毒素-抗毒素系統(tǒng)對微生物活的非可培養(yǎng)狀態(tài)形成的影響研究進(jìn)展

張鐵華，孟玲玲，趙 鳳

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130062）

微生物的生存面臨著來自宿主以及自然環(huán)境的壓力，尤其是受到不斷變化的自然環(huán)境（如低溫、高溫、重金屬、高滲透壓、消毒劑、抗生素等）的挑戰(zhàn)。為了適應(yīng)惡劣環(huán)境，一些微生物會(huì)選擇形成一種低代謝活性但高抗性的生命形式，如芽孢、活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)、持留菌等。芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌（主要是芽孢桿菌屬和梭菌屬）在環(huán)境營養(yǎng)條件缺乏時(shí)，在菌體內(nèi)形成的一種休眠體。芽孢含水量極低、抗逆性強(qiáng)，食品工業(yè)也以對芽孢的殺滅效果來衡量產(chǎn)品的滅菌效果。VBNC狀態(tài)和持留狀態(tài)是非芽孢形成菌在面對不良環(huán)境時(shí)形成的一種休眠狀態(tài)。處于持留狀態(tài)的細(xì)菌對多種藥物具有耐受性，從而導(dǎo)致治療失敗。處于VBNC狀態(tài)的致病菌和腐敗菌仍然有造成食品腐敗變質(zhì)及致病的風(fēng)險(xiǎn)，并且當(dāng)條件適宜時(shí)，其可能會(huì)恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)，這給食品產(chǎn)業(yè)和人類健康造成了嚴(yán)重的威脅。已有證據(jù)表明VBNC狀態(tài)致病菌可能參與食源性疾病暴發(fā)，1998年日本發(fā)生了由VBNC狀態(tài)腸出血性大腸桿菌O157:H7（enterohemorrhagic）污染的腌漬鮭魚籽所引起的嚴(yán)重食物中毒事件。無獨(dú)有偶，日本由干制魷魚引發(fā)的食物中毒事件同樣是由VBNC狀態(tài)的腸炎沙門氏菌（）所引起。為了減少由VBNC狀態(tài)微生物引起的食品安全隱患，需要抑制微生物VBNC狀態(tài)的形成；為了靶向控制VBNC狀態(tài)的形成，需要對微生物VBNC狀態(tài)的形成機(jī)制有正確認(rèn)知。目前關(guān)于微生物VBNC狀態(tài)的研究多集中在誘導(dǎo)條件、復(fù)蘇條件及檢測方法的探索上，對其形成機(jī)制的研究還不全面。而關(guān)于VBNC狀態(tài)形成的機(jī)制主要有兩種假設(shè)：一種認(rèn)為極端的條件會(huì)造成細(xì)菌氧化損傷，進(jìn)而抑制其生長，最終導(dǎo)致VBNC狀態(tài)的形成；另一種認(rèn)為VBNC狀態(tài)的形成與芽孢的形成類似，是基因調(diào)控的結(jié)果。

毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)由兩個(gè)共表達(dá)的基因組成，其中一個(gè)編碼毒素，另一個(gè)編碼抗毒素。毒素可以抑制細(xì)菌生長，而抗毒素可以中和毒素抑制其發(fā)揮毒性作用。在環(huán)境惡劣時(shí)，TA系統(tǒng)被激活并且參與調(diào)控細(xì)菌生長。研究表明TA系統(tǒng)參與了微生物持留狀態(tài)與VBNC狀態(tài)的形成。不過，不良環(huán)境對TA系統(tǒng)的激活方式及TA系統(tǒng)與VBNC形成關(guān)系的研究還不全面。本文將重點(diǎn)綜述TA系統(tǒng)與微生物VBNC狀態(tài)形成的關(guān)系。

1 微生物的VBNC狀態(tài)與持留狀態(tài)

1982年，Xu Huaishu等研究霍亂弧菌（）和大腸桿菌（）在海洋與河口環(huán)境的存活規(guī)律時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了VBNC狀態(tài)，處于該狀態(tài)的微生物仍具有代謝活性及完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但在常規(guī)固體培養(yǎng)基中無法繁殖形成菌落。VBNC狀態(tài)是非芽孢形成菌處于不良環(huán)境時(shí)形成的一種休眠狀態(tài)，是微生物所采取的一種生存策略（圖1）。目前發(fā)現(xiàn)已有100多種微生物能夠形成VBNC狀態(tài)，包括多種食源性致病菌及腐敗菌。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法被認(rèn)為是檢測食源性致病菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但VBNC狀態(tài)細(xì)菌的不可培養(yǎng)性使得這種基于可培養(yǎng)性的檢測方法檢測不到VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，這會(huì)導(dǎo)致食品中的細(xì)菌含量被大大低估，從而帶來微生物風(fēng)險(xiǎn)。目前對于VBNC細(xì)胞數(shù)的確定都是基于間接方法，即通過測定微生物的活細(xì)胞數(shù)以及可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)來間接獲得，二者的差值即為VBNC細(xì)胞數(shù)。

圖1 細(xì)菌的生命周期[10]Fig. 1 Life cycle of bacteria[10]

目前已知的可以誘導(dǎo)微生物進(jìn)入VBNC狀態(tài)的因素包括溫度、營養(yǎng)、pH值、滲透壓、氧氣濃度、重金屬、抗生素、消毒劑、洗滌劑、防腐劑等；除此之外，干燥、巴氏殺菌、紫外照射、高壓二氧化碳、脈沖電場、超聲波、熱超聲等食品加工過程也會(huì)誘導(dǎo)微生物進(jìn)入VBNC狀態(tài)。VBNC狀態(tài)微生物較常見的特征包括細(xì)胞形態(tài)改變、代謝活性降低、對外界刺激的抗性提高、基因表達(dá)發(fā)生變化等。當(dāng)條件適宜時(shí)，比如逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)壓力、添加化學(xué)物質(zhì)、與宿主細(xì)胞共培養(yǎng)或添加復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf，有些VBNC狀態(tài)微生物能夠復(fù)蘇，重新獲得在培養(yǎng)基上生長繁殖的能力。比如創(chuàng)傷弧菌（）在5 ℃低溫條件下進(jìn)入VBNC狀態(tài)，將其移至室溫后，VBNC狀態(tài)的創(chuàng)傷弧菌成功實(shí)現(xiàn)復(fù)蘇；通過添加吐溫-80的方法可以使VBNC狀態(tài)的金黃色葡萄球菌（）復(fù)蘇；VBNC狀態(tài)的銅綠膿假單胞菌（）在與其宿主變形蟲共培養(yǎng)2 h后成功復(fù)蘇。值得注意的是，部分處于VBNC狀態(tài)的致病菌仍保留一定毒性，而且致病性會(huì)伴隨復(fù)蘇恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)室在食品常用的貯藏條件下——冷藏（4 ℃）和冷凍（-20 ℃），研究了食品添加劑檸檬酸對金黃色葡萄球菌VBNC狀態(tài)形成的影響。研究發(fā)現(xiàn)，冷藏和冷凍條件均使檸檬酸體系中的金黃色葡萄球菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，而且形成的VBNC細(xì)胞對胃腸液的抗性明顯增強(qiáng)；另外，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、熱激處理、添加丙酮酸鈉、添加吐溫-80的方法均使VBNC細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了復(fù)蘇；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析發(fā)現(xiàn)VBNC細(xì)胞中與黏附和生物被膜形成相關(guān)的一些基因表達(dá)發(fā)生了變化，并且發(fā)現(xiàn)生物被膜形成能力有隨著復(fù)蘇而恢復(fù)的潛力。鑒于VBNC狀態(tài)微生物的潛在危害，其已引起了研究者的廣泛關(guān)注。

抗生素持留菌是指在抗生素處理過程中產(chǎn)生的一部分對抗生素有耐受性的細(xì)胞。與攜帶可遺傳耐藥因子的耐藥細(xì)胞不同，抗生素持留菌通常在抗生素處理過程中呈現(xiàn)低的代謝活性，這使得它們不需要經(jīng)歷基因突變而能夠耐受抗生素。2015年，Ayrapetyan等提出了休眠連續(xù)體假說（圖2），認(rèn)為微生物的持留狀態(tài)與VBNC狀態(tài)有著密切關(guān)系。該假說指出某些環(huán)境脅迫（如抗生素處理）會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞中抗毒素的降解，導(dǎo)致其同源毒素（圖2中的紅色三角形）被釋放，釋放的毒素會(huì)通過影響細(xì)胞新陳代謝來影響細(xì)胞的生長。在環(huán)境脅迫處理前期，產(chǎn)生耐受性的非生長細(xì)胞——持留菌，該狀態(tài)菌可以在環(huán)境脅迫消除后快速恢復(fù)生長。然而，如果細(xì)胞長期暴露在環(huán)境脅迫下，積累的游離毒素量會(huì)增加，使細(xì)胞的代謝活性進(jìn)一步降低，導(dǎo)致休眠程度增加，使細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)。當(dāng)環(huán)境脅迫去除后，處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞與持留菌相比需要更長的時(shí)間實(shí)現(xiàn)復(fù)蘇。2018年，Ayrapetyan等首先從VBNC細(xì)胞和持留菌的形成條件及二者對抗生素的耐受性等表型特征方面闡述了VBNC細(xì)胞和抗生素持留菌之間的關(guān)聯(lián)性；其次闡述了細(xì)菌在氨基酸饑餓下的應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、TA系統(tǒng)、ATP消耗等參與調(diào)控抗生素持留菌的分子機(jī)制也參與了VBNC狀態(tài)的調(diào)控，這說明VBNC細(xì)胞和抗生素持留菌在調(diào)控機(jī)制上有很多相似之處；雖然二者有諸多相似之處，但作者從VBNC細(xì)胞和抗生素持留菌的復(fù)蘇動(dòng)力學(xué)角度論述了它們是兩種不同的休眠狀態(tài)，其中VBNC細(xì)胞處于較深的休眠狀態(tài)，而抗生素持留菌則處于較短暫的早期休眠狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)室在對金黃色葡萄球菌VBNC狀態(tài)形成機(jī)制的研究過程中，從VBNC細(xì)胞誘導(dǎo)液中分離出了一種蛋白，通過序列比對發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于一種毒素蛋白，并通過實(shí)驗(yàn)證明該蛋白會(huì)顯著影響VBNC細(xì)胞的形成。目前，已有大量研究證明TA系統(tǒng)參與持留菌的形成，但有關(guān)TA系統(tǒng)與VBNC狀態(tài)形成關(guān)系的報(bào)道仍較少。本文將從TA觸發(fā)系統(tǒng)及TA系統(tǒng)本身在VBNC狀態(tài)微生物中的表達(dá)情況及對VBNC狀態(tài)形成的作用綜述TA系統(tǒng)對微生物VBNC狀態(tài)形成的影響。

圖2 微生物休眠連續(xù)體假說[32]Fig. 2 Schematic representation of the microbial dormancy continuum hypothesis[32]

2 TA系統(tǒng)概述

典型的TA系統(tǒng)由穩(wěn)定的毒素和不穩(wěn)定的抗毒素組成，二者的編碼基因位于細(xì)菌質(zhì)粒或染色體中。毒素和抗毒素協(xié)同表達(dá)，構(gòu)成一個(gè)發(fā)揮多種功能的調(diào)控系統(tǒng)，在細(xì)菌耐受外界壓力、發(fā)揮毒力作用、抵御噬菌體侵染、調(diào)控生物膜形成、維持基因組穩(wěn)定性等多個(gè)方面發(fā)揮作用。除了典型的TA系統(tǒng)外，研究者還發(fā)現(xiàn)了非典型的三組分TA系統(tǒng)，由毒素蛋白、抗毒素、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或者分子伴侶組成，其中分子伴侶可以促進(jìn)抗毒素折疊以及保護(hù)抗毒素免于降解。

根據(jù)毒素與抗毒素的化學(xué)組成及二者相互作用的方式，可將TA系統(tǒng)分為8 種類型，其中包括6 種被廣泛報(bào)道的TA系統(tǒng)及2 種新提出的TA系統(tǒng)，被命名為I～VIII型TA系統(tǒng)。其中，I、III型及VIII型TA系統(tǒng)的抗毒素是RNA，其余5 種TA系統(tǒng)中的抗毒素都是蛋白質(zhì)；另外，除了最新發(fā)現(xiàn)的VIII型TA系統(tǒng)的毒素是RNA，其余TA系統(tǒng)的毒素都是蛋白質(zhì)。在這8 種TA系統(tǒng)中，抗毒素抑制毒素發(fā)揮作用的方式多樣，可概括為抑制毒素蛋白的翻譯、直接與毒素結(jié)合而影響其功能的發(fā)揮、干擾毒素與靶標(biāo)的結(jié)合、作為適配器促進(jìn)毒素蛋白的降解、對毒素進(jìn)行修飾等?，F(xiàn)對每種TA系統(tǒng)中抗毒素與毒素的作用方式進(jìn)行介紹。在I型TA系統(tǒng)中，抗毒素是RNA，其序列與編碼毒素蛋白的mRNA序列是互補(bǔ)的，因此抗毒素可與編碼毒素蛋白的mRNA結(jié)合，抑制毒素翻譯，從而起到調(diào)控毒素表達(dá)的作用。在II型TA系統(tǒng)中，毒素與抗毒素都是蛋白質(zhì)，抗毒素蛋白通過與毒素蛋白的親和結(jié)合而抑制毒素的毒性。在III型TA系統(tǒng)中，抗毒素是RNA，能直接作用于毒素蛋白，從而抑制毒素活性。在IV型TA系統(tǒng)中，抗毒素是蛋白質(zhì)，但是不能直接與毒素蛋白結(jié)合，而是通過與毒素蛋白的靶標(biāo)相互作用，從而間接抑制毒素蛋白發(fā)揮功能。在V型TA系統(tǒng)中，抗毒素是一種核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），可特異性切割編碼毒素蛋白的mRNA，阻止其翻譯。在VI型TA系統(tǒng)中，抗毒素SocA作為適配器促進(jìn)酪蛋白裂解酶（caseinolytic protease，Clp）XP對毒素蛋白SocB的降解。不同于以上6 種類型，在Hha/TomB、TglT/TakA以及HepT/MntA這3 種TA系統(tǒng)中，抗毒素（TomB、TakA、MntA）通過對其同源毒素（Hha、TglT、HepT）修飾而發(fā)揮對毒素蛋白的拮抗作用，研究者建議將這種類型的TA系統(tǒng)命名為“VII型TA系統(tǒng)”。在大腸桿菌的Hha/TomB TA系統(tǒng)中，抗毒素TomB可氧化毒素蛋白Hha保守的半胱氨酸殘基，從而使毒素蛋白失活；在結(jié)核分枝桿菌（）的TglT/TakA TA系統(tǒng)中，抗毒素TakA是一種新型的非典型絲氨酸蛋白激酶，通過磷酸化毒素蛋白TglT的S78位點(diǎn)而抑制毒素蛋白的活性；在廣泛存在于細(xì)菌和古生菌中的HepT/MntA TA系統(tǒng)中，MntA抗毒素具有核酸轉(zhuǎn)移酶活性，可將3 個(gè)AMP轉(zhuǎn)移到毒素蛋白HepT活性位點(diǎn)附近的酪氨酸殘基上，抑制毒素發(fā)揮作用。在VIII型TA系統(tǒng)中，毒素SdsR（也稱RyeB）和抗毒素RyeA是由相同位點(diǎn)的DNA正負(fù)鏈分別編碼的sRNA，因此抗毒素可以與毒素互補(bǔ)形成堿基對以中和毒素的作用。但TA系統(tǒng)的成員并不只有這8 種。Li Ming等近期在上發(fā)文報(bào)道了一類全新的TA系統(tǒng)，該系統(tǒng)由兩個(gè)sRNA組成，包括毒素和抗毒素，該TA系統(tǒng)可有效守護(hù)常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)（clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system，CRISPR-Cas）的結(jié)構(gòu)和功能。CRISPR-Cas系統(tǒng)是在微生物中廣泛存在的抗病毒免疫系統(tǒng)，Li Ming等發(fā)現(xiàn)當(dāng)這種新的TA系統(tǒng)與CRISPR-Cas偶聯(lián)存在時(shí)，Cas效應(yīng)蛋白可以和抗毒素共同抑制毒素的表達(dá)，而一旦Cas效應(yīng)蛋白被破壞（如病毒侵入），毒素就會(huì)表達(dá)并殺死微生物細(xì)胞，從而保護(hù)群體中其他細(xì)胞不被侵染，這是一種利他主義的群體防御策略。

通過TA系統(tǒng)成員的不斷增加，可以發(fā)現(xiàn)TA系統(tǒng)在微生物中存在普遍性，由此可見TA系統(tǒng)對微生物的生存發(fā)揮重要作用。

3 TA系統(tǒng)對VBNC狀態(tài)形成的影響

在外界環(huán)境惡劣時(shí)，微生物TA系統(tǒng)會(huì)被激活，其中的抗毒素含量下降，毒素游離出來，發(fā)揮毒性作用，進(jìn)而抑制微生物生長。關(guān)于TA系統(tǒng)在不良環(huán)境中如何被激活存在爭議，目前研究者提出了激活TA系統(tǒng)的兩種模式，分別是被動(dòng)模式和主動(dòng)模式。被動(dòng)模式認(rèn)為，微生物為了應(yīng)對逆境降低了編碼抗毒素的mRNA的翻譯速率，導(dǎo)致抗毒素含量降低，毒素活性得以發(fā)揮。在被動(dòng)模式中，TA系統(tǒng)中抗毒素的產(chǎn)生速率易變，但其降解速率相對恒定。主動(dòng)模式認(rèn)為，不良環(huán)境會(huì)刺激微生物產(chǎn)生信號(hào)分子，信號(hào)分子進(jìn)一步觸發(fā)蛋白酶降解抗毒素，使毒素活性得以發(fā)揮，進(jìn)而影響細(xì)菌生長。在主動(dòng)模式中，TA系統(tǒng)中抗毒素的產(chǎn)生速率恒定，但其降解速率易變。關(guān)于TA系統(tǒng)激活模式存在不同看法，可能是菌種的差異性及TA系統(tǒng)的復(fù)雜性導(dǎo)致的。TA觸發(fā)系統(tǒng)對TA系統(tǒng)的激活屬于主動(dòng)模式，而且已有研究表明TA觸發(fā)系統(tǒng)與VBNC狀態(tài)形成存在一定關(guān)系。

3.1 TA觸發(fā)系統(tǒng)對VBNC狀態(tài)形成的影響

TA觸發(fā)系統(tǒng)包括、、、、、、和這8 種基因。已有研究表明TA觸發(fā)系統(tǒng)中的、、、、與微生物VBNC狀態(tài)的形成存在一定關(guān)系?；蚓幋a信號(hào)分子鳥苷四磷酸（guanosine tetraphosphate，ppGpp）的合成酶蛋白R(shí)elA，ppGpp可以感知環(huán)境脅迫、調(diào)控DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，是一種可誘導(dǎo)微生物進(jìn)入持留狀態(tài)和VBNC狀態(tài)的應(yīng)激因子；基因編碼的SpoT蛋白具有ppGpp水解酶活性和微弱的合成酶活性；編碼的Lon蛋白酶是ATP依賴蛋白酶，可以降解II型抗毒素；編碼外切聚磷酸酶（exopolyphosphatase，PPX），經(jīng)典的PPX是單功能的，可維持多聚磷酸鹽（polyphosphate，PolyP）的穩(wěn)態(tài)，另一類是雙功能的PPX/鳥苷五磷酸水解酶（PPX/guanosine pentaphosphate phosphohydrolase，PPX/GPPA），PPX/GPPA酶同時(shí)具有PPX和GPPA活性，負(fù)責(zé)產(chǎn)生ppGpp；編碼多聚磷酸鹽激酶（polyphosphate kinase，PPK），可介導(dǎo)PolyP的合成，而PolyP可激活Lon蛋白酶降解抗毒素。Zhang Jingfeng等用氨芐西林誘導(dǎo)阪崎腸桿菌（）進(jìn)入VBNC狀態(tài)，并比較了阪崎腸桿菌、、、、、這6 種基因在對數(shù)生長期和VBNC狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)、、、、基因在VBNC細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，而基因在VBNC細(xì)胞中的表達(dá)沒有顯著性變化，因此提出了阪崎腸桿菌VBNC狀態(tài)形成的可能機(jī)制，即RelA和PPX/GPPA作用生成ppGpp，ppGpp通過激活PPK來積累PolyP，積累的PolyP可進(jìn)一步激活Lon蛋白酶使抗毒素降解，由此釋放的游離毒素誘導(dǎo)阪崎腸桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

除了從TA觸發(fā)系統(tǒng)整體出發(fā)揭示其與VBNC狀態(tài)形成的關(guān)系，還有研究從TA觸發(fā)系統(tǒng)中某個(gè)組分入手探討它對VBNC狀態(tài)形成的影響，下文對TA觸發(fā)系統(tǒng)中單個(gè)組分的作用進(jìn)行介紹。

3.1.1對VBNC狀態(tài)形成的影響

在VBNC狀態(tài)微生物中的差異表達(dá)已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)。Mishra等在4 ℃淡水體系中誘導(dǎo)霍亂弧菌的VBNC狀態(tài)，并分別比較了誘導(dǎo)第0、3、7、16、23天后（已進(jìn)入VBNC狀態(tài)）菌體中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在VBNC菌體中的表達(dá)量上調(diào)了60.8 倍。Zhang Jingfeng等用氨芐西林處理阪崎腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在VBNC細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)了3.7 倍。上述研究均發(fā)現(xiàn)TA觸發(fā)系統(tǒng)中的基因在VBNC狀態(tài)微生物中超量表達(dá)，因此推測RelA可能參與VBNC狀態(tài)的形成，這種推測被Jayakumar等的研究證實(shí)。Jayakumar等比較了4 ℃和30 ℃下人工海水中誘導(dǎo)霍亂弧菌野生型與缺失株進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間，結(jié)果顯示在30 ℃下二者進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間沒有顯著性差異，但在4 ℃下野生型比缺失株更快進(jìn)入VBNC狀態(tài)，這表明可以促進(jìn)霍亂弧菌VBNC狀態(tài)的形成。但值得注意的是，在VBNC狀態(tài)微生物中的表達(dá)情況與菌株類型有關(guān)。在5 ℃條件下，Nowakowska等用人工海水誘導(dǎo)霍亂弧菌臨床分離株（C-基因型）和環(huán)境分離株（E-基因型）進(jìn)入VBNC狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)C-基因型的VBNC細(xì)胞與指數(shù)期細(xì)胞的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異，而對于E-基因型的VBNC細(xì)胞，的表達(dá)較指數(shù)期細(xì)胞顯著提高。通過上述研究，認(rèn)為在某些微生物的VBNC狀態(tài)形成中起到一定作用，這種作用的發(fā)揮應(yīng)與ppGpp有關(guān)。

3.1.2 Lon蛋白酶對VBNC狀態(tài)形成的影響

Lon蛋白酶通過降解II型抗毒素而導(dǎo)致菌體內(nèi)的毒素抗毒素比例失調(diào)，引起游離毒素的釋放，一些毒素會(huì)抑制微生物的復(fù)制、翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控微生物進(jìn)入休眠狀態(tài)。Zhang Jingfeng等用氨芐西林誘導(dǎo)阪崎腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VBNC細(xì)胞中基因的表達(dá)量顯著上調(diào)了63.0 倍。目前關(guān)于Lon蛋白酶在VBNC狀態(tài)形成中的作用研究還比較少。然而，另一種與Lon蛋白酶有相似底物識(shí)別域的壓力應(yīng)激蛋白酶已經(jīng)被證明在VBNC狀態(tài)形成中發(fā)揮重要作用。當(dāng)研究金黃色葡萄球菌中各種蛋白酶對菌體內(nèi)3 種抗毒素MazE、Axe1和Axe2的半衰期影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有或缺失株的抗毒素很穩(wěn)定，因此認(rèn)為ClpPC是降解金黃色葡萄球菌中抗毒素的主要蛋白酶。Kusumoto等對鼠傷寒沙門氏菌（）的野生型菌株及Δ和突變株進(jìn)行VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)Δ和突變株中的RpoS蛋白表達(dá)水平比野生型菌株中更高，而且突變株進(jìn)入VBNC狀態(tài)的時(shí)間也出現(xiàn)延遲，這說明ClpX中的323～355位殘基在ClpX功能發(fā)揮上至關(guān)重要，并且ClpX可以通過降解RpoS來促進(jìn)VBNC狀態(tài)的形成。基于上述研究，推測與Clp蛋白酶類似，TA觸發(fā)系統(tǒng)中的Lon蛋白酶同樣通過降解抗毒素來促進(jìn)微生物VBNC狀態(tài)的形成。

3.2 TA系統(tǒng)中毒素和抗毒素對VBNC狀態(tài)形成的影響

Ayrapetyan等于2015年提出了微生物的休眠連續(xù)體假說，認(rèn)為微生物的VBNC狀態(tài)是比持留狀態(tài)更深層的休眠狀態(tài)，二者之間存在許多相似的表型特征，并且有一些共有的分子機(jī)制調(diào)控二者的形成。研究發(fā)現(xiàn)TA系統(tǒng)可通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞生長和持留性，近年也有研究證明TA系統(tǒng)亦參與VBNC狀態(tài)的形成。

Pedersen等研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)毒素基因和的轉(zhuǎn)錄會(huì)使大腸桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，隨后誘導(dǎo)抗毒素基因和的轉(zhuǎn)錄會(huì)完全逆轉(zhuǎn)這種狀態(tài)；同時(shí)該研究者發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄會(huì)嚴(yán)重抑制該菌的翻譯能力，而的轉(zhuǎn)錄會(huì)同時(shí)抑制DNA的復(fù)制與蛋白質(zhì)翻譯。Christensen等也發(fā)現(xiàn)毒素ChpAK和ChpBK會(huì)抑制大腸桿菌的菌落形成及蛋白質(zhì)翻譯能力。Korch等研究發(fā)現(xiàn)毒素基因在大腸桿菌中的過表達(dá)會(huì)抑制大分子合成并誘導(dǎo)VBNC狀態(tài)的形成。Christensen-Dalsgaard等研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌中的毒素基因在大腸桿菌中過表達(dá)可以激活切割mRNA，抑制翻譯，從而促使該菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。Demidenok等首次證實(shí)了TA系統(tǒng)參與分枝桿菌（）休眠狀態(tài)的形成，研究發(fā)現(xiàn)該菌在向VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中伴隨著毒素基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)毒素基因可以促使恥垢分枝桿菌（）進(jìn)入VBNC狀態(tài)，而過表達(dá)抗毒素基因則使細(xì)胞不能形成VBNC狀態(tài)。Hino等將副溶血性弧菌（）中II型TA系統(tǒng)的毒素基因在大腸桿菌中表達(dá)使大腸桿菌的細(xì)胞形態(tài)從桿狀變?yōu)榻z狀，同時(shí)細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)；而與抗毒素基因共表達(dá)后對大腸桿菌的生長沒有影響，并且可以抑制由單獨(dú)表達(dá)引起的菌體細(xì)胞形態(tài)變化。因?yàn)榧?xì)菌形態(tài)變化通常與細(xì)胞不完全分裂有關(guān)，因此VP1843毒素蛋白可能通過抑制細(xì)胞分裂而使微生物形成VBNC狀態(tài)。Ayrapetyan等研究了II型TA系統(tǒng)和中毒素基因和在VBNC狀態(tài)創(chuàng)傷弧菌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在VBNC菌體中和的表達(dá)分別上調(diào)了16.8 倍和7.0 倍，但的表達(dá)沒有顯著性變化，另外、以及的表達(dá)分別顯著上調(diào)了20、23 倍和111 倍，這些毒素基因在VBNC細(xì)胞中的過量表達(dá)表明這些TA系統(tǒng)可能在VBNC狀態(tài)形成中發(fā)揮促進(jìn)作用。Gupta等對結(jié)核分枝桿菌中的一種TA系統(tǒng)MparDE2進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)毒素基因在大腸桿菌中的異位表達(dá)可以促使大腸桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)；進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MParE2毒素蛋白可以抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶活性；當(dāng)將一定比例的MParD2抗毒素與MParE2毒素蛋白混合孵育30 min后再加入DNA旋轉(zhuǎn)酶反應(yīng)混合物中，DNA旋轉(zhuǎn)酶可以正常發(fā)揮功能；然而，當(dāng)DNA旋轉(zhuǎn)酶與MParE2先孵育一段時(shí)間，再加入MParD2則不能逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。因此可以得出MParE2毒素蛋白是通過抑制微生物體內(nèi)DNA旋轉(zhuǎn)酶的功能而誘導(dǎo)VBNC狀態(tài)的形成?？傊?，以上研究都表明TA系統(tǒng)中的毒素蛋白對微生物VBNC狀態(tài)的形成起促進(jìn)作用。Aakre等研究了新月柄桿菌（）的一種非典型TA系統(tǒng)SocAB中的毒素SocB與抗毒素SocA的互作機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在有表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)之后，細(xì)胞活性和形態(tài)沒有顯著變化；然而，在沒有表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，細(xì)胞活性顯著下降，菌落形成受到抑制，并且導(dǎo)致了細(xì)胞絲狀化；并發(fā)現(xiàn)毒素SocB通過與滑動(dòng)鉗直接相互作用而抑制DNA復(fù)制延伸，由此也可推測TA系統(tǒng)參與了對微生物VBNC狀態(tài)形成的調(diào)控。

通過上述研究成果，本文總結(jié)了TA系統(tǒng)對微生物VBNC狀態(tài)形成的可能影響機(jī)制（圖3）：在不良環(huán)境下，TA觸發(fā)系統(tǒng)中的基因發(fā)生差異表達(dá)，引起抗毒素的降解，導(dǎo)致毒素-抗毒素的比例失調(diào)，使游離毒素含量增加，這些游離毒素通過抑制DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)翻譯、促進(jìn)mRNA斷裂、抑制細(xì)胞分裂等促進(jìn)微生物VBNC狀態(tài)的形成。

圖3 TA系統(tǒng)對微生物VBNC狀態(tài)形成的可能影響機(jī)制Fig. 3 Possible mechanisms for the influence of TA systems on the formation of microbial VBNC

4 結(jié) 語

微生物進(jìn)入VBNC狀態(tài)后代謝活性降低，且不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長繁殖，因此VBNC狀態(tài)微生物不能被常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測，也不能進(jìn)行某些生理活性檢測，引起假陰性的檢測結(jié)果，從而給人類健康帶來潛在威脅。已有證據(jù)表明VBNC狀態(tài)致病菌參與食源性疾病暴發(fā)。本文從微生物普遍存在的TA系統(tǒng)出發(fā)，根據(jù)已有的研究成果，提出了TA系統(tǒng)對微生物VBNC狀態(tài)形成的可能影響機(jī)制。但是，為了有效控制VBNC狀態(tài)的形成，目前的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，除了要明確TA系統(tǒng)中毒素和抗毒素在VBNC菌體中的表達(dá)量及在VBNC狀態(tài)形成中的作用方式之外，還應(yīng)研究抗毒素對毒素解除制約的確切機(jī)制以及毒素在VBNC狀態(tài)形成中發(fā)揮作用的活性位點(diǎn)，從而為尋找抑制VBNC狀態(tài)形成的方法提供明確方向。此外，新的TA系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)也為揭示微生物的VBNC狀態(tài)形成機(jī)制提供研究方向。