花椒粉對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血漿生化指標和盲腸菌群的影響

郭衍新 汪德華 黃世猛 楊博文 李 森 李 瀾 趙麗紅 張建云 計 成 馬秋剛*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.河北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，保定 071000)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是蕓香科、花椒屬中的落葉灌木或小喬木，別名為大椒、秦椒、蜀椒或山椒，在我國各地均有分布，其干燥成熟果皮是我國傳統(tǒng)的香辛料之一[1]?！侗静菥V目》中記載花椒“性溫、味苦，散寒除濕，解郁結，消宿食，通三焦，溫脾胃，補右腎命門，殺蛔蟲，止泄瀉”。我國是花椒第一大生產(chǎn)國，栽培面積已達100萬hm2，花椒作為傳統(tǒng)香辛料在食品工業(yè)被廣泛應用。研究表明，飼糧中添加0.3%花椒粉可以改善蛋品質(zhì)量[2]，但其對蛋雞生產(chǎn)性能的影響尚未見報道。花椒主要活性成分為花椒精油、酚類、黃酮、生物堿和木脂素等[3]，具有通絡活血、降血脂以及降膽固醇等重要生理調(diào)節(jié)功能[4]，但其在蛋雞生產(chǎn)中的應用效果還有待驗證。因此，本研究旨在探討蛋雞飼糧中添加花椒粉對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血漿生化指標和盲腸菌群的影響，為花椒作為一種新型飼糧原料的研究與開發(fā)利用提供科學的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用原產(chǎn)地域保護產(chǎn)品——韓城大紅袍花椒，其揮發(fā)油含量保證值≥6.0%，醚溶解物含量保證值≥8.88%(國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局公告2004年第114號，2004-08-31)；其中，揮發(fā)油主要成分包括檸檬烯、(R)-4-甲基-1-異丙基-3-環(huán)己烯-1-醇、β-月桂烯、γ-松油烯、β-水芹烯和芳樟醇等。花椒采購自河北省保定市涿州市香辛料市場，粉碎后過20目篩備用。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素試驗設計，選取50周齡“京粉1號”蛋雞30只[初始產(chǎn)蛋率差異不顯著(P>0.05)]，隨機分為對照組和試驗組，每組15個重復，每個重復1只雞。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧，試驗組飼喂在基礎飼糧基礎上添加0.5%花椒粉的飼糧。試驗預試期1周，正試期8周。基礎飼糧參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在中國農(nóng)業(yè)大學涿州試驗基地進行，采用封閉式雞舍，3層階梯式籠養(yǎng)，每只雞于每天07：30飼喂，飼喂量為110 g/d，乳頭飲水器自由飲水，每周末截料稱重1次。雞舍內(nèi)采用縱向負壓式通風，溫度為18～25 ℃，相對濕度為50%～60%，每日光照16 h，光照強度16 lx。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)

以重復為單位，每天準確記錄產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重，計算產(chǎn)蛋率、平均日產(chǎn)蛋量和平均蛋重；于每周末統(tǒng)計1次耗料量，計算平均日采食量和料蛋比。計算公式如下：

產(chǎn)蛋率=試驗期內(nèi)產(chǎn)蛋總數(shù)/(試驗天數(shù)×每個重復蛋雞數(shù))；平均日產(chǎn)蛋量=試驗期內(nèi)產(chǎn)蛋總重/(試驗天數(shù)×每個重復蛋雞數(shù))；平均蛋重=試驗期內(nèi)產(chǎn)蛋總重/試驗期內(nèi)產(chǎn)蛋總數(shù)；料蛋比=總耗料量/總產(chǎn)蛋量；平均日采食量=總耗料量/(試驗天數(shù)×每個重復蛋雞數(shù))。

在第58周齡的最后3 d，收集所有雞蛋用于蛋品質(zhì)測定(30枚/組)，包括蛋重、蛋殼顏色(鈍、中、銳)、蛋殼強度、蛋殼厚度(鈍、中、銳)和哈夫單位等。用蛋殼厚度測定儀(ESTG-1)測定蛋殼厚度，用蛋殼強度測定儀測定蛋殼強度，用全自動蛋品質(zhì)分析儀測定哈夫單位和蛋重(以上儀器均購自Oka Technology公司)，用蛋殼顏色測量儀(QCR)測定蛋殼顏色(鈍、中、銳)。

哈夫單位=100×lg(H-1.7×W0.37+7.57)。

式中：H為濃蛋白高度(mm)；W為蛋重(g)。

1.4.2 血漿指標

飼養(yǎng)試驗結束時，每個組隨機選擇6只接近于平均體重的蛋雞，供水禁飼12 h后，翅靜脈采血于肝素鈉抗凝管中，3 500 r/min、離心15 min制備血漿樣品，于-20 ℃保存。血漿生化指標[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性，總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)和球蛋白(globulin，GLB)含量]以及白球比(albumin to globulin ratio，AGR)]和血漿免疫指標[免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量]均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定；血漿細胞因子[白細胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]含量采取酶標儀進行酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定。

1.4.3 盲腸菌群16S rDNA測序

試驗結束當天，在盲腸盲端使用載玻片取出腸段內(nèi)容物于凍存管中，立即投入液氮速凍，然后置于-80 ℃保存。DNA提取、PCR擴增及Ion S5 XL測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成，生物信息學分析是根據(jù)北京諾禾致源股份有限公司給出的原始序列、有效序列等信息，進行操作分類單元(OTU)聚類與注釋和微生物多樣性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2016進行整理匯總，采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用t檢驗比較組間差異顯著性，結果用平均值和均值標準誤(SEM)表示，以P<0.05和0.05≤P<0.10分別作為差異顯著和具有顯著性趨勢的判斷標準。組間微生物群落采用相似性分析(ANOSIM)和多反應置換程序(MRPP)等進行差異顯著性檢驗，組間差異物種分析采取t檢驗和LEfSe等方法。

2 結果與分析

2.1 花椒粉對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響

由表2可知，與對照組相比，試驗組蛋雞料蛋比顯著降低(P<0.05)，其他生產(chǎn)性能指標無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，試驗組蛋殼顏色有提高趨勢(P=0.08)，蛋殼強度有降低趨勢(P=0.08)。

表2 花椒粉對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響

2.2 花椒粉對蛋雞血漿生化指標的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗組蛋雞血漿ALB含量顯著提高(P<0.05)，血漿AGR顯著提高(P<0.05)，其他血漿生化指標無顯著差異(P>0.05)。

表3 花椒粉對蛋雞血漿生化指標的影響

2.3 花椒粉對蛋雞血漿免疫指標和細胞因子含量的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗組蛋雞血漿IgA與IgM含量有降低趨勢(P=0.09)，血漿IgG含量無顯著差異(P>0.05)；試驗組蛋雞血漿TNF-α和IL-10含量無顯著差異(P>0.05)。

表4 花椒粉對蛋雞血漿免疫指標和細胞因子含量的影響

2.4 花椒粉對蛋雞盲腸菌群組成的影響

由圖1可知，與對照組相比，試驗組蛋雞盲腸菌群α多樣性中的Ace指數(shù)(圖1-A)、Chao指數(shù)(圖1-B)、Shannon指數(shù)(圖1-C)和Sobs指數(shù)(圖1-D)差異均不顯著(P>0.05)。主坐標分析(PCoA，圖1-E)顯示，用于反映盲腸菌群結構的β多樣性中，試驗組與對照組無顯著差異(P>0.05)。

在門水平上(圖1-F)，與對照組相比，試驗組蛋雞盲腸菌群中厚壁菌門(Firmicutes)/擬桿菌門(Bacteroidota)值升高，變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteriota)相對豐度明顯降低。在屬水平上(圖1-G)，與對照組相比，試驗組蛋雞盲腸菌群中未分類擬桿菌目(unclassified_o_Bacteroidales)和Romboutsia相對豐度升高，乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度降低。

Bacteroidota：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Desulfobacterota：脫硫菌門；Actinobacteriota：放線菌門；Others：其他；Bacteroides：擬桿菌屬；unclassified_o_Bacteroidales：未分類擬桿菌目；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Lactobacillus：乳桿菌屬；Shewanella：希瓦氏菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；unclassified_f_Rikenellaceae：未分類理研菌科；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；unclassified_c_Bacteroidia：未分類擬桿菌綱；unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類毛螺菌科；unclassified_f_Oscillospiraceae：未分類顫螺菌科；Vibrio：弧菌屬；Campylobacter：彎曲菌屬。

2.5 蛋雞盲腸優(yōu)勢菌群差異物種分析

由圖2可知，與試驗組相比，對照組蛋雞盲腸差異優(yōu)勢菌主要富集有Hydrogenoanaerobacterium、密螺旋體屬(Treponema)、norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group、未分類互營單胞菌科(unclassified_f_Syntrophomonadaceae)、Methylobacterium-Methylorubrum、Elusimicrobium和厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)。與對照組相比，試驗組蛋雞盲腸差異優(yōu)勢菌主要富集了norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group、彎曲菌屬(Campylobacter)、norank_f_norank_o_Saccharimonadales、嚴格梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、norank_f_Christensenellaceae、Family_ⅩⅢ_AD3011_group和Angelakisella。

Treponema：密螺旋體屬；unclassified_f_Syntrophomonadaceae：未分類互營單胞菌科；Anaerobiospirillum：厭氧螺菌屬；Campylobacter：彎曲菌屬；Clostridium_sensu_stricto_1：嚴格梭菌屬1。

3 討 論

3.1 花椒粉對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響

本試驗結果顯示，與對照組相比，試驗組蛋雞料蛋比顯著降低。有關花椒粉對雞生產(chǎn)性能的影響還未見文獻報道。但有研究表明，花椒籽粉能夠提高蛋雞平均蛋重和產(chǎn)蛋量等[5]。而花椒籽是成熟的花椒果實采收后，與果皮分離之后的花椒種子，是花椒的主要副產(chǎn)物[6]。李會洲等[7]、張玉海[8]研究表明，在基礎飼糧中添加5%花椒籽粉對蛋雞產(chǎn)蛋性能有顯著提高作用。在本研究中，采用的是花椒果皮粉碎后的產(chǎn)品，其對蛋雞生產(chǎn)性能的改善，可能與花椒中含有的揮發(fā)油和醇類化合物等活性成分的生物學作用有關?；ń饭?、花椒籽的活性成分存在極大差異。王學輝[9]報道，花椒籽中揮發(fā)性油主要成分是一種天然的驅(qū)蟲劑亞乙基二磷酸四乙酯，含量高達74.22%，其他成分還包括少量的左旋香檜烯、4-甲基-1-環(huán)己烯、1,8-桉葉素以及2-羥基-4,6-二甲氧基苯乙酮等。黃森等[10]報道，花椒果皮的揮發(fā)性油含量最多的是檸檬烯，含量高達25.58%，其他還有(R)-4-甲基-1-異丙基-3-環(huán)己烯-1-醇(13.38%)、β-月桂烯(6.92%)、γ-松油烯(4.76%)、β-水芹烯(3.81%)和芳樟醇(3.35%)等。因此，二者的生物活性可能存在很大差異。由此可見，蛋雞生產(chǎn)性能的整體改善，可能歸因于花椒中含有的活性成分如烯烴類揮發(fā)油和醇類化合物、酰胺等活性物質(zhì)，它們可能是通過影響雞只的腸道、肝臟和生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)來改善機體性能，從而提高生產(chǎn)性能。

蛋殼顏色是由沉積在蛋殼外表面的色素含量決定的，構成蛋殼顏色的色素成分主要包括原卟啉-Ⅸ、膽綠素-Ⅸ以及膽綠素的鋅螯合物等[11]。有研究報道，飼糧中鐵含量對于蛋殼顏色具有顯著影響，其作用機理可能是通過影響原卟啉-Ⅸ/血紅素的生成和轉(zhuǎn)運發(fā)揮作用[12]。白建[2]報道，飼糧添加0.3%花椒粉可以改善羅曼褐雞蛋的蛋殼顏色，這與本研究結果一致。其原因可能是花椒中的活性物質(zhì)促進了腸道對鐵的吸收，或者改善了蛋殼腺上皮細胞分泌原卟啉-Ⅸ的機能，但具體機制有待進一步研究。本研究結果還顯示，試驗組蛋殼強度較對照組有降低趨勢，可能是由于試驗組蛋雞產(chǎn)蛋性能如產(chǎn)蛋率、平均日產(chǎn)蛋量和平均蛋重較對照組有所提高，蛋雞在高生產(chǎn)性能條件下，對飼糧中的鈣等礦物質(zhì)水平的需求會更高，而在基礎飼糧中添加0.5%花椒粉的試驗飼糧，不能滿足蛋雞較高生產(chǎn)性能時對鈣等的營養(yǎng)需求(根據(jù)本試驗料蛋比等數(shù)據(jù)計算，對照組、試驗組每生產(chǎn)1 kg雞蛋攝入的鈣含量分別為76.2和70.8 g，試驗組約為對照組的93%)，因此建議配制含有花椒粉的飼糧時應該適當增加飼糧鈣含量。

3.2 花椒粉對蛋雞血漿生化指標的影響

ALB是血清蛋白質(zhì)的主要成分之一，其含量與炎癥過程呈負相關[13]。低蛋白血癥歷來是營養(yǎng)不良的一個重要指標，被視為炎癥的生物標志物[14]。本試驗中，試驗組蛋雞血漿ALB含量較對照組顯著提高，這表明試驗組蛋雞的蛋白質(zhì)代謝更加旺盛，具有較低炎癥水平。研究表明，GLB和AGR是肝功能測試中的重要生物標志物[15]。血清GLB含量在炎癥過程中隨之增加[16]。本試驗中，試驗組蛋雞血漿GLB含量低于對照組，表明機體內(nèi)環(huán)境處于良好的平衡狀態(tài)，這意味著免疫器官不需要分泌過多的免疫球蛋白來防止抗原入侵機體細胞。

3.3 花椒粉對蛋雞血漿免疫指標和細胞因子含量的影響

Shimizu等[17]認為AGR作為重要的一類炎癥標志物，較高AGR有利于機體對抗炎癥。在本試驗中，飼糧添加0.5%花椒粉使得蛋雞血漿AGR顯著升高，血漿免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)含量均有所降低。這表明花椒粉能夠增強蛋雞自身的抗應激能力，減少機體免疫器官免疫球蛋白的過多分泌，增加產(chǎn)蛋雞體內(nèi)ALB的分泌量，從而使雞只的產(chǎn)蛋性能得以改善。本研究結果還顯示，試驗組蛋雞血漿TNF-α含量低于對照組，這與韋琳等[18]的研究結果基本相符，花椒精油能通過降低小鼠體內(nèi)TNF-α含量發(fā)揮抗炎作用。

3.4 花椒粉對蛋雞盲腸菌群的影響

3.4.1 花椒粉對蛋雞盲腸菌群組成的影響

腸道菌群是由數(shù)百種不同微生物組成的復雜群落，腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主腸道健康、營養(yǎng)消化和免疫功能方面均發(fā)揮著重要作用[19]。因此，腸道菌群在維持腸道健康方面起著至關重要的作用，并影響雞只生產(chǎn)性能的表現(xiàn)。大量研究表明，花椒精油、花椒多酚和生物堿等具有較強的抗菌活性[20]；花椒油能夠促進大鼠腸道健康[21]，花椒麻味素和生物堿可以改善鼠腸道穩(wěn)態(tài)[22]，提示花椒中多種成分均具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的功效。本研究結果表明，在門水平上，試驗組蛋雞盲腸菌群中厚壁菌門/擬桿菌門值升高。研究表明，成年蛋雞在門水平上的代表性微生物群落為厚壁菌門，其次是擬桿菌門等[23]。此外，有研究報道，擬桿菌門與雞只的脂肪積累有關，不利于機體健康[24]。本試驗與上述研究結果相符。本研究結果還顯示，試驗組蛋雞盲腸菌群中變形菌門和放線菌門相對豐度下降。有研究證實，變形菌門中含有較多致病菌，對動物健康和生產(chǎn)性能會造成負面影響[25]；并且放線菌門中菌屬多數(shù)為致病菌，不利于腸道菌群多樣性及腸道穩(wěn)態(tài)。在屬水平上，與對照組相比，試驗組蛋雞盲腸菌群中未分類擬桿菌目和Romboutsia相對豐度水平升高，乳桿菌屬相對豐度下降。菌群相關性分析表明，未分類擬桿菌目與蛋雞生產(chǎn)性能顯著呈正相關[26]。Romboutsia作為一種可用的腸道生物標志物，在維持宿主健康方面起著關鍵作用[27]。此外，乳酸桿菌在超重或肥胖個體中大量存在，與血清超敏C反應蛋白(hs-CRP)呈正相關，提示存在有“低度”炎癥[28]。綜上所述，試驗組蛋雞盲腸菌群中厚壁菌門、未分類擬桿菌目和Romboutsia相對豐度升高，變形菌門和乳桿菌屬相對豐度降低，有利于蛋雞維持腸道穩(wěn)態(tài)與宿主代謝。

3.4.2 花椒粉對蛋雞盲腸菌群差異物種的影響

本研究結果顯示，對照組蛋雞盲腸差異優(yōu)勢菌主要富集有Hydrogenoanaerobacterium、密螺旋體屬、norank_f_norank_o_Clostridia_vadinBB60_group、未分類互營單胞菌科、Methylobacterium-Methylorubrum、Elusimicrobium和厭氧螺菌屬，試驗組蛋雞盲腸差異優(yōu)勢菌主要富集了norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group、彎曲菌屬、norank_f_norank_o_Saccharimonadales、嚴格梭菌屬1、norank_f_Christensenellaceae、Family_ⅩⅢ_AD3011_group和Angelakisella。研究表明，密螺旋體屬被稱為“隱形病原體”，因為它的外膜脫落，大部分由非免疫原性跨膜蛋白組成[29]。厭氧螺菌屬是一種潛在致病菌，可能會導致健康受損的成年人患腹瀉病[30]。厚壁菌門中的Hydrogenoanaerobacterium與體重和平均日增重呈正相關關系，容易導致一系列疾病[31]。未分類互營單胞菌科、Methylobacterium-Methylorubrum和Elusimicrobium均為潛在致病菌，不利于蛋雞腸道菌群多樣性和腸道健康[31]。由此可見，這些有害的差異優(yōu)勢菌群富集于對照組蛋雞盲腸中，不利于生產(chǎn)后期蛋雞生產(chǎn)性能的發(fā)揮。同時，研究表明，norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group具有抗氧化和抗癌效果，有助于腸道營養(yǎng)代謝[32]。彎曲菌屬是變形菌門的一種，對腸道健康有害[33]。norank_f_norank_o_Saccharimonadales能夠改善大鼠腸道健康[34]。菌群相關性分析表明，norank_f_Christensenellaceae與蛋雞產(chǎn)蛋性能呈顯著正相關，有助于宿主腸道健康[35]。Family_ⅩⅢ_AD3011_group是一種有益菌，能夠減少機體炎癥并改善年輕男性腸道微生物群[36]。而Angelakisella能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，為宿主提供能量[37]。由此可見，試驗組蛋雞盲腸富集了彎曲菌屬這一類致病菌，同時富集了norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group、norank_f_norank_o_Saccharimonadales、norank_f_Christensenellaceae、Family_ⅩⅢ_AD3011_group和Angelakisella這一類腸道有益菌，并且試驗組富集的有益菌作為主要的優(yōu)勢菌群，其多樣性和相對豐度明顯高于致病菌，但是由于這些致病菌的存在，它們能夠與腸道有益菌競爭宿主營養(yǎng)物質(zhì)吸收，使宿主生產(chǎn)潛力不能得以充分發(fā)揮。然而，相比于對照組盲腸中所富集的大多數(shù)致病菌而言，試驗組蛋雞盲腸富集的大多數(shù)均為有益菌，有益于生產(chǎn)性能的發(fā)揮。因此，蛋雞基礎飼糧中添加0.5%花椒粉，有助于減少腸道致病菌，提高蛋雞盲腸有益菌群的豐度水平。

4 結 論

在本試驗條件下，飼糧中添加0.5%花椒粉改善了蛋雞盲腸菌群組成的多樣性和結構，增強了機體利用蛋白質(zhì)的能力和抗炎能力，提高了蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)。