中國西南地區(qū)新生兒高膽紅素血癥基因多態(tài)性研究

劉 玲 蔣榆輝 聶潘榮 曾麗梅 段改原 李宇晨

1.昆明市兒童醫(yī)院（云南昆明 650103）；2.云南大學(xué)附屬醫(yī)院（云南昆明 650021）；3.云南省保山市人民醫(yī)院（云南保山 678099）；4.景洪市第一人民醫(yī)院（云南西雙版納州 666100）；5.昆明醫(yī)科大學(xué)（云南昆明 650500）

新生兒高膽紅素血癥是新生兒期的常見疾病，對不同人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約40.0%～80.0%的新生兒可出現(xiàn)不同程度黃疸[1]。對于大多數(shù)新生兒來說，黃疸是一個常見的生理現(xiàn)象。遺傳和環(huán)境是影響新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的重要因素[2-4]，遺傳因素與臨床的相關(guān)性受到更多關(guān)注[5-7]。有報道提出，足月新生兒血清非結(jié)合膽紅素的峰值水平和核黃疸的發(fā)生率，印第安人和黃種人均高于白種人和黑種人[8]。與新生兒高膽紅素血癥相關(guān)的基因變異包括：①尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1 A1（uridine diphosphate-glucuronosyl transferase 1A1，UGT 1 A 1）啟動和編碼序列基因變異，該基因編碼序列的變異可導(dǎo)致尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)酶結(jié)合功能的缺陷或喪失，而啟動序列（非編碼序列）核苷酸的多態(tài)性則導(dǎo)致該酶表達能力下降引起酶活性降低，可見無論編碼區(qū)及啟動序列的基因變異均可使非結(jié)合膽紅素在體內(nèi)蓄積，從而造成新生兒黃疸，是該疾病發(fā)生發(fā)展的高危因素[8-10]。②SLCO 1 B 1基因變異，SLCO 1 B 1是有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族成員1B1（organic anion transporter family member 1B1，OATP1B1）的編碼基因，OATP 1 B 1 是肝細胞竇狀隙膜和膽管側(cè)膜上的轉(zhuǎn)運體，是膽鹽和膽紅素的載體，在肝攝取過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，轉(zhuǎn)運體基因發(fā)生變異引起的功能下降或缺失與肝臟多種疾病的發(fā)生休戚相關(guān)[11-15]。③葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）基因變異，G6PD基因變異可能破壞酶的功能，臨床上主要表現(xiàn)為有或沒有誘因的急性溶血，并導(dǎo)致高膽紅素血癥[16-18]。本研究的主要目的是確定UGT 1 A 1、SLCO 1 B 1和G 6 PD基因的變異和多態(tài)性與中國西南地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的易感關(guān)聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2016 年9 月至2019 年12 月在昆明市兒童醫(yī)院、云南大學(xué)附屬醫(yī)院、云南保山市人民醫(yī)院新生兒病房住院的新生兒高膽紅素血癥患兒的臨床資料。納入標準：①籍貫為中國西南地區(qū)，包括云南省、貴州省、四川??；②日齡＜28 d；③胎齡37～42周，出生體重≥2 500 g；④未使用過影響膽紅素代謝的藥物，如水楊酸類、磺胺等；⑤符合2004 年美國兒科學(xué)會推薦高膽紅素血癥的診斷標準[4]，即小時特異性血清膽紅素值達到或超過新生兒小時膽紅素列線圖的第95 百分位數(shù)。排除標準：①母嬰血型不合溶血??；②紅細胞相關(guān)疾病引起的溶血病；③感染；④甲狀腺功能異常；⑤存在明確血管外溶血；⑥紅細胞增多癥；⑦先天畸形；⑧遺傳代謝性疾病，染色體異常。

從同期住院的血清膽紅素水平低于2004年美國兒科學(xué)會推薦的新生兒小時膽紅素列線圖第40 百分位數(shù)的新生兒中，符合納入標準①～④以及排除標準①～⑧，經(jīng)家長同意并簽署知情同意書后，招募200例新生兒作為對照組。

本研究獲得昆明市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（倫理批號：2016-03-024-K01）以及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括性別、胎齡、體重、日齡、開奶時間、分娩方式和紅細胞壓積。

1.2.2 標本采集 新生兒入院當(dāng)日抽取2mL外周靜脈血，采用日立7600全自動生化分析儀進行血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測 ①采用Wizard Genomic DNA purification Kit 試劑盒，提取血樣中的DNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆?；②使用Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design軟件設(shè)計待測SNP位點的擴增引物及單堿基延伸引物；③提取PCR 產(chǎn)物、單堿基延伸獲得PCR產(chǎn)物；④采用樹脂純化延伸產(chǎn)物后點樣SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件（sequenom）分型并輸出結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.5 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的以M（P25～P75）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組臨床特征比較

符合納入標準的新生兒高膽紅素血癥患兒203例，排除13 例，其中病歷資料不完整3 例，DNA 提取失敗6例，家長因各種原因簽字出院4例，最終共納入190 例（病例組）。男98 例、女92 例，平均胎齡（38.7±1.2）周。對照組200例，男116例、女84例，平均胎齡（38.9±1.3）周。兩組患兒總膽紅素及結(jié)合膽紅素差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而性別、胎齡、出生體重、日齡、開奶時間、分娩方式、紅細胞壓積比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 病例組與對照組間臨床特征比較

2.2 UGT 1 A 1 基因多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥相關(guān)性分析

對UGT 1 A 1基因rs 34993780、rs 873478、rs 34946978、rs 4148323 和rs 35350960 共5 個SNP 位點進行了分型檢測（圖1）。研究結(jié)果顯示，rs 34993780 及 rs 35350960 兩個位點在病例組和對照組中均只檢出雜合變異基因型，且與本地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。rs 873478 位點基因型（GG、CG 和CC）及 rs 34946978 位點基因型（CC、TC 和TT）在兩組間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但等位基因C 和T 在病例組中的檢出率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。rs4148323位點基因型（GG、GA和AA）在兩組間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），病例組AA基因型頻率較高；同時，病例組等位基因A 檢出率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 病例組與對照組間UGT1A1基因型、等位基因頻率分布比較[n (%)]

圖1 UGT1A1 rs34993780、rs873478、rs34946978、rs4148323、rs35350960 位點分布圖

2.3 SLCO1B1基因多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥相關(guān)性分析

對SLCO 1 B 1基因rs 59502379、rs 56101265、rs72559748、rs72559745、rs56061388、rs55901008、rs 4149056、rs 56199088 共8 個SNP 位點進行了分型檢測（圖2），其中rs 59502379、rs 56101265、rs72559745、rs56061388、rs55901008和rs56199088位點在病例組和對照組中均未檢出多態(tài)性。rs72559748位點AG基因型及G等位基因在病例組中的檢出率均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

圖2 SLCO1B1 rs59502379、rs56101265、rs72559748、rs72559745、rs56061388、rs55901008、rs4149056、rs56199088 位點分布圖

表3 病例組與對照組間SLCO1B1基因型、等位基因頻率分布比較[n (%)]

2.4 G6PD基因變異檢出情況

G6PD基因rs137852328、rs1050828、rs7255664位點分型檢測結(jié)果見圖3。僅病例組中2例男性患兒檢出rs72554664位點變異，檢出率為1.1%（2/190），對照組均為野生型，其基因型及等位基因頻率在兩組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。rs 137852328、rs 1050828 位點在病例組和對照組中均未檢出多態(tài)性。

圖3 G6PD rs137852328、rs1050828、rs7255664 位點分布圖

表4 病例組與對照組間G6PD基因型、等位基因頻率分布比較[n (%)]

2.5 風(fēng)險等位基因個數(shù)與新生兒高膽紅素血癥發(fā)生相關(guān)性

為探討風(fēng)險等位基因個數(shù)與新生兒高膽紅素血癥風(fēng)險程度的關(guān)聯(lián)性，納入上述3 個與新生兒高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)的位點進行分析，即UGT1A1基因rs873478、rs34946978和rs4148323。病例組和對照組之間風(fēng)險等位基因個數(shù)分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），病例組風(fēng)險等位基因≥2個的比例較高。見表5。

表5 病例組和對照組間風(fēng)險等位基因個數(shù)分布比較 [n (%)]

3 討論

新生兒高膽紅素血癥的發(fā)病機制往往是多因素的，目前普遍認為遺傳和環(huán)境因素共同參與高膽紅素血癥的發(fā)生、發(fā)展。

本研究通過對我國西南地區(qū)高膽紅素血癥新生兒及非高膽紅素血癥對照新生兒進行SNP位點分型檢測，發(fā)現(xiàn)UGT 1 A 1基因rs 873478、rs 34946978和rs 4148323 位點與該地區(qū)新生兒高膽紅素血癥發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)，這與既往研究一致[19-21]。此外，功能研究也發(fā)現(xiàn)，rs 34946978 和rs 4148323 位點雜合變異均可使酶活性降至正常的60.0%左右，而純合變異則會降至32.0%～36.0%[22]。而rs873478位點位于近端啟動子區(qū)域，可能參與基因表達調(diào)控或與TATA 盒產(chǎn)生連鎖效應(yīng)[23]。另外，盡管rs 34993780位點雜合和純合變異可分別使酶活性下降至正常水平的27.6%和7.6%[22]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)該位點與西南地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生存在顯著關(guān)聯(lián)，這可能與其在本地區(qū)的等位基因頻率偏低有關(guān)，僅5例高膽紅素血癥患兒（2.6%）和1例對照組新生兒（0.5%）檢測到雜合變異，而純合變異在兩組中均未檢出。由于本次研究是針對血清總膽紅素值達到或超過新生兒小時膽紅素列線圖的第95百分位數(shù)和低于第40百分位的患兒進行變異位點基因型和等位基因頻率的研究，具有一定的局限性，今后可納入不同百分位血清總膽紅素值的患兒參與研究，從而探討以上變異位點基因型、等位基因分布頻率與高膽紅素血癥嚴重程度是否存在關(guān)聯(lián)性。

近年來SLCO 1 B 1基因多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥之間的關(guān)系逐漸成為研究熱點，但國內(nèi)外不同地區(qū)的研究存在較大差異。本研究未發(fā)現(xiàn)SLCO 1 B 1基因多態(tài)性與西南地區(qū)新生兒高膽紅素血癥發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)，這與筆者團隊既往在單一云南籍新生兒中開展的一項研究結(jié)論一致[24]。同一位點基因變異情況及其與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系在不同種族、不同地區(qū)中存在差異，這可能是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，SLCO 1 B 1基因rs 72559748 位點多態(tài)性在對照組新生兒中的檢出率顯著高于病例組，提示該位點變異可能為新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的保護因素，但具體機制尚有待于進一步研究證實。

G6PD酶活性缺乏常見的臨床癥狀之一是新生兒高膽紅素血癥。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，國外黑人、南歐、希臘、猶太、東南亞及阿拉伯人患病率較高，國內(nèi)的患病率為0.2%～44.8%[25]，其中云南省、貴州省、四川省G6PD缺乏癥的發(fā)病率分別為0.3%、0.5%和0.3%[26]，但在本研究中僅有2例高膽紅素血癥患兒中檢出G6PD基因rs72554664位點變異，檢出率為1.1%，考慮G6PD缺乏癥可能不是西南地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的主要風(fēng)險因素。不過，也有文獻報道云南省部分地區(qū)傣族新生兒高膽紅素血癥中G6PD缺乏癥的發(fā)病率可高達 20.0%[27]。但由于本次納入標準的研究對象主要是漢族，因此變異率較低，接下來項目組計劃針對傣族新生兒高膽紅素血開展專項研究，探索導(dǎo)致傣族新生兒高膽紅素血癥的主要變異基因以及這些變異位點是否存在協(xié)同性。

綜上，本研究通過分析UGT1A1、SLCO1B1及G6PD基因17個多態(tài)性位點在我國西南地區(qū)新生兒中的分布情況，明確了該地區(qū)新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的部分遺傳風(fēng)險因素，對疾病的診治和防控有一定的意義，后續(xù)將進一步研究探討導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥的主要基因的多態(tài)性在不同少數(shù)民族人群之間存在的差異性。