1-甲基環(huán)丙烯對‘香水’梨果實品質(zhì)和揮發(fā)性成分及相關(guān)基因表達的影響

趙江麗，何近剛，岳盈肖，閆子茹，馮云霄，程玉豆，關(guān)軍鋒,*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所，河北 石家莊 050051；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001）

‘香水’梨（Maxim）屬秋子梨系統(tǒng)，果實呈圓形，直徑4～6 cm，單果質(zhì)量130 g左右，味道甘甜、微酸，深秋成熟，果皮黃綠色，采收時質(zhì)硬，在采后貯藏過程中逐漸變得柔軟多汁，并產(chǎn)生濃郁的香味物質(zhì)，品質(zhì)優(yōu)良，深受消費者喜歡。但‘香水’梨果實在常溫下貯藏10 d左右即開始軟化，之后腐爛，貨架期較短。因此，研究貯藏保鮮技術(shù)以延長‘香水’梨的貨架期具有重要意義。

梨是典型的呼吸躍變型水果，其采后的成熟衰老過程與乙烯的誘導(dǎo)作用密切相關(guān)。1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）是乙烯作用的抑制劑，能有效抑制果實乙烯生成，延緩果實衰老，有效延長果實的保鮮時間，在果實采后處理中得到廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理可顯著推遲庫爾勒香梨在貯藏過程中硬度、可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）和可滴定酸含量的降低，抑制呼吸強度和乙烯釋放；降低安梨果實的呼吸強度和乙烯釋放量，維持果實內(nèi)在品質(zhì)和果皮顏色亮度，延緩果實衰老，抑制低溫貯藏后貨架期黑皮病發(fā)生；有效延緩‘南果’梨的硬度降低、維持內(nèi)在品質(zhì)、延長貨架期。

香氣是水果品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一，是果實內(nèi)部揮發(fā)性成分（volatile organic components，VOCs）共同作用的結(jié)果，與果實的糖、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分合成密切相關(guān)，可以一定程度反映果實的成熟、衰老和腐爛等生理變化。研究認為1-MCP對果實的VOCs生成有重要影響，如減少梨果實的香氣物質(zhì)，下調(diào)香氣生成相關(guān)基因的表達。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP可以延緩‘香紅’梨果實的后熟進程，抑制乙烯和部分VOCs的合成，但1-MCP處理對果實的乙烯生成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及VOCs合成相關(guān)基因表達影響的研究較少。

本研究以‘香水’梨為材料，考察了1-MCP處理對其果實品質(zhì)、呼吸和乙烯生成特性、VOCs組成變化的影響，并對其乙烯和香氣物質(zhì)生成相關(guān)基因的表達模式進行分析，以期進一步解析作用機理，為1-MCP在‘香水’梨貯藏保鮮中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘香水’梨于2019年9月18日采自河北省承德縣，果實接近完熟，當(dāng)天運回實驗室，室溫（（25±1）℃）過夜，挑選大小均一、無病蟲害和機械損傷的果實（平均單果質(zhì)量20.6 g；硬度6.65 kg/cm；SSC 6.65%），并隨機分為兩組，即處理組（1.0 μL/L 1-MCP熏蒸處理）和對照（CK）組（空氣），1-MCP處理18 h后，將果實置于室溫（（25±1）℃）條件下存放。貯藏期間，每3 d進行果實呼吸速率和乙烯釋放速率的測定，每6 d測定果實品質(zhì)，同時取果皮和果肉進行液氮速凍后，在-80 ℃下貯藏備用。每次取平行樣品3 份，每份重復(fù)測定3 次。

1-MCP 美國AgroFresh公司；2-辛酮 日本東京化成工業(yè)株式會社；氯化鈉（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green? Premix ExII聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymease chain reaction，PCR）試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。所有用水均為高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

GY-4型果實硬度計 浙江托普儀器有限公司；PAL-1型手持數(shù)字糖度計 日本愛拓公司；GC9790II型氣相色譜儀 浙江福立分析儀器有限公司；HWF-1型紅外線分析儀 江蘇金壇科析儀器有限公司；TQ-8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、SH-Rxi-5Sil MS型毛細管柱日本島津公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取柱美國Suplco公司；ABI 7500型定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 硬度及SSC測定

于果實赤道部位去果皮后采用硬度計測定硬度（單位為kg/cm）；采用手持數(shù)字糖度計測定SSC。

1.3.2 呼吸速率和乙烯釋放速率測定

每20 個果實置容器中密封，于密封30 min時抽取混勻氣體10 mL采用紅外線分析儀測定密閉氣體中CO質(zhì)量，按公式（1）計算呼吸速率；于密封3 h時抽取混勻氣體1 mL注入氣相色譜儀測定乙烯體積，按公式（2）計算乙烯釋放速率。

1.3.3 VOCs測定

樣品制備：參考Chen Jiluan等方法，準(zhǔn)確稱取適量果皮或果肉粉末凍樣于15 mL頂空瓶中，加入一定體積的飽和氯化鈉溶液，加入0.2 mL質(zhì)量濃度1 μg/mL 2-辛酮溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液，于40 ℃水浴中磁力攪拌30 min，經(jīng)固相微萃取柱吸附30 min，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定VOCs。

固相微萃取條件：固相微萃取頭活化時間7 min，孵育溫度40 ℃，孵育時間30 min，吸附時間30 min，解吸時間1 min。

氣相色譜條件：SH-Rxi-5Sil MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min，2 ℃/min升溫至100 ℃（保持2 min），4 ℃/min升溫至250 ℃（保持5 min），進樣口溫度250 ℃，載氣：高純氦氣，柱流量1 mL/min，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子電離離子源，離子源溫度200 ℃，碰撞能量70 eV，接口溫度250 ℃，溶劑延遲時間3 min，工作模式Scan，掃描范圍/35～500，通過匹配NIST 17.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及保留指數(shù)進行定性，采用內(nèi)標(biāo)法計算各成分的含量。

1.3.4 RNA提取與定量分析

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取總RNA?？俁NA經(jīng)DNase清除DNA后，用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，按照定量PCR反應(yīng)試劑盒TB Green? Premix ExII說明書進行定量分析。設(shè)計基因及其引物序列見表1，所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以為內(nèi)參基因，通過2法計算待測基因相對表達量。

表1 定量PCR引物序列[20-24]Table 1 Primer sequences used for real-time PCR[20-24]

續(xù)表1

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019軟件對采集數(shù)據(jù)進行計算，結(jié)果以平均值表示；采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行組間Duncan’s檢驗，比較差異顯著性。采用HemI 1.0（Heatmap Illustrator）軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘香水’梨貯藏過程中的品質(zhì)變化

貯藏過程中，‘香水’梨硬度逐漸降低、SSC逐漸升高。相對來說，CK組變化明顯，1-MCP處理組的變化較為緩慢，顯著抑制了硬度降低和SSC升高（＜0.05）（圖1）。

圖1 ‘香水’梨果實硬度（A）和SSC（B）變化Fig. 1 Changes in firmness (A) and SSC (B) of ‘Xiangshui’ pear

2.2 ‘香水’梨貯藏過程中的呼吸速率和乙烯釋放速率變化

貯藏過程中，CK組果實的呼吸速率呈先升高后降低趨勢，其峰值出現(xiàn)在第6天，1-MCP組果實的呼吸速率與相同貯藏時間的CK組相比顯著降低（＜0.05），且呈先降低后升高趨勢。同樣的，CK組果實的乙烯釋放速率在9 d出現(xiàn)峰值，之后明顯降低，而1-MCP組則緩慢升高，且同期顯著低于CK組（＜0.05）（圖2）。

圖2 ‘香水’梨果實呼吸速率（A）和乙烯釋放速率（B）變化Fig. 2 Changes in respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of‘Xiangshui’ pear

2.3 ‘香水’梨貯藏過程中的VOCs種類及含量變化

利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法從香水梨果皮和果肉中共分離鑒定出80 種VOCs，其中酯類48 種、醛類8 種、烷類8 種、醇類7 種、萜烯類6 種、酮類2 種及酚類1 種（表2）。果皮中VOCs數(shù)量和總含量明顯高于果肉，1-MCP組明顯低于CK組（圖3）。

圖3 ‘香水’梨果皮和果肉中不同種類VOCs含量變化Fig. 3 Changes in contents of VOCs in ‘Xiangshui’ pear

果皮中檢出72 種VOCs，主要是酯類、醛類和-法尼烯，醇類和烷類含量次之（表2）。不同貯藏時間果皮中VOCs總量表現(xiàn)為CK組6 d＞12 d＞0 d、1-MCP組12 d＞0 d＞6 d（圖3）。由表2可知，酯類以乙酯、己酯為主，其次是甲酯和丁酯，其中己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸己酯、丁酸己酯的含量依次降低，己酸甲酯、辛酸甲酯、乙酸丁酯和()-2-辛烯酸乙酯含量較少。兩組果實果皮中醛類總量均隨貯藏期延長而逐漸降低，其中約80%是()-2-己烯醛、其次為己醛和壬醛，其他醛類成分含量很少。醇類主要是辛醇和己醇。十一烷、十六烷和十四烷是主要的烷類成分，前者在兩組果皮中含量呈遞減趨勢，后兩者均呈遞增趨勢。CK組果皮中萜烯總量及各成分含量均隨貯藏期延長逐漸升高，1-MCP組則先降低后升高，-法尼烯是最主要的萜烯成分，()-金合歡烯和()--香檸檬醇含量較少。酮類含量極少，主要是6-甲基-5-庚烯-2-酮，其在果皮中的含量也隨貯藏期延長先增加后減少。1-MCP明顯降低了果皮中-法尼烯和6-甲基-5-庚烯-2-酮含量。

果肉中共檢出56 種VOCs，主要是酯類、萜烯、醇類、醛類、烷類，其含量相對低于果皮（表2）。與果皮類似，不同貯藏期果肉中VOCs總量表現(xiàn)為CK組6 d＞12 d＞0 d、1-MCP組12 d＞6 d＞0 d（圖3）。酯類是果肉中的主要VOCs，其含量變化規(guī)律與VOCs總量一致。由表2可知，己酯類和乙酯類是主要酯類，己酸乙酯和乙酸己酯是主要成分，其后依次是丁酸乙酯、辛酸乙酯、(Z,)-2,4-癸二烯酸甲酯、己酸甲酯、乙酸辛酯、乙酸丁酯等。-法尼烯含量占萜烯總量的90%以上，CK組和1-MCP組果肉中-法尼烯含量均隨貯藏期延長而遞增，1-MCP組明顯低于CK組。果肉中醇類含量較低，主要是辛醇和少量癸醇、己醇。果肉中醛類總量隨貯藏期延長遞減，各成分含量均很低，其中己醛和()-2-己烯醛僅在0 d果肉中檢出，6、12 d未檢出。CK組果肉中烷類含量隨貯藏期延長遞減，而1-MCP組則先增加后減少，其中癸烷僅在0 d檢出，6、12 d未檢出，十一烷在0 d時未檢出而在6、12 d檢出（表2）。

由表2可知，隨貯藏期的延長，CK組果皮中己醛含量逐漸降低，而1-MCP組果皮中己醛含量一直保持較高水平；兩組果皮中()-2-己烯醛含量均逐漸減少。1-MCP組果皮中己醇含量的減少趨勢得到抑制，而辛醇含量明顯下降，()-4-癸烯醇和癸醇未檢出。與對‘南國’梨的研究結(jié)果一致，1-MCP顯著抑制了‘香水’梨中酯類成分的生成。1-MCP組果皮中酯類成分比CK組少12 種，主要成分乙酸己酯、丁酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸甲酯、丁酸乙酯、己酸己酯、乙酸庚酯、乙酸丁酯、2-辛烯酸甲酯、(,)-2,4-癸二烯酸乙酯和3-(甲硫基)丙酸乙酯的含量顯著降低甚至消失。

表2 ‘香水’梨果皮和果肉中VOCs含量Table 2 Contents of VOCs in peel and flesh of ‘Xiangshui’ pears μg/kg

續(xù)表2 μg/kg

2.4 ‘香水’梨貯藏過程中相關(guān)基因表達的PCR定量結(jié)果

貯藏過程中，乙烯合成基因和的表達量在兩組果皮中呈上調(diào)趨勢，在1-MCP組果肉中也呈上調(diào)趨勢，在CK組果肉中先升后降，且1-MCP組明顯低于CK組（圖4），其變化規(guī)律與乙烯釋放速率基本一致，說明1-MCP可以顯著抑制乙烯合成基因的表達，進而抑制乙烯生成。存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的乙烯受體基因/、/對乙烯的響應(yīng)最快，其中，在1-MCP組果皮和果肉中的表達量遠低于CK組果皮和果肉；貯藏0 d時，/在1-MCP組果皮和果肉中的表達量遠低于CK組，隨貯藏期延長兩組間差異縮小甚至消失；在1-MCP組果皮中的表達量明顯低于CK組，在果肉中的表達整體來看1-MCP組和CK組相當(dāng)；綜合分析，1-MCP對乙烯受體相關(guān)基因/、/的表達具有抑制作用。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的表達，在CK組果皮和果肉中均呈先升后降趨勢，在1-MCP組果皮和果肉中均逐漸升高，1-MCP組果肉明顯低于CK組，貯藏6 d時1-MCP組果皮低于CK組；乙烯響應(yīng)因子基因的表達量，在CK組果皮和果肉中均呈逐漸降低趨勢，在1-MCP組果皮和果肉中卻逐漸升高，貯藏0 d和6 d時1-MCP組果皮明顯低于CK組，貯藏12 d時1-MCP組果皮反而高于CK組；這表明1-MCP對乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制和延遲變化的作用。

貯藏過程中，CK組果皮和果肉中、、表達量均呈先升后降趨勢，1-MCP組果皮和果肉中、、表達量均呈上升趨勢（圖4），且1-MCP組明顯低于CK組，此規(guī)律與VOCs總量變化規(guī)律一致，說明1-MCP可以抑制//基因表達，從而抑制脂肪酸轉(zhuǎn)化為VOCs。1-MCP組和CK組果皮、果肉中和基因的表達量均呈下調(diào)趨勢，且1-MCP組表達量整體上明顯高于CK組，說明1-MCP明顯抑制這種下調(diào)趨勢；相對來說，果皮、的表達量高于果肉（圖4）。CK組果皮和果肉中表達量在貯藏6 d時達到高峰，1-MCP整體上明顯下調(diào)了表達，1-MCP組果皮表達量明顯低于CK組，1-MCP組果肉表達量在貯藏0 d和6 d時低于CK組，貯藏至12 d時則高于CK組，果皮中表達量明顯高于果肉（圖4）。

圖4 1-MCP對‘香水’梨乙烯生成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、VOCs生成相關(guān)基因表達的影響Fig. 4 Effect of 1-MCP on the expression of genes associated with ethylene biosynthesis and signal transduction, VOCs synthesis in‘Xiangshui’ pears

2.5 ‘香水’梨貯藏過程中相關(guān)基因表達量之間的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性分析，香氣合成相關(guān)基因與乙烯合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達量之間存在一定的相關(guān)性（表3）。脂氧合酶相關(guān)基因、表達量均與乙烯合成相關(guān)基因、表達量及乙烯受體基因表達量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），表達量與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），酯類合成直接相關(guān)基因與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量顯著正相關(guān)（＜0.05）、與表達量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。醇合成相關(guān)基因、表達量則與、表達量呈極顯著負相關(guān)（＜0.01），表達量還與和表達量顯著負相關(guān)（＜0.05）。香氣合成各基因之間，表達量與和表達量均呈顯著正相關(guān)（＜0.05、＜0.01），表達量與、表達量呈顯著負相關(guān)（＜0.05），表達量與表達量呈顯著負相關(guān)（＜0.05）。這說明上述基因表達的變化影響了‘香水’梨貯藏期內(nèi)的香氣合成。

表3 ‘香水’梨乙烯生成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、VOCs合成相關(guān)基因表達量間相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of expression levels of genes related to ethylene biosynthesis and signal transduction, and VOCs synthesis in ‘Xiangshui’ pears

3 討 論

秋子梨在采后貯藏過程中會發(fā)生一系列的生理變化而后熟，果實逐漸變得柔軟多汁、香味濃郁，食用性變好。果實的后熟與乙烯密切相關(guān)，一方面果實在后熟過程中會釋放大量乙烯，另一方面乙烯可以促進果實成熟。1-MCP可以與乙烯受體不可逆結(jié)合，阻止乙烯受體與乙烯的結(jié)合，進而抑制乙烯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和乙烯的產(chǎn)生達到保鮮目的，但新生成的乙烯受體不與1-MCP結(jié)合，會逐漸弱化1-MCP的保鮮作用。本實驗的研究結(jié)果與此一致，與CK組相比，1-MCP處理組‘香水’梨果實的乙烯生成速率顯著降低（圖2），果實硬度和SSC變化得到顯著抑制（＜0.05）（圖1），乙烯合成酶相關(guān)基因和的表達量明顯下調(diào)（圖4），乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因/、/、和的表達量均被下調(diào)（圖4）；各項生理指標(biāo)、品質(zhì)指標(biāo)及相關(guān)基因的變化被抑制和延緩。

香氣是果實的重要表觀品質(zhì)，采后貯藏中，秋子梨的香氣品質(zhì)隨后熟逐漸濃郁、芳香，隨水果衰老、腐敗又逐漸變淡。果實VOCs合成路徑中某些關(guān)鍵酶及其基因表達受乙烯調(diào)控，外源乙烯量的增加可以促進果實VOCs生成，采用1-MCP進行保鮮處理會減少果實中芳香類成分的生成量。本研究結(jié)果顯示，CK組‘香水’梨果皮、果肉中的VOCs種類和總含量均為貯藏6 d時最高，1-MCP組果肉中的VOCs種類和含量在貯藏過程中逐漸增加，果皮中VOCs種類和總含量貯藏6 d時最少，組間同期比較1-MCP組少于CK組（圖3、表2）；這與兩組果皮、果肉中的脂氧合酶//相關(guān)基因表達量的變化情況（圖4）一致。此外，酯類合成直接相關(guān)基因表達量與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量顯著正相關(guān)（＜0.05）、與乙烯受體基因表達量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），醇合成相關(guān)基因表達量與乙烯合成相關(guān)基因、表達量極顯著負相關(guān)（＜0.01），與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、表達量顯著負相關(guān)（＜0.05），表達量與乙烯合成相關(guān)基因、表達量極顯著負相關(guān)（＜0.01），說明乙烯信號系統(tǒng)通過調(diào)控果實VOCs合成相關(guān)基因表達，影響果實VOCs的合成。

4 結(jié) 論

‘香水’梨采后貯藏過程中果實逐漸軟化、SSC增加，VOCs的種類和含量逐漸增加，1-MCP處理有利于維持‘香水’梨果實貯藏中的硬度和SSC，抑制果皮和果肉中VOCs合成。1-MCP可通過下調(diào)‘香水’梨果皮、果肉中的乙烯生成限速酶相關(guān)基因和、乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、/和的表達，降低脂氧合酶//及醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達量，抑制‘香水’梨采后品質(zhì)變化和VOCs生成。