腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中研究現(xiàn)狀與潛在應(yīng)用思考

李祿全 劉曉晨

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科 兒科學(xué)重慶市重點實驗室 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室（重慶 400014）

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒時期最常見及最嚴重的消化道炎癥性疾病之一。早產(chǎn)兒NEC發(fā)病率為5.0%～12.0%[1]，在極低出生體重兒中發(fā)病率高達11.1%[2]。NEC病死率高達20.0%～30.0%，在需要外科手術(shù)治療的人群中，其病死率更高[2]。同時，NEC是導(dǎo)致患兒遠期智力發(fā)育落后的重要危險因素[3]。早期診斷有助于降低病死率，改善NEC 患兒預(yù)后。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物是近年來研究的熱點，腸道菌群通過激活腸道內(nèi)的Toll 樣受體4，引起腸上皮細胞凋亡增加，黏膜愈合受損和促炎因子釋放，同時腸系膜血管收縮，引起局部缺血，導(dǎo)致NEC的發(fā)展[4-5]。在這一過程中，腸道菌群代謝產(chǎn)物（如短鏈脂肪酸）可以直接刺激腸上皮細胞或樹突狀細胞參與機體固有免疫反應(yīng)，促進炎癥因子釋放，同時刺激宿主上皮細胞代謝降低氧濃度，加重腸道局部缺氧缺血[6-7]。本文主要探討腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在NEC中的臨床應(yīng)用潛在價值。

1 新生兒腸道菌群演化及其影響因素

人體腸道中細菌數(shù)在100 萬億左右，新生兒腸道菌群定植起始時間仍有爭議，但越來越多的證據(jù)表明定植開始于胎兒期[8-9]。足月兒通過分娩時與母體產(chǎn)道和周圍環(huán)境中菌群接觸，生后最初幾天腸道菌群包括需氧菌與兼性厭氧菌，隨著腸道內(nèi)氧氣消耗，在生后1周左右，形成以擬桿菌、雙歧桿菌、梭菌屬細菌等厭氧菌為主的腸道菌群[10]，其中雙歧桿菌在新生兒期和嬰兒早期占主導(dǎo)地位[11]。與足月兒不同，早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性低于足月兒，且受胎齡與日齡影響較大[12]。早產(chǎn)兒出生時兼性厭氧菌（如腸桿菌科、腸球菌科和乳酸菌）水平增加，專性厭氧菌（如雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和異位芽胞桿菌屬）水平降低。同時，其他潛在致病微生物群如肺炎克雷伯菌及大腸桿菌也增加。

新生兒腸道菌群從定植到成熟的過程受圍生期和生命早期多種因素影響而動態(tài)變化。胎齡、分娩方式、喂養(yǎng)方式和產(chǎn)婦飲食、環(huán)境因素等可影響新生兒菌群定植[13]。如母乳喂養(yǎng)兒腸道菌群以雙歧桿菌為主，而配方奶喂養(yǎng)者以大腸桿菌和梭菌屬為主[14]。自然分娩新生兒腸道菌群組成與母體產(chǎn)道菌群相似，以乳酸桿菌、塞納菌、普氏菌為主，而剖宮產(chǎn)者腸道菌群與母體皮膚定植菌群相似，以葡萄球菌、丙酸桿菌、棒狀桿菌為主。其他因素（如長期住院、抗生素使用等）均可能影響腸道菌群?？股囟唐谥委煟ā? 天）可導(dǎo)致腸道雙歧桿菌減少并持續(xù)到生后第3周，長時間使用（≥5 天）則導(dǎo)致其減少,持續(xù)至生后第6 周[15]。資源匱乏、人滿為患的衛(wèi)生條件會導(dǎo)致新生兒腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量減少，而耐抗生素革蘭陰性桿菌及梭菌數(shù)量增加[16-17]，住院時間超過1周，艱難梭菌定植增加27.5%，超過4周增加78.9%，超過7周增加100%[18]。

眾多研究已表明腸道菌群是人類生長發(fā)育的重要因素，有助于建立免疫反應(yīng)，在人類長期健康發(fā)展中起著重要作用[19-20]。研究這些因素對腸道菌群的影響將有助于評估腸道菌群的異常變化，進一步明確其變化在預(yù)測腸道疾病發(fā)生發(fā)展中的價值。

2 NEC新生兒腸道菌群變化

研究發(fā)現(xiàn)與健康新生兒相比，NEC 患兒腸道菌群生物多樣性較低，α、β 多樣性是研究NEC 菌群多樣性最常用指標。α多樣性常能夠反映菌群的豐富度和均勻度，β多樣性是表征個體間微生物群落結(jié)構(gòu)相似性的指標。腸道菌群α多樣性的下降以及β多樣性分離對于NEC發(fā)病具有潛在預(yù)測價值，其變化可追溯到起病前1 周到3 周不等[21-26]。因此臨床發(fā)現(xiàn)菌群多樣改變時應(yīng)提高警惕，早期采取預(yù)防措施，延緩病情進展。但因為菌群多樣性監(jiān)測困難，其臨床應(yīng)用價值不高，相比之下，具體的菌群變化更易監(jiān)測，更具有臨床應(yīng)用潛力。

NEC 患兒在發(fā)病前，腸道菌群構(gòu)成比例在門、屬水平與正常新生兒相較均明顯不同。在門水平上，變形菌門比例增加，厚壁菌門與擬桿菌門減少是NEC患兒發(fā)病前的重要特征[27-28]。在診斷前一周內(nèi)，NEC 患兒厚壁菌門、擬桿菌門數(shù)量比例持續(xù)降低，而變形桿菌比例明顯增加，而對照組四個主要菌門（厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門）的比例在同一時期內(nèi)無顯著變化[25]。值得一提的是，NEC 發(fā)病前厚壁菌門和變形菌門變化可能與NEC發(fā)生時間有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)性NEC 患兒（生后20天內(nèi)發(fā)?。┌l(fā)病前以厚壁菌門變化為主要表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為梭狀芽胞桿菌豐度增加，γ-變形菌門豐度降低。而晚發(fā)性NEC（生后20 天后發(fā)?。┌l(fā)病前以變形菌門變化為主，主要表現(xiàn)為γ-變形菌門的增加，大腸桿菌/志賀菌增加[29]。相比厚壁菌門和變形菌門，常被認為是“益生菌”的擬桿菌門和放線菌門在新生兒尤其是早產(chǎn)兒菌群中所占比例較低。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門[25,27,30]和放線菌門[26,31-32]在NEC發(fā)病前降低。

在屬水平上，NEC 患兒出生時在菌屬水平上異淋菌、赭桿菌、雷氏菌、外單胞菌、不動桿菌等的豐度遠高于對照組，這一趨勢一直持續(xù)到NEC 發(fā)生[13]。而常見的早期嬰兒腸道共生菌，如放線菌屬、沙利亞菌屬、維洛內(nèi)拉菌屬、類桿菌屬和鏈球菌屬減少或缺失，這些共生菌早期喪失可能導(dǎo)致致病菌過度生長，從而誘發(fā)NEC[33]。NEC 發(fā)生前腸桿菌科中的克雷伯菌屬、大腸桿菌屬和腸桿菌屬明顯增加[5,25]。研究發(fā)現(xiàn)γ-變形桿菌與NEC風險增加之間存在關(guān)聯(lián)，在極低出生體重兒NEC發(fā)病前，γ-蛋白桿菌相對豐富，嚴格厭氧菌（尤其是陰性菌）相對缺乏[34]。NEC 診斷時的菌群變化往往是發(fā)病前菌群失衡的集中體現(xiàn)，迄今為止進行的最大樣本研究發(fā)現(xiàn)專性厭氧菌尤其是韋榮氏球菌屬與NEC 顯著相關(guān)[35]，但目前尚無統(tǒng)一結(jié)論說明哪種細菌與NEC 發(fā)病密切[36-37]。因此，明確這些菌群變化特征可為評估早產(chǎn)兒腸道菌群變化，預(yù)測NEC 發(fā)病提供重要參考依據(jù)。

3 NEC新生兒腸道菌群代謝產(chǎn)物變化

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，其對生物樣品中（如尿液和糞便）微生物代謝物進行定性和定量分析，不僅可以了解微生物的生理狀態(tài)，還有助于闡明微生物與宿主之間的相互作用機制。在NEC 發(fā)病之前，患兒的腸道菌群代謝產(chǎn)物就已經(jīng)出現(xiàn)改變[38]，目前研究主要集中在代謝相關(guān)酶活性、脂代謝及氨基酸代謝方面。既往研究大多僅僅關(guān)注分類學(xué)來尋找診斷/治療性生物標志物，最近越來越多的研究強調(diào)了研究微生物代謝潛力的重要性[39]。

3.1 代謝有關(guān)酶改變

菌群改變可導(dǎo)致其調(diào)控的代謝途徑中相關(guān)酶活性發(fā)生改變。在NEC 患兒糞便中幾乎無法檢測到與糖基化蛋白降解相關(guān)的α-巖藻糖苷酶和唾液酸酶。在NEC 患兒糞便中，參與菌群色氨酸代謝的關(guān)鍵酶（色氨酸酶和吲哚丙酮酸脫羧酶）比健康新生兒高3倍，而色氨酸2，3-二加氧酶比對照組低4倍[33]，這與NEC患兒中大腸桿菌、克雷伯菌和葡萄球菌屬豐度增加相關(guān)。Sekar等[40]發(fā)現(xiàn)在NEC患者糞便樣本中糖原脫支酶比對照組高10倍，這種酶參與糖原分解，可能導(dǎo)致病原體菌株毒力增強，這與NEC 糞便大腸桿菌和γ 變形桿菌類其他成員（如假單胞菌、克雷伯菌）的豐度相對增加一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)在NEC發(fā)病前，與鐵攝取和血紅素降解有關(guān)的鐵氧化酶和血紅素加氧酶活性分別增加了45.0%和143.0%，其活性對革蘭陰性病原體至關(guān)重要，有利于致病菌的生長繁殖[41]。也有研究發(fā)現(xiàn)NEC發(fā)生前腸道內(nèi)L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶比對照組分別增加了373.0%和34.0%[27]，可能是因為廣泛抗生素應(yīng)用以及侵入性醫(yī)療操作導(dǎo)致腸道微生物群破壞，從而導(dǎo)致乳酸菌群的產(chǎn)生減少有關(guān)[42]。生物素對人體宿主的一系列分解代謝和合成代謝途徑具有促進作用，它可以由健康嬰兒腸道內(nèi)富集的脆弱類桿菌在腸道合成，研究發(fā)現(xiàn)生物素（維生素B7）代謝相關(guān)酶，包括生物素連接酶、生物素羧化酶和生物素合酶，在NEC患者中的表達降低[33]。

3.2 氨基酸代謝有關(guān)改變

氨基酸作為機體代謝的重要物質(zhì)，部分由細菌酶合成，參與腸道細菌的生物合成和正常代謝過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病當天NEC 患兒尿液中25 種代謝物在發(fā)病前與對照組存在顯著差異，表現(xiàn)為丙氨酸、天冬酰胺和脯氨酸減少，精氨酸、苯丙氨酸升高[43]，提示NEC患兒存在氨基酸代謝異常。腸道代謝相關(guān)研究主要以糞便為主，但尿液不受排便次數(shù)影響是檢測腸道微生物代謝的潛在替代方案。有研究評估了新生兒生后1 周內(nèi)的尿液代謝組學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，丙氨酸與厚壁菌門豐度呈正相關(guān)，而組氨酸與變形菌門和丙酸桿菌豐度呈負相關(guān)[44]，表明氨基酸代謝可反映腸道菌群的組成，其在NEC中的變化可能與菌群失調(diào)相關(guān)。

3.3 脂代謝有關(guān)改變

脂肪酸作為腸道內(nèi)的主要能量來源，主要來自于食物，部分（如短鏈脂肪酸）可通過腸道菌群分解其他膳食纖維產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，NEC 患兒糞便丁酸水平明顯低于健康嬰兒[45]，而丁酸主要由厚壁菌門產(chǎn)生，丁酸水平下降反映了NEC患兒腸道內(nèi)的菌群紊亂，可能作為NEC 的特征性改變，具有潛在臨床應(yīng)用價值。除此之外，脂肪酸主要由腸道菌群分解代謝，不同腸道菌群代謝脂肪酸的途徑不同，脂肪酸代謝途徑異常可反映菌群異常。Stewart等[46]發(fā)現(xiàn)NEC 患兒兩種來自C 21-類固醇激素生物合成和亞油酸代謝途徑代謝物、兩種來自亞油酸代謝途徑的代謝物和一種來自白三烯代謝和前列腺素的代謝物在NEC 診斷前顯著增高，在治療后降低，其變化與雙歧桿菌的變化高度相關(guān)。

綜上，NEC患兒腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致相關(guān)代謝通路酶及代謝產(chǎn)物異常，可作為開發(fā)NEC早期診斷的有價值微生物/代謝產(chǎn)物生物標記物的突破口。

4 菌群改變在NEC早期診斷中的價值

4.1 克雷伯菌

多項研究顯示[21,25,27,30-31]，NEC 發(fā)病前變形菌門顯著增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在NEC前72小時至1周，變形菌門增加34.0%[25]。作為變形菌門的主要菌群，克雷伯菌的增加被認為與NEC發(fā)生密切相關(guān)，其在胎糞中已表現(xiàn)出差異，并持續(xù)到NEC 發(fā)病[5,30]?？死撞暇贜EC 發(fā)病前12 天內(nèi)顯著增加[47]，Olm等[48]采用宏基因組分析160例早產(chǎn)兒的1 163份大便標本發(fā)現(xiàn)，超過52.0%的NEC患兒發(fā)病前樣本中克雷伯氏菌屬高于檢測閾值，其與NEC發(fā)病最相關(guān)，進一步發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌的生物合成基因是NEC 發(fā)病前最重要的次生代謝物基因簇編碼基因，具有較高質(zhì)粒豐度，因此認為克雷伯氏菌豐度增高可作為NEC的最佳預(yù)測因子之一。

4.2 梭狀芽胞桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌

Tarracchini 等[32]分析NEC 發(fā)病前以及未發(fā)生NEC 的早產(chǎn)兒腸道菌群，發(fā)現(xiàn)健康早產(chǎn)兒腸道中幾乎不存在梭狀芽胞桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，而在NEC發(fā)病前的糞便中檢測到這兩者平均豐度分別為26.5%和6.9%。研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌在NEC發(fā)病前5 天開始增加，而產(chǎn)氣莢膜梭菌在胎糞中便已開始增加并持續(xù)到NEC發(fā)病[30,34]。因此認為梭狀芽胞桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌可作為早期預(yù)測NEC的潛在生物標志物[48]。

4.3 丙酸桿菌

相關(guān)研究對＜29 周胎齡早產(chǎn)兒人群糞便標本菌群分析發(fā)現(xiàn)，在生后4～9 天，18 例對照組患兒糞便樣本中有10例發(fā)現(xiàn)了丙酸桿菌，但在后期發(fā)生NEC的9例患兒中均未發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌，提示生后1周左右丙酸桿菌缺乏對后期發(fā)生NEC 可能具有重要預(yù)測價值[44]。

5 代謝產(chǎn)物在預(yù)測NEC方面的價值

5.1 氨基酸比例、鞘磷脂、?；鈮A

Morrow 等[44]對11 例最終發(fā)生及21 例未發(fā)生NEC的新生兒的尿液樣本進行分析后發(fā)現(xiàn)，丙氨酸與組氨酸的比率與NEC顯著相關(guān)，在后期被診斷為NEC 的患兒中，其生后第4 至9 天尿液中丙氨酸和組氨酸濃度均明顯升高，但當尿丙氨酸:組氨酸比值＞4時具有較好預(yù)測價值（靈敏度為82.0%，特異度為75.0%）。表明氨基酸比例失調(diào)在NEC 發(fā)病前已存在，對NEC 發(fā)病具有潛在預(yù)測價值。有研究發(fā)現(xiàn)NEC發(fā)生前1～5天NEC患兒糞便中鞘磷脂增加，進一步的分層聚類發(fā)現(xiàn)鞘磷脂有可能作為潛在廣泛適用的預(yù)測性生物標記物[49]。另有研究發(fā)現(xiàn)生后12小時至8 天，14 個酰基肉堿水平和?；鈮A比值與發(fā)生NEC 的風險增加相關(guān)，6 個乙酰肉堿水平聯(lián)合出生體重和全腸外營養(yǎng)構(gòu)建的模型可預(yù)測NEC 發(fā)病[50]，因此認為?；鈮A水平和?；鈮A比值可作為NEC發(fā)病的預(yù)測標志物。

5.2 自誘導(dǎo)分子2

自誘導(dǎo)分子2（autoinducer-2，AI-2）是重要的細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子，主要由LuxS基因編碼，在許多不同的革蘭陽性和陰性細菌中調(diào)節(jié)細菌毒力、生物膜形成、毒力因子的產(chǎn)生和釋放等。筆者研究發(fā)現(xiàn)AI-2與NEC的發(fā)生和恢復(fù)顯著相關(guān)，AI-2在NEC急性期顯著下降，恢復(fù)期逐漸升高。此外，在疾病發(fā)展過程中，AI-2在細菌比例發(fā)生顯著變化之前發(fā)生變化。這提示AI-2可能是NEC診斷和病情監(jiān)測的新生標志物[51]。但目前相關(guān)研究仍較少，NEC發(fā)病和AI-2改變之間的因果關(guān)系尚不明確，AI-2早期預(yù)測NEC發(fā)病的價值仍需進一步研究。

5.3 揮發(fā)性有機化合物

揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）是在常溫下，沸點50～260 ℃的各種有機化合物，這些化合物在環(huán)境溫度下易揮發(fā)。糞便中VOCs 被認為可提供有關(guān)腸道微生物群組成、代謝活性以及宿主與微生物群相互作用的信息。迄今為止，有3 項研究探索糞便VOCs 預(yù)測NEC 的潛力，De Meij 等[52]發(fā)現(xiàn)NEC 患兒糞便VOCs 譜在臨床癥狀出現(xiàn)前2～3天與匹配的對照組有顯著差異。而Probert[53]和Garner[54]則對NEC發(fā)病前4天的VOCs進行測定，前者發(fā)現(xiàn)NEC 發(fā)病前4 天甲基醛、3-甲基丁醛和2-甲基丁醛增加，3-甲基和2-甲基丁酸降低對于預(yù)測NEC發(fā)病的價值為中等。后者發(fā)現(xiàn)2-乙基己基乙酸酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯在NEC 患兒糞便樣本中缺失。這均提示糞便VOCs可用于早期識別NEC，可能成為早期預(yù)測NEC的無創(chuàng)工具。但相關(guān)研究較少且樣本量較小，尚需高質(zhì)量臨床研究盡心驗證。

6 結(jié)語

腸道菌群紊亂在NEC 發(fā)病中扮演了重要角色，腸道菌群的變化在一定程度上能夠反映NEC的發(fā)病及嚴重程度。但需要注意的是，NEC 發(fā)病是整個腸道菌群共同變化的結(jié)果，單個細菌的改變很難作為評價標準，目前雖然有研究表明部分細菌在NEC發(fā)病中具有預(yù)測價值，但大多為單中心研究且樣本量小，缺乏臨床應(yīng)用價值。而代謝產(chǎn)物是菌群與宿主溝通的橋梁，可反映整體腸道菌群的改變，可能在NEC 病情變化中更有價值。菌群蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等相關(guān)研究在探尋NEC發(fā)病標志物中尚處于起步階段，仍需要高質(zhì)量、多中心、大樣本量的臨床研究進行驗證。