飼糧添加迷迭香酸對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸菌群組成、屏障功能及炎癥反應(yīng)的影響

雷銘康 李潤林 李盼盼 吳佳慶 汪 晶* 朱偉云

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095；2.國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，南京 210095)

在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中通常對仔豬實(shí)施早期斷奶，而早期斷奶會引起仔豬強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，仔豬易出現(xiàn)腸道形態(tài)損傷、生理功能失調(diào)以及腸道微生物多樣性減少等斷奶應(yīng)激現(xiàn)象，影響仔豬腸道健康[1-3]。生產(chǎn)中通常在飼糧中添加抗生素來應(yīng)對斷奶應(yīng)激，改善腸道健康。但長時間濫用抗生素會產(chǎn)生動物體內(nèi)病原微生物耐藥性增強(qiáng)、動物免疫力下降等問題，因此亟需尋找一種新型飼料添加劑來代替抗生素緩解仔豬斷奶應(yīng)激，并在此基礎(chǔ)上維持仔豬腸道微生態(tài)穩(wěn)定，保護(hù)腸道健康。

植物提取物含有大量生物活性物質(zhì)，如生物堿、多酚、甾醇、黃酮類化合物等，因其綠色安全、高效環(huán)保的特性受到廣泛關(guān)注[4]。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一種廣泛存在于自然界多種植物中的水溶性多酚類羥基酸化合物，常見于唇形科的物種，如迷迭香、紫蘇、冬凌草等。體外研究表明RA有著高效的抑菌效應(yīng)，通過破壞金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等細(xì)菌的細(xì)胞膜，引起細(xì)菌胞內(nèi)還原糖、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)外滲，起到抑制細(xì)菌生長的作用[5-6]。而目前對于RA體內(nèi)試驗(yàn)的研究主要集中在鼠模型中。RA及主要含RA成分的紫蘇提取物在不同程度上抑制核因子-κB(NF-κB)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)基因和蛋白表達(dá)，降低促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6等含量，進(jìn)而改善葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎ICR小鼠模型相關(guān)結(jié)腸炎病變來發(fā)揮抗炎作用[7-8]。此外，在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型中，RA提高了結(jié)腸上皮閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)基因表達(dá)，通過維持正常的腸道屏障功能來阻礙結(jié)腸炎癥的發(fā)展[9]。綜上所述，RA在體外試驗(yàn)和鼠模型的體內(nèi)試驗(yàn)中均表現(xiàn)出抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等條件性致病菌增殖的作用，且有助于維持腸黏膜屏障功能，進(jìn)而緩解結(jié)腸炎癥。因此，我們推測RA可能在改善斷奶仔豬結(jié)腸屏障功能、調(diào)節(jié)結(jié)腸菌群組成以及緩解炎癥反應(yīng)方面具有較好的效果。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88(enterotoxigenicEscherichiacoliK88，ETEC K88)能夠釋放腸毒素，造成腸道微生態(tài)失衡，是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要原因之一。且在仔豬腸道中，ETEC K88能夠激活Toll樣受體(TLR)/NF-κB信號通路，增加促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6的產(chǎn)生來促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[10]，因此被廣泛用于構(gòu)建腸道損傷模型。本研究以斷奶仔豬為研究對象，通過給斷奶仔豬灌胃ETEC K88重懸液進(jìn)行攻毒，建立腸道損傷模型，研究RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸屏障功能、菌群組成及炎癥反應(yīng)的影響，為其在緩解仔豬斷奶應(yīng)激、改善腸道健康等方面的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用迷迭香酸(95%)購自于南京某生物制品有限公司，攻毒用菌種ETEC K88(CVCC224)為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院惠贈。將甘油保存的ETEC K88菌種置于LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(無瓊脂)中，于搖床中200 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h復(fù)蘇，取菌液于LB固體培養(yǎng)基(添加2%瓊脂)平板劃線接種，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選特征明顯的單個菌落進(jìn)行培養(yǎng)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算每毫升菌液中的菌落形成單位(CFU)，使用生理鹽水重懸菌液，調(diào)整濃度為109CFU/mL。

1.2 試驗(yàn)動物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用18頭遺傳相近、初始體重為(6.91±1.02)kg的健康21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，經(jīng)過3 d的預(yù)飼后，將仔豬隨機(jī)分為3組，每組6頭。飼養(yǎng)試驗(yàn)為期21 d，對照組(CON組)和ETEC K88攻毒組(K88組)仔豬飼喂基礎(chǔ)飼糧(無抗生素)，迷迭香酸組(RA組)仔豬飼喂含RA的試驗(yàn)飼糧(在基礎(chǔ)飼糧飼糧基礎(chǔ)上添加500 mg/kg RA)。試驗(yàn)第19～20天，K88組、RA組仔豬每天灌喂4 mL濃度為109CFU/mL的ETEC K88重懸液攻毒[11]，對照組仔豬則每天灌喂同等劑量的無菌生理鹽水?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參照NRC(2012)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心完成，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理規(guī)程，試驗(yàn)仔豬常規(guī)免疫程序均按相應(yīng)規(guī)定完成。試驗(yàn)期間，所有仔豬自由采食和飲水。本次動物試驗(yàn)依照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心管理制度執(zhí)行，試驗(yàn)方案經(jīng)該機(jī)構(gòu)動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測定

于試驗(yàn)第22天采用頸靜脈放血法對所有仔豬進(jìn)行屠宰，剖開腹腔采集結(jié)腸中段組織于4%多聚甲醛溶液中固定，用于檢測結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。采集結(jié)腸食糜與黏膜于2 mL無菌離心管中，放入液氮中冷凍。

1.4.1 生長性能和腹瀉情況

在正式試驗(yàn)開始和結(jié)束時分別稱取仔豬空腹體重，每日收集并記錄飼糧的供給量和剩余量，計(jì)算平均日采食量(g/d)、平均日增重(g/d)和料重比(平均日采食量/平均日增重)。參考Pierce等[12]的方法，每天觀察仔豬的腹瀉頭數(shù)并記錄腹瀉評分，計(jì)算腹瀉率和腹瀉指數(shù)，計(jì)算公式如下：

腹瀉率(%)=100×每組仔豬腹瀉總頭數(shù)/(試驗(yàn)天數(shù)×每組仔豬頭數(shù))；腹瀉指數(shù)=每組腹瀉評分之和/(試驗(yàn)天數(shù)×每組仔豬頭數(shù))。

1.4.2 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

將前述固定好的結(jié)腸中段組織進(jìn)行石蠟包埋、蘇木精-伊紅(HE)染色，于虛擬顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，使用Image-Pro Plus軟件測量隱窩深度以及黏膜厚度，并檢查是否存在炎性細(xì)胞浸潤等病變特征。

1.4.3 結(jié)腸菌群的16S rRNA高通量測序

參考Wang等[13]的研究，按照十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法提取仔豬結(jié)腸食糜中細(xì)菌總DNA，使用細(xì)菌通用引物319F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTETCTAAT-3’)通過PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域，擴(kuò)增后使用DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，在Illumina平臺利用等摩爾和雙末端測序法進(jìn)行測序[14]。在得到的有效數(shù)據(jù)中，將相似度≥97%的序列聚類成1個操作分類單元(OTU)，然后對OTU進(jìn)行歸一化處理，使用基迪奧公司的OmicShare Tools分析結(jié)腸菌群α多樣性、β多樣性以及門、屬水平上的組成。

1.4.4 結(jié)腸食糜中短鏈脂肪酸含量的測定

使用賽默飛全自動氣相色譜儀(TRACE-1300/1310)測定結(jié)腸食糜中短鏈脂肪酸含量。稱取結(jié)腸食糜0.1 g于2 mL離心管中，加入1 mL雙蒸水混合均勻，充分離心后取1 mL上清液，加入0.2 mL 25%偏磷酸巴豆酸溶液，吸取0.8 mL上清液按照1∶1比例加入乙醚萃取，充分混勻離心，通過0.22 μm微孔濾膜后注入進(jìn)樣瓶內(nèi)襯管中用于上機(jī)待測。色譜柱為美國Sigma公司產(chǎn)品，30 m×0.32 mm×0.25 μm；氣相色譜儀參數(shù)：柱溫箱溫度150 ℃，平衡時間3 min，進(jìn)樣口溫度220 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度210 ℃，載氣為氮?dú)狻?/p>

1.4.5 結(jié)腸黏膜基因表達(dá)的測定

使用TRIzol試劑盒(Invitrogen，美國)提取結(jié)腸黏膜中的總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，中國)將1 μL濃度為1 μg/mL的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用QuantStudio 7熒光定量PCR儀(ABI，美國)及QuantStudio?實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems?，美國)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)。使用相對定量法測定結(jié)腸黏膜中腸道屏障相關(guān)基因ZO-1、閉鎖蛋白(Occludin)、封閉蛋白-1(Claudin-1)與TLR/髓樣分化因子88(MyD88)/NF-κB信號通路相關(guān)分子基因TLR-2、TLR-4、TLR-5、NF-κB、MyD88的表達(dá)量。試驗(yàn)所使用的引物序列見表2，以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的mRNA相對表達(dá)量[15]。

表2 實(shí)時熒光定量PCR所用引物序列

1.4.6 結(jié)腸黏膜中炎性細(xì)胞因子含量的檢測

取0.1 g結(jié)腸黏膜于1 mL離心管中，加入900 μL預(yù)冷生理鹽水，勻漿后制備10%組織勻漿液，使用BCA蛋白試劑盒(Biosharp，蘭杰柯科技有限公司)檢測結(jié)腸黏膜中總蛋白含量。使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]檢測結(jié)腸黏膜中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析分別比較K88組與CON組、RA組與K88組的差異顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著趨勢。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬生長性能和腹瀉的影響

如表3所示，CON組、K88組、RA組仔豬的ADG、ADFI以及F/G無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，K88組仔豬腹瀉指數(shù)顯著增加(P<0.05)，并且腹瀉率有增加的趨勢(P=0.057)；而與K88組相比，RA組仔豬腹瀉率極顯著降低(P<0.01)。

表3 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬生長性能和腹瀉的影響

2.2 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖1和表4所示，CON組仔豬結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無明顯病變；與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸黏膜層增厚(P<0.05)，隱窩加深(P<0.01)，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤；與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，黏膜層變薄(P<0.01)，隱窩變淺(P<0.01)，無明顯病變。

表4 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖1 各組斷奶仔豬結(jié)腸組織切片

2.3 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 斷奶仔豬結(jié)腸菌群α多樣性分析

由表5可知，與CON相比，K88組仔豬結(jié)腸菌群的Chao1和ACE指數(shù)顯著降低(P<0.05)；而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸菌群的Chao1和ACE指數(shù)均有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸菌群α多樣性的影響

2.3.2 斷奶仔豬結(jié)腸菌群β多樣性分析

由圖2可知，基于Bray-Curtis距離，在OTU水平上對仔豬結(jié)腸菌群進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，結(jié)果顯示K88組與CON組(R=0.474，P=0.002)、K88組與RA組仔豬結(jié)腸菌群顯著分開(R=0.431，P=0.003)。

CON：CON組；K88：K88組；RA：RA組。下圖同。

2.3.3 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸菌群組成的影響

由圖3-A可知，斷奶仔豬結(jié)腸菌群中厚壁菌門(Fimicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌門。對結(jié)腸菌群門水平相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖3-B)可知，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸菌群中變形菌門的相對豐度極顯著增加(P<0.01)，厚壁菌門的相對豐度有降低趨勢(P=0.054)，擬桿菌門的相對豐度有增加趨勢(P=0.051)；而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸菌群中擬桿菌門的相對豐度極顯著降低(P<0.01)，變形菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)，放線菌門的相對豐度顯著增加(P<0.05)，厚壁菌門的相對豐度有增加趨勢(P=0.072)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Proteobacteria：變形菌門；Euryarchaeota：廣古菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Chlamydiae：衣原體門；Unclassified：未分類；Other：其他。

斷奶仔豬結(jié)腸菌群中相對豐度排名前40的菌屬如圖4-A所示，其中乳桿菌屬(Lactobacillus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群(Eubacterium_coprostanoligenes_group)為優(yōu)勢菌屬。由圖4-B可知，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸菌群中乳桿菌屬的相對豐度顯著降低(P<0.05)，克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)的相對豐度極顯著降低(P<0.05)，脫硫弧菌屬(Desulffovibrio)、埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的相對豐度顯著增加(P<0.05)；而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸菌群中克里斯滕森菌科R-7群極顯著增加(P<0.01)，布勞特氏菌屬(Blautia)、糞腸球菌屬3(Coprococcus_3)、多爾氏菌屬(Dorea)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的相對豐度顯著增加(P<0.05)，脫硫弧菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

Lactobacillus:乳桿菌屬;Megasphaera:巨球型菌屬;Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬;Eubacterium_coprostanoligenes_group:產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌群;Rumcoccaceae_UCG-002:瘤胃球菌科UCG-002;Subdoligranulum:罕見小球菌屬;Rumcoccaceae_UCG-005:瘤胃球菌科UCG-005;Mitsuokella:光岡菌屬;Rumcoccaceae_UCG-014:瘤胃球菌科UCG-014;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群;Dialister:小桿菌屬;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9腸道群;Rumcoccaceae_NK4A214_group:瘤胃球菌科NK4A214群;Faecalibacterium:棲糞桿菌屬;Clostridium_sense_stricto_1:狹義梭菌屬1;Blautia:布勞特氏菌屬;Prevotellaceae_NK3B31_group:普雷沃氏菌科NK3B31群;Lachnospriaceae_XPB104_group:毛螺菌科XPB104群;Coprococcus_3: 糞腸球菌屬3;Methanobrevibacter:甲烷短桿菌屬;Olsenella:顫螺旋菌屬;Terrisporobacter:土孢桿菌屬;Solobacterium:索羅菌屬;Treponema_2:密螺旋體屬2;Ruminococcus_1:瘤胃球菌屬1;Rumcoccaceae_UCG-010:瘤胃球菌科UCG-010;Anaerovibrio:厭氧弧菌屬:Lachnospriaceae_NK4A136_group:毛螺菌科NK4A136群;Desulffovibrio:脫硫弧菌屬;Lachnospira:毛螺菌屬;Prevotella_9:普雷沃氏菌屬9;Acidaminococcus:氨基酸球菌屬;Parabacteroides:副擬桿菌屬;Dorea:多爾氏菌屬;Bifidobacterium:雙歧桿菌屬;Collinsella:柯林斯氏菌屬;Roseburia:羅氏菌屬;Escherichia-Shigella:埃希氏菌-志賀氏菌屬;Unclassified:未分類;Other:其他。

2.4 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸食糜中短鏈脂肪酸含量的影響

由表6可知，與CON組相比，K88組斷奶仔豬結(jié)腸食糜中乙酸和總短鏈脂肪酸含量極顯著降低(P<0.01)，異戊酸含量顯著降低(P<0.05)；而與K88組相比，RA組斷奶仔豬結(jié)腸食糜中乙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸含量均顯著增加(P<0.05)。

表6 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸食糜中短鏈脂肪酸含量的影響

2.5 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸黏膜中緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1的mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸黏膜中Occludin、ZO-1的mRNA相對表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)，且Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量有增加的趨勢(P=0.056)。

圖5 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸黏膜中緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

2.6 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸炎癥反應(yīng)的影響

2.6.1 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸黏膜中炎性細(xì)胞因子含量的影響

由表7可知，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸黏膜中IL-10含量極顯著下降(P<0.01)，TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸黏膜中IL-1β、TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，IL-10含量極顯著增加(P<0.01)。

表7 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸黏膜炎癥因子水平的影響

2.6.2 飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸黏膜中TLR/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子基因mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖6所示，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸黏膜中TLR-2、TLR-4、TLR-5、NF-κB、的mRNA相對表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)；而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸黏膜中TLR-2、TLR-4、NF-κB的mRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，TLR-5的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖6 RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸黏膜TLR/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子基因表達(dá)的影響

3 討 論

在豬的整個生長發(fā)育過程中，斷奶是最大的應(yīng)激之一，斷奶應(yīng)激產(chǎn)生的仔豬消化不良、腹瀉等現(xiàn)象必然伴隨著腸道微生態(tài)失衡[3,19]。在本試驗(yàn)中，RA沒有對斷奶仔豬的生長性能產(chǎn)生顯著影響，這可能是由于RA主要被微生物代謝成次級產(chǎn)物，再被有效吸收和利用，此過程RA次級代謝產(chǎn)物在腸道細(xì)胞中的運(yùn)輸效率和吸收效率都很低[20-21]。穩(wěn)定的腸道微生態(tài)對于維持仔豬腸道健康具有重要意義，由于RA能夠抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等多種腹瀉型致病菌生長，因此可能具有調(diào)控腸道微生態(tài)平衡的潛力[5-6,22]。在本研究中，ETEC K88攻毒顯著增加了斷奶仔豬的腹瀉指數(shù)，表明本研究成功建立了ETEC K88攻毒模型，而飼糧添加RA極顯著降低了ETEC K88攻毒斷奶仔豬的腹瀉率，表明RA可以改善仔豬腹瀉情況，有利于仔豬腸道健康，這可能與RA改善仔豬腸道微生態(tài)有關(guān)。因此，本研究著重探究了飼糧添加RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸菌群組成、屏障功能及炎癥反應(yīng)的影響，并且探討它們之間可能存在的聯(lián)系。

腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)與腸道健康密切相關(guān)，腸道的絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度能夠直觀地反映腸道健康狀況[23]。絨毛高度降低、隱窩加深導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞向腸絨毛頂端遷移的距離縮短、速度加快，沒有充足的時間進(jìn)行分化和成熟，從而影響斷奶仔豬腸道消化吸收功能，極易引發(fā)腹瀉，降低仔豬生長性能[24]。研究表明，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中通常出現(xiàn)結(jié)腸隱窩加深、黏膜增厚的現(xiàn)象[25]。在本研究中，與CON組相比，ETEC K88攻毒使仔豬結(jié)腸隱窩加深，黏膜變厚，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象，表明ETEC K88攻毒破壞了仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，可能引發(fā)仔豬腸道炎癥，不利于仔豬消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)。而與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸隱窩變淺，黏膜變薄，無明顯病變，這表明飼糧添加RA可以改善ETEC K88攻毒引起的斷奶仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，有利于維持仔豬正常的腸道消化吸收功能。

腸道菌群能夠黏附在腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)、腸黏液層中形成一層覆蓋腸道的生物膜，通過菌膜占位性保護(hù)阻止外來致病菌入侵和定植[26]。一旦腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，病原菌侵襲導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)，極易誘發(fā)腸道炎性疾病[27]。因此，我們研究了RA對ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸菌群組成的影響。腸道菌群的豐富度可以用Chao1和ACE指數(shù)來衡量，Chao1和ACE指數(shù)越大，腸道菌群豐富度越高，有助于維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定，促進(jìn)腸道健康[28]。本研究結(jié)果顯示，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸菌群的Chao1和ACE指數(shù)顯著降低，而飼糧添加RA改善了這一現(xiàn)象。此外，仔豬結(jié)腸菌群β多樣性的PCoA結(jié)果表明，3組仔豬結(jié)腸菌群聚類分離，這表明ETEC K88攻毒以及飼糧添加RA均能改變斷奶仔豬結(jié)腸菌群組成。

進(jìn)一步分析結(jié)腸菌群門水平組成變化發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，ETEC K88攻毒降低了仔豬厚壁菌門的相對豐度，而飼糧添加RA增加了厚壁菌門的相對豐度，并且顯著增加了放線菌門的相對豐度，顯著或極顯著降低了擬桿菌門、變形菌門的相對豐度。在屬水平上，與CON組相比，ETEC K88攻毒顯著或極顯降低了仔豬結(jié)腸菌群中乳桿菌屬、克里斯滕森菌科R-7群的相對豐度，而飼糧添加RA極顯著增加了克里斯滕森菌科R-7群的相對豐度。厚壁菌門中的多數(shù)成員有益于腸道健康。Gao等[29]研究表明，乳桿菌屬相對豐度的增加可能有助于增強(qiáng)低聚半乳糖對脂多糖(LPS)刺激哺乳仔豬結(jié)腸的保護(hù)作用；Guzmn-Castaeda等[30]研究發(fā)現(xiàn)，克里斯滕森菌屬細(xì)菌可作為益生菌，改善心血管疾病中血脂異常、血壓升高現(xiàn)象和2型糖尿病中糖代謝受損、胰島素紊亂現(xiàn)象。同時，與K88組相比，飼糧糧添加RA還顯著增加了仔豬結(jié)腸菌群中布勞特氏菌屬、糞腸球菌屬3、雙歧桿菌屬的相對豐度。其中，糞腸球菌屬細(xì)菌能改善仔豬脂質(zhì)代謝功能障礙，通過調(diào)控新陳代謝來影響宿主健康[31]；雙歧桿菌屬細(xì)菌能夠提高腸易激綜合征患者腸道免疫力，改善腸道免疫缺陷引起的病變[32]。此外，與CON組相比，ETEC K88攻毒顯著增加了仔豬結(jié)腸菌群中埃希氏菌-志賀氏菌屬、脫硫弧菌屬的相對豐度，而飼糧添加RA顯著改善了這一現(xiàn)象。屬于變形菌門的埃希氏菌-志賀氏菌屬細(xì)菌是一種病原菌，常見于動物腸道中，具有潛在的致病性，能夠引起仔豬腹瀉[33]；脫硫弧菌屬細(xì)菌與潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)，在潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸中相對豐度顯著增加[34]。在Yang等[35]的試驗(yàn)中，ETEC K88攻毒使仔豬腹瀉率增加，小腸形態(tài)遭到破壞，并引起炎癥反應(yīng)，降低仔豬生長性能。綜上所述，飼糧中添加RA調(diào)節(jié)了斷奶仔豬的結(jié)腸菌群組成，通過提高乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌的相對豐度，減少潛在致病菌埃希氏菌-志賀氏菌屬、脫硫弧菌屬的定植，在一定程度上有利于維持?jǐn)嗄套胸i腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道健康。

腸道菌群可代謝碳水化合物產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，其中丁酸可直接為腸黏膜上皮細(xì)胞提供能量，有利于維持黏膜屏障的完整性，還能抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增殖，防止結(jié)腸炎癥的發(fā)生[36]。本研究結(jié)果顯示，與CON組相比，ETEC K88攻毒極顯著降低了仔豬結(jié)腸食糜中乙酸的含量，顯著降低了異戊酸的含量；而與K88組相比，飼糧添加RA顯著增加了仔豬結(jié)腸食糜中乙酸、丁酸的含量。前人在體外發(fā)酵試驗(yàn)中研究結(jié)果表明，添加植物乳桿菌與低聚果糖提高了發(fā)酵液中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對豐度，產(chǎn)生了更多的乙酸和丁酸[37]。此外，在注射LPS的仔豬飼糧中添加糞腸球菌，能夠增加結(jié)腸食糜中丁酸等短鏈脂肪酸的含量，改善仔豬的生長性能[38]。在本研究中，與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸食糜中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、糞腸球菌屬3等短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的相對豐度增加，進(jìn)而提高了短鏈脂肪酸的含量，表明RA可以通過調(diào)節(jié)結(jié)腸菌群組成來影響細(xì)菌代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的含量。

腸道屏障功能是機(jī)體抵御外源病原菌的重要防線之一，對腸道健康有重要作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌和乳酸桿菌產(chǎn)生的乙酸能夠阻止腸腔內(nèi)抗原穿過腸上皮，應(yīng)對TNF-α介導(dǎo)的腸道屏障功能失調(diào)，特異性恢復(fù)腸道緊密連接結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸上皮屏障功能[39]。飼糧中添加RA通過調(diào)節(jié)仔豬結(jié)腸菌群組成增加了結(jié)腸食糜中短鏈脂肪酸的含量，可能有利于提高仔豬腸道屏障功能，促進(jìn)腸道健康。本研究中，與CON組相比，ETEC K88攻毒顯著或極顯著降低了結(jié)腸黏膜中ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量，而飼糧添加RA極顯著提高了仔豬結(jié)腸黏膜中ZO-1、Occludin的mRNA相對表達(dá)量，這表明RA有利于維持仔豬結(jié)腸上皮屏障功能。

腸道菌群失調(diào)直接或間接引起的腸道屏障功能障礙導(dǎo)致腸道通透性增加，加劇腸道炎癥[40]。在本研究中，與CON組相比，K88組仔豬結(jié)腸形態(tài)受損，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，而RA組仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)至正常水平，說明飼糧中添加RA能夠有效緩解ETEC K88攻毒引起的仔豬結(jié)腸炎癥。進(jìn)一步分析結(jié)腸黏膜中炎性細(xì)胞因子含量可知，ETEC K88攻毒顯著提高了TNF-α的含量，極顯著降低了IL-10的含量，而飼糧添加RA能夠改善這一現(xiàn)象，并且極顯著降低IL-1β的含量。研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，RA能夠降低結(jié)腸黏膜中IL-1β、IL-6、IL-22的含量，緩解結(jié)腸炎相關(guān)病癥的發(fā)展，改善結(jié)腸炎[7]。并且丁酸能夠下調(diào)動物結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)，上調(diào)IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)[41]，說明RA可能通過提高丁酸的含量增加仔豬結(jié)腸應(yīng)對炎癥的能力。TLR/MyD88/NF-κB信號通路是腸道炎癥反應(yīng)中一條重要的信號通路，TLR識別病原微生物后，將信號通過MyD88分子傳遞給NF-κB，調(diào)控炎性細(xì)胞因子的生成[42]。在本研究中，與K88組相比，RA組仔豬結(jié)腸黏膜中TLR-2、TLR-4、TLR-5、NF-κB的mRNA相對表達(dá)量顯著或極顯著降低，說明RA通過調(diào)節(jié)TLR/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子基因的表達(dá)緩解了ETEC K88攻毒引起的仔豬結(jié)腸炎癥反應(yīng)。陳儀[43]對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，甘草瀉心湯能夠顯著抑制大鼠結(jié)腸黏膜中TLR-4、MyD88、NF-κBp65的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，降低TNF-α的含量，提高IL-10的含量，具有改善結(jié)腸炎癥的作用。因此，飼糧中添加RA通過抑制TLR/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子的激活來減輕ETEC K88攻毒引起的仔豬腸道炎癥，保護(hù)腸道健康。此外，腸道形態(tài)遭到破壞以及ZO-1、Claudin等緊密連接蛋白基因表達(dá)下調(diào)使腸道屏障功能減弱，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)等機(jī)會致病菌容易透過腸黏膜引發(fā)腸道炎癥[44]，而給仔豬口服乳酸桿菌能夠增加仔豬腸道緊密連接蛋白表達(dá)以及抑炎細(xì)胞因子的含量，改善腸道形態(tài)與腸道屏障功能，提高仔豬應(yīng)對腸道炎癥的能力并緩解腹瀉[45]。因此，飼糧添加RA緩解ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸炎癥反應(yīng)，降低腹瀉率，可能與RA改善了斷奶仔豬結(jié)腸形態(tài)，調(diào)節(jié)了結(jié)腸菌群組成，提高了結(jié)腸中丁酸等短鏈脂肪酸含量，進(jìn)而增強(qiáng)了仔豬結(jié)腸屏障功能有關(guān)。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼糧添加RA可以改善ETEC K88攻毒斷奶仔豬結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)結(jié)腸菌群組成，提高細(xì)菌代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的含量，改善結(jié)腸屏障功能，緩解ETEC K88攻毒造成的結(jié)腸炎癥反應(yīng)，有利于改善腹瀉情況，維持?jǐn)嗄套胸i腸道健康。