菌屬聚類，一行代表一個(gè)菌屬。色階代表菌屬表達(dá)相對豐度，紅色代表相對豐度升高，藍(lán)色代表相對豐度降低。

為衡量番鴨盲腸屬水平上的真菌菌群結(jié)構(gòu)和體重密切程度，通過Spearman相關(guān)分析從高相對豐度的真菌中篩選后，進(jìn)行了相關(guān)性分析。其中，毛芽孢子菌屬、耐干霉菌屬(Xeromyces)和紅酵母菌屬相對豐度與體重的相關(guān)關(guān)系較強(qiáng)，而木拉克酵母菌屬(Mrakia)、圓孢菌屬(Torulaspora)和宙斯沸耳菌屬(Dioszegia)相對豐度與體重的相關(guān)關(guān)系較弱(圖8)。

黃色點(diǎn)代表體重，紅色點(diǎn)代表真菌菌屬。線粗細(xì)代表相關(guān)關(guān)系強(qiáng)弱，越粗代表相關(guān)絕對值越大；點(diǎn)的數(shù)量代表相關(guān)對象個(gè)數(shù)多少。

3 討 論

人類和動物腸道中最常見的真菌屬有酵母菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、枝孢菌屬、青霉菌屬、馬拉色菌屬和金黃色葡萄球菌屬等[19-20]。腸道真菌可以促進(jìn)機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消耗，并通過產(chǎn)生酶和維生素來幫助消化[21]。最近在小鼠和人上的研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了真菌在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和系統(tǒng)免疫中的關(guān)鍵作用，例如酵母布拉氏酵母菌作為益生菌被廣泛用作預(yù)防和治療腸道并發(fā)癥[22-23]。在早期斷奶仔豬的飼糧中添加釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可有效提高斷奶仔豬的腸道發(fā)育和全身免疫力[24]。研究表明，腸道真菌生態(tài)失調(diào)與感染性腸炎(infective colitis，IC)和IBD等腸道疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[25]。Shuai等[26]通過對不同年齡段人群的腸道真菌分析后，發(fā)現(xiàn)腸道真菌組成主要由年齡決定，并隨時(shí)間變化穩(wěn)定。在本試驗(yàn)中，我們揭示了不同日齡番鴨盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)及相對豐度變化。本研究中，α多樣性分析表明，番鴨盲腸真菌香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)大致呈先降低，在42日齡時(shí)升高后再降低，番鴨盲腸內(nèi)真菌Chao1指數(shù)呈先降低后升高的趨勢[16]，結(jié)果說明了番鴨盲腸真菌菌群多樣性隨日齡增長逐漸升高。溫雪婷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞中最高體重組的真菌菌群多樣性最高，與本研究結(jié)果一致。Wang等[27]對牦牛所有發(fā)育階段的真菌群落變化研究發(fā)現(xiàn)，真菌群落相對豐度和多樣性的α指數(shù)隨著年齡的增長而顯著增加。擔(dān)子菌門和子囊菌門一起被歸入Dikarya分支[28]，代表了真菌界的主要門。通過對番鴨盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，子囊菌門與擔(dān)子菌門為主要優(yōu)勢菌門，2個(gè)菌門占比在95%以上，與Robinson等[11]研究結(jié)果一致。子囊菌門是迄今為止真菌界最大的群體[29-30]。本研究表明在番鴨的生長發(fā)育過程中，子囊菌門一直處于優(yōu)勢菌門的地位，但在70日齡時(shí)，相對豐度顯著降低并且占比低于擔(dān)子菌門。在屬水平上，念球菌屬、赤霉菌屬是番鴨盲腸中相對豐度最高的菌屬。本研究結(jié)果表明，42～70日齡的盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)與1～28日齡的盲腸真菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大。Roemer等[31]研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能低下的個(gè)體極易被念球菌屬所感染，隨著番鴨的生長發(fā)育，其免疫系統(tǒng)也在不斷的完善。因此通過餅圖可知，42日齡時(shí)中赤霉菌屬和念球菌屬不再是盲腸優(yōu)勢菌屬，且小戴維霉屬和毛芽孢子菌屬的相對豐度增加。70日齡時(shí)盲腸微生物以紅酵母菌屬、毛芽孢子菌屬和赤霉菌屬為優(yōu)勢菌屬，其中紅酵母菌屬的相對豐度明顯增加。蛋雞飼養(yǎng)研究證實(shí)[30]，紅酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物是一種非常有效的微生物蛋黃增色劑，這說明紅酵母屬對禽蛋質(zhì)量和產(chǎn)業(yè)發(fā)展起著重要的作用。有研究表明，毛孢子菌與臨床疾病有關(guān)，如貓的皮炎、鼻炎和膀胱炎等[31]。在本研究中，德巴利酵母屬在1和14日齡相對其他日齡占比較大，14日齡后相對豐度顯著降低。有研究表明，漢氏德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)可以通過細(xì)胞分化和增殖提高存活率、生長性能，刺激消化功能和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的能力[32]。

通過熱圖可知，隨著日齡的增長，曲霉菌屬(Aspergillus)的相對豐度降低，紅酵母菌屬的相對豐度升高。有研究證實(shí)，曲霉菌屬會引發(fā)腸道真菌性炎癥和曲霉菌性肺炎，其相對豐度會隨著機(jī)體體重的增加而降低[33-35],與本研究結(jié)果一致。通過相關(guān)關(guān)系圖可知，紅酵母菌屬的相對豐度與體重可能存在相關(guān)性，但仍需試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證?？讘c輝等[36]研究發(fā)現(xiàn)，隨著藏仔豬的生長發(fā)育，酵母菌科的相對豐度升高，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相近。發(fā)育過程中，大多數(shù)優(yōu)勢真菌的相對豐度結(jié)構(gòu)會表現(xiàn)出“波動”的動態(tài)模式[37]。在屬水平上，42～70周齡的番鴨盲腸中真菌的相對豐度大于其他日齡，這說明隨著番鴨發(fā)育時(shí)間的增加，其盲腸真菌的相對豐度也會不斷增長。相關(guān)性研究也進(jìn)一步說明了不同真菌成分可能影響番鴨的體重，揭示了其在番鴨生長過程中扮演的重要角色。綜上所述可知，番鴨盲腸中的真菌種類豐富多樣。本試驗(yàn)初步探討了番鴨盲腸真菌的結(jié)構(gòu)組成，其優(yōu)勢菌屬和核心菌群及其功能的驗(yàn)證還需要進(jìn)一步的探究。

4 結(jié) 論

① 番鴨盲腸真菌菌群多樣性隨日齡增長逐漸升高。

② 在門水平上，不同日齡的盲腸優(yōu)勢菌門均為子囊菌門與擔(dān)子菌門；在屬水平上，盲腸菌群結(jié)構(gòu)呈發(fā)育性變化。3～7日齡時(shí)，盲腸優(yōu)勢菌屬為赤霉菌屬、念球菌屬和小戴維霉屬；14～28日齡時(shí)，優(yōu)勢菌屬為赤霉菌屬和念球菌屬；70日齡時(shí)，以紅酵母菌屬、毛芽孢子菌屬和赤霉菌屬為優(yōu)勢菌屬。

③ 紅酵母菌屬的相對豐度與體重可能存在相關(guān)性，未來仍需通過驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。