冷藏期間灘羊肉保水性變化的機(jī)制

劉吉娟，楊 波，羅瑞明，李子欣，尤麗琴

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

保水性是衡量灘羊肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，可用蒸煮損失率和離心損失率來表示。目前，關(guān)于灘羊肉的研究主要集中于宰前控制對于灘羊肉品質(zhì)形成的影響。宰后因素對灘羊肉品質(zhì)影響方面，吳亮亮等研究發(fā)現(xiàn)不同食鹽添加量對灘羊肉保水性、剪切力以及水分分布均有顯著影響。張麗文等研究發(fā)現(xiàn)凍融處理的灘羊肉中不易流動水相對含量較高，自由水相對含量較低。而從蛋白質(zhì)水平解析貯藏過程中灘羊肉保水性的變化機(jī)制鮮有報道。

宰后貯藏期間，肉品的保水性受貯藏條件、糖酵解、肌肉pH值等因素影響，這些因素通過調(diào)節(jié)肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的降解影響肌肉結(jié)構(gòu)從而影響肌肉結(jié)構(gòu)中水分的貯存情況，而蛋白質(zhì)水平的變化是引起肌肉結(jié)構(gòu)變化的根本原因。左惠心研究表明糖酵解關(guān)鍵酶磷酸丙糖異構(gòu)酶可能是牦牛肉保水性的指示蛋白之一。劉秋鳳研究表明，糖代謝通過改變肌肉pH值影響豬肉保水性、肉色等品質(zhì)性狀的形成。因此，從蛋白質(zhì)水平解析貯藏過程中保水性變化的機(jī)制，從而尋找改善汁液損失的方法，對提高冷鮮肉品質(zhì)、降低企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞、組織或生物體中所表達(dá)的蛋白質(zhì)組成、變化及相互作用規(guī)律的學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)在肉品保水性研究相關(guān)領(lǐng)域也取得了可觀的進(jìn)展。di Luca等采用高分辨率雙向熒光差異凝膠電泳（twodimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）和免疫印跡法研究豬肉滲出液，發(fā)現(xiàn)磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白可能是預(yù)測保水性的生物標(biāo)志物。Zuo Huixin等研究表明，肌球蛋白輕鏈、熱休克蛋白27和磷酸丙糖異構(gòu)酶可能是牦牛腰長肌保水性的指示蛋白。然而，關(guān)于揭示宰后貯藏過程中灘羊肉保水性變化的機(jī)制鮮見報道。因此，本研究以6 月齡灘羊背最長肌為研究對象，測定4 ℃貯藏0、4、8 d時樣品的pH值、蒸煮損失率和離心損失率；采用基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究貯藏期間灘羊肌肉組織中蛋白質(zhì)表達(dá)情況，篩選差異蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒定0～4 d和4～8 d兩個貯藏階段共有的差異表達(dá)蛋白質(zhì)并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.8.0軟件對PPI進(jìn)行分析并篩選核心網(wǎng)絡(luò)；通過分析品質(zhì)指標(biāo)與核心網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)表達(dá)量的關(guān)系，初步揭示宰后貯藏過程中灘羊肉保水性變化的機(jī)制，為冷鮮灘羊肉品質(zhì)控制技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 月齡公灘羊采集于寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國GE公司；十二烷基磺酸鈉、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Amresco公司；三乙二胺碳酸鹽、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國普洛麥格公司；乙腈 美國Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

便攜式pH計 上海德圖儀器國際貿(mào)易有限公司；TG16W型離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋 滄州新三思試驗(yàn)儀器有限公司；Sciex Triple TOF 5600質(zhì)譜儀、Eksigent nanoLC-1D plus液相色譜系統(tǒng)（配有納升噴霧III離子源、Analyst TF 1.6數(shù)據(jù)處理軟件） 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；5910R冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司；Image Scanner III光密度掃描儀 美國GE Healthcare公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國賽默飛公司；VCX130超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 美國Sonics公司；Mini PROTEAN tetra Cell電泳儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選取體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊，屠宰后用滅菌刀取右側(cè)背最長肌，編號后置于聚乙稀薄膜內(nèi)，于風(fēng)速3 m/s、相對濕度80%、溫度4 ℃條件下貯存。

取貯藏0、4、8 d的樣品各200 g用于測定pH值、離心損失率及蒸煮損失率；取0、4、8 d的樣品各200 mg迅速置于液氮中放置2 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

采用尤麗琴等的方法從灘羊肉中提取總蛋白。iTRAQ-蛋白質(zhì)組學(xué)分析委托上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行，運(yùn)用Analyst TS 1.1軟件系統(tǒng)獲得蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)的定性及定量信采用Protein Pilot 5.0軟件獲得。檢索的數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫來源為UniProt。數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.5或FC＜1/1.5且＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異豐度蛋白質(zhì)。篩選出的差異豐度蛋白質(zhì)利用OmicsBean軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，比對后獲得差異基因的基因本體（gene ontology，GO）（包括生物過程、分子功能、細(xì)胞組分）功能信息，選擇差異最顯著的前10 個條目作圖。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路注釋分析。利用String數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）和Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行PPI分析及核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 pH值

取4 cm×4 cm×4 cm（60 g左右）灘羊背最長肌，使用便攜式數(shù)字pH計測量肌肉pH值，探頭沿肌纖維方向插入肉樣內(nèi)部，每個樣品至少測定3 個點(diǎn)，結(jié)果取均值。測定前剔除樣品可見脂肪與結(jié)締組織。

1.3.3.2 蒸煮損失率

蒸煮損失率的測定參考文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改。將樣品切割成6 cm×3 cm×3 cm的肉塊并稱質(zhì)量（），然后在80 ℃水浴鍋中加熱至樣品中心溫度75 ℃，取出后冷卻至室溫，用濾紙擦干表面水分后稱質(zhì)量（），按式（1）計算蒸煮損失率。

1.3.3.3 離心損失率

離心損失率的測定參照文獻(xiàn)[15]的方法并稍作修改。將約5 g的樣品準(zhǔn)確稱質(zhì)量（）后放置于10 mL離心管中，4 ℃以8 000 r/min離心10 min。除去離心管中滲出液后以濾紙吸干樣品表面水分后準(zhǔn)確稱質(zhì)量（）。按式（2）計算離心損失率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有指標(biāo)重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析及Pearson相關(guān)性分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著，采用Origin軟件作圖。采用微生信在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）對篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏期間灘羊背最長肌pH值及保水性變化

由表1可知，宰后0～4 d，pH值顯著降低（＜0.05），并于4 d時降至最低（5.58），4 d后略有回升。王薇等發(fā)現(xiàn)灘羊肉于0～4 ℃貯藏條件下連續(xù)放置7 d后其pH值呈先下降后上升趨勢，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。國內(nèi)外諸多學(xué)者研究表明家畜屠宰后初期ATP水解產(chǎn)生導(dǎo)致H含量增加以及能量代謝方式轉(zhuǎn)變引起的乳酸積累是導(dǎo)致貯藏初期pH值下降的主要原因，而pH值4～8 d升高可能是由于分解代謝消耗肌肉中所積累的酸性物質(zhì)。宰后貯藏過程中，肌肉pH值下降的速率和程度顯著影響代謝酶的活性，對于肉色、嫩度、保水性和風(fēng)味前體的形成有重要影響，是宰后初期肌肉最重要的品質(zhì)指標(biāo)。貯藏8 d內(nèi)蒸煮損失率與離心損失率均呈持續(xù)升高趨勢，二者均可表示肌肉的保水性，蒸煮損失率與離心損失率持續(xù)升高表明灘羊肉的保水性隨時間的延長逐漸變差。這與李升升的研究結(jié)果一致。據(jù)研究表明，畜禽屠宰后影響肌肉保水性的主要因素有肌肉結(jié)構(gòu)、pH值、糖酵解等。肌肉中有自由水、結(jié)合水和不易流動水3 種形式存在，共占肌肉的80%左右。肌肉結(jié)構(gòu)、pH值及糖酵解等變化所引起的水分狀態(tài)轉(zhuǎn)換以及水分儲存空間減少是導(dǎo)致灘羊肉保水性變差的主要原因。

表1 灘羊宰后貯藏過程中肌肉pH值及保水性的變化Table 1 Changes of pH and water holding capacity in Tan sheep meat from different aging stages

2.2 冷藏期間灘羊背最長肌蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果及差異蛋白篩選

對3 個貯藏時間段樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)行主成分分析，如圖1所示，貯藏時間可將樣本很好地區(qū)分開，同一貯藏時間樣本之間區(qū)分不明顯，不同貯藏時間樣本之間區(qū)分明顯，表明本實(shí)驗(yàn)樣品采集合理，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)可靠，滿足后續(xù)分析要求。

圖1 不同貯藏期樣本蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果Fig. 1 Principal component analysis plot of proteomic data of samples stored for different periods

2.2.1 差異蛋白質(zhì)篩選

以FC＞1.5或FC＜1/1.5且＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異豐度蛋白質(zhì)，4 d組對比0 d組共鑒定出83 個豐度顯著差異蛋白質(zhì)，其中，61 個為顯著上調(diào)，22 個為顯著下調(diào)（圖2A）；8 d組對比4 d組共鑒定出104 個豐度顯著差異蛋白質(zhì)，其中，14 個為顯著上調(diào)，90 個為顯著下調(diào)（圖2B）。

圖2 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質(zhì)的火山圖Fig. 2 Volcano plot of differential abundant proteins in Tan sheep meat during chilled storage

2.2.2 冷藏期間灘羊背最長肌差異蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.2.1 GO功能注釋富集分析結(jié)果

通過GO功能注釋對所篩選的差異豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息分析，通過生物過程、細(xì)胞組分、分子功能三方面解析其功能，結(jié)果表明，4 d對比0 d組顯著富集到441 個生物過程條目、117 個細(xì)胞組分條目和110 個分子功能條目；8 d對比4 d組顯著富集到769 個生物過程條目、85 個細(xì)胞組分條目和180 個分子功能條目，富集最顯著的前10 個條目如圖3所示。

圖3 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質(zhì)的GO注釋Fig. 3 Gene ontology annotation of differential abundant proteins in Tan sheep meat during chilled storage

由圖3A可知，宰后貯藏0～4 d，差異蛋白質(zhì)主要涉及到的生物過程包括肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、橫紋肌收縮、ATP代謝過程、骨骼肌收縮等；細(xì)胞組分主要包括肌原纖維、收縮纖維、收縮纖維部分、肌節(jié)、超分子纖維等；分子功能主要包括肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活力、氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力、電子載流子活度等。以上結(jié)果表明，灘羊屠宰后初期構(gòu)成肌肉結(jié)構(gòu)的肌原纖維、收縮纖維、肌節(jié)、超分子纖維等發(fā)生變化，這些變化可能引起了肌肉收縮、骨骼肌收縮等，發(fā)生變化的蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)主要負(fù)責(zé)肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。已有諸多研究表明肌肉的收縮狀態(tài)會引起肌肉結(jié)構(gòu)的變化，從而引起肉品保水性的變化。

由圖3B可知，宰后貯藏4～8 d，差異蛋白質(zhì)主要涉及到的生物過程包括肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、橫紋肌收縮、嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、核糖核苷三磷酸代謝過程等；在細(xì)胞組分中主要包括細(xì)胞外膜結(jié)合的細(xì)胞器、胞外外泌體、細(xì)胞外囊泡、胞外細(xì)胞器、肌原纖維等；在分子功能中主要包括細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、過氧化物酶活力、FATZ綁定、抗氧化活性、肌動蛋白結(jié)合等。以上結(jié)果表明，灘羊肉貯藏4 d后，除了肌肉收縮等變化，差異豐度蛋白質(zhì)還涉及了嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、核糖核苷三磷酸代謝過程等。

2.2.2.2 KEGG通路分析結(jié)果

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路注釋分析，結(jié)果表明，4 d對比0 d組顯著富集到23 個KEGG通路，8 d對比4 d組顯著富集到18 個KEGG通路。由圖4A可知，宰后貯藏0～4 d差異蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路包括代謝途徑、碳代謝、氨基酸的生物合成、2-氧代羰基酸代謝、淀粉和蔗糖代謝等；由圖4B可知，宰后貯藏4～8 d差異蛋白質(zhì)主要參與的KEGG通路包括碳代謝、氨基酸的生物合成、代謝途徑、2-氧代羰基酸代謝、糖酵解/糖異生等。這些代謝過程可能通過影響結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程間接影響肉品的保水性。

圖4 不同貯藏期灘羊肉差異蛋白質(zhì)的 KEGG通路注釋Fig. 4 KEGG pathway annotation of differential abundant proteins in Tan sheep muscle during chilled storage

2.2.3 核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

如圖5所示，34 個蛋白質(zhì)為0～4 d與4～8 d兩個貯藏階段共有的差異豐度蛋白質(zhì)。利用String數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）對共有的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行PPI分析，結(jié)果如圖6所示，共有34 個節(jié)點(diǎn)，其中24 個差異蛋白質(zhì)之間具有明顯的互作關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)中PPI富集的值為1.0×10，聚類系數(shù)為0.521。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選，結(jié)果如圖7所示，10 個蛋白質(zhì)（原肌球蛋白2（tropomyosin 2，TPM2）、肌球蛋白輕鏈1（myosin light chain 1，MYL1）、肌鈣蛋白I2（troponin I2，TNNI2）、肌鈣蛋白C2（troponin C2，TNNC2）、肌鈣蛋白T3（troponin T3，TNNT3）、肌球蛋白輕鏈2（myosin light chain 2，MYL2）、輔肌動蛋白α3（actinin alpha 3，ACTN3）、肌動蛋白（細(xì)胞質(zhì)1）（actin cytoplasmic 1，ACTB）、肌動蛋白α1（actin alpha 1，ACTA1）、輔肌動蛋白α2（actinin alpha 2，ACTN2））處于該核心網(wǎng)絡(luò)中，且全部為灘羊肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。

圖5 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質(zhì)的維恩圖Fig. 5 Venn diagram showing unique and shared differential abundant proteins

圖6 共有差異豐度蛋白質(zhì)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Interaction network of shared differential abundance proteins

圖7 PPI核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建Fig. 7 Constructed core protein-protein interaction (PPI) network

由表2可知，TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN3、ACTB、ACTA1、ACTN2均為灘羊肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)發(fā)生在4～8 d，可能是由于這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)于貯藏后期發(fā)生了降解，而肌肉中的水分又儲存于肌肉結(jié)構(gòu)中，因此對灘羊肉保水性具有重要影響。TPM2、MYL1和肌鈣蛋白等在0～4 d內(nèi)上調(diào)表達(dá)可能是由于應(yīng)激蛋白的防護(hù)作用試圖維持肌肉結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。這些蛋白質(zhì)位于肌節(jié)、細(xì)胞器，與細(xì)胞骨架蛋白或離子結(jié)合，參與肌肉收縮以及ATP酶活性的調(diào)節(jié)，富集于心肌收縮和肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的代謝通路，表明這些蛋白質(zhì)通過肌肉的收縮及肌肉結(jié)構(gòu)的變化來影響灘羊肉的保水性。

表2 核心網(wǎng)絡(luò)中差異豐度蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化趨勢Table 2 Changes in expression levels of differential abundance proteins in the core PPI network

2.3 影響灘羊肉保水性的機(jī)制

通過Pearson相關(guān)性分析確定核心蛋白質(zhì)表達(dá)量與灘羊肉保水性的關(guān)系。由表3可知，蒸煮損失率與離心損失率及MYL1表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與肌肉pH值及ACTA1表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與ACTN3表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；離心損失率與MYL2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），ACTN）表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；pH值與ACTB、ACTA1呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與MYL1、TNNC2、TNNT3和ACTN2表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與TPM2、TNNI2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，MYL1、ACTN3、ACTA1直接影響灘羊肉蒸煮損失，MYL2和ACTN3直接影響灘羊肉離心損失，其他結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)可能通過間接方式影響貯藏過程中灘羊肉保水性的變化。

表3 灘羊肉品質(zhì)指標(biāo)與核心差異豐度蛋白質(zhì)的相關(guān)性Table 3 Correlations between meat quality traits and core differential abundance proteins

相關(guān)性分析表明，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)對蒸煮損失、離心損失均有顯著影響，肌肉pH值影響宰后貯藏過程中TNNC2、TNNT3等結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變化，且肌肉pH值與灘羊肉保水性密切相關(guān)。諸多研究表明宰后貯藏期間鈣蛋白酶體系和細(xì)胞凋亡酶體系等組織蛋白水解酶促使細(xì)胞骨架蛋白降解會引起肌肉結(jié)構(gòu)的變化。Koohmaraie等研究表明，鈣蛋白酶系統(tǒng)在宰后肌肉蛋白質(zhì)水解中起著重要作用。其中-鈣蛋白酶誘導(dǎo)的關(guān)鍵肌原纖維蛋白降解是宰后肌肉蛋白水解的原因之一。王琳琳等研究表明，通過控制宰后肌肉細(xì)胞凋亡發(fā)生進(jìn)程來調(diào)節(jié)肌肉內(nèi)環(huán)境變化。肌肉中的水分主要以自由水、結(jié)合水和不易流動水3 種形式儲存于肌肉結(jié)構(gòu)中，因此肌肉的收縮及肌肉結(jié)構(gòu)的變化均可引起保水性的變化。郭兆斌等研究表明由于pH值的下降導(dǎo)致肌原纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)收縮，同時蒸煮條件下肌肉蛋白質(zhì)的熱變性使得肌原纖維緊縮，儲存水分空間變小，部分不易流動水變?yōu)樽杂伤魇?。此外，pH值降低會導(dǎo)致維持細(xì)胞骨架的連接蛋白變性，致使離心損失升高，且當(dāng)pH值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)靜電荷為零，對水的吸引能力減弱，也會造成水分流失。

蒸煮損失及離心損失均可反映灘羊肉保水性的變化情況，本研究中蒸煮損失率與MYL1表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，與肌肉pH值及ACTA1表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與ACTN3表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)；離心損失率與MYL2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與ACTN3表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)。肌動蛋白與肌球蛋白均為骨骼肌中主要的肌原纖維蛋白，其中肌球蛋白占骨骼肌總蛋白的1/3以上，構(gòu)成肌肉結(jié)構(gòu)中的粗絲，肌動蛋白構(gòu)成細(xì)絲，二者在肌肉收縮中起著關(guān)鍵作用，產(chǎn)生收縮力。ACTN3作為骨骼肌Z線的構(gòu)成部分，負(fù)責(zé)形成肌動蛋白-肌動蛋白交聯(lián)，與快型肌纖維功能有關(guān)，而快型肌纖維功能又是引起肌肉劇烈收縮的原因，肌肉收縮會引起細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)儲存水分的空間減小，且會導(dǎo)致不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，由此引起水分流失的增加。因此，ACTA1、ACTN3、MYL2對灘羊肉的保水性有顯著影響。由于ACTN3與蒸煮損失率、離心損失率均具有很高的相關(guān)性，推測其可作為灘羊肉保水性的指示蛋白。左惠心采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究宰后牦牛肉保水性機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)作為差異蛋白的一類，對牦牛肉保水性有重要影響，本研究結(jié)果與其一致。

pH值對ACTB、ACTA1、MYL1、TNNC2、TNNT3、ACTN2、TPM2、TNNI2均有顯著影響，這些蛋白質(zhì)分別為肌動蛋白（ACTB、ACTA1、ACTN2）、肌球蛋白輕鏈（MYL1）、肌鈣蛋白（TNNC2、TNNT3、TNNI2）、原肌球蛋白（TPM2），是肌肉結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成蛋白質(zhì)。其中，原肌球蛋白是一種高度保守的肌動蛋白結(jié)合蛋白，對肌動蛋白絲的穩(wěn)定和許多肌動蛋白功能的協(xié)同調(diào)節(jié)至關(guān)重要；肌鈣蛋白復(fù)合物由3 種調(diào)節(jié)蛋白組成，分別是肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T，可調(diào)節(jié)骨骼肌和心肌的肌肉收縮，TNNT3是一種僅在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)的快速骨骼肌肌鈣蛋白；ACTB參與了細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的形成；ACTA1對交叉連接的肌動蛋白絲起作用，并將其穩(wěn)定在相鄰細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接等結(jié)構(gòu)上，在胞質(zhì)分裂、細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。pH值對這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有重要影響可能是由于pH值變化直接影響了結(jié)構(gòu)蛋白水解酶的活性。pH值對這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的重要影響意味著屠宰后pH值變化顯著影響肌肉保水性等品質(zhì)指標(biāo)。肖雄等研究表明，在屠宰初期，由于氧氣供應(yīng)中斷，機(jī)體細(xì)胞很快處于無氧環(huán)境，葡萄糖及糖原的有氧分解變?yōu)闊o氧酵解，產(chǎn)生乳酸，肌肉pH值下降，從而使蛋白質(zhì)分子的多肽鏈變緊密、分子間距縮小，肌肉中的部分水分子被擠出，因而保水性下降；且當(dāng)pH值下降至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)（尤其是肌球蛋白）所攜帶的凈電荷為零，其正負(fù)電荷數(shù)量基本相等，蛋白質(zhì)中的陽性和陰性基團(tuán)互相吸引，對水的吸引能力減弱，導(dǎo)致水分流失。此外，肌球蛋白頭部在低pH值下的部分變性也被認(rèn)為是肌原纖維晶格間距收縮的主要原因，收縮可能會壓迫肌細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的水分流出，最終也會影響灘羊肉的保水性。

3 結(jié) 論

宰后0～8 d內(nèi)，隨著貯藏時間延長，灘羊肉pH值先降低后有所回升，蒸煮損失率與離心損失率持續(xù)升高。利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鑒定發(fā)現(xiàn)TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN3、ACTB、ACTA1、ACTN2共10 個核心差異豐度蛋白質(zhì)。其中TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN2在0～4 d表達(dá)上調(diào)，4～8 d下調(diào)；ACTB、ACTA1在0～4 d表達(dá)下調(diào)，4～8 d 上調(diào)；ACTN3 在0～8 d持續(xù)上調(diào)。這些蛋白質(zhì)位于肌節(jié)、肌纖維、細(xì)胞膜，通過與細(xì)胞骨架蛋白或離子結(jié)合，參與肌肉收縮以及ATP酶活性的調(diào)節(jié)，引起肌肉收縮及肌肉結(jié)構(gòu)變化，最終影響灘羊肉的保水性。肌肉pH值對肌肉結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成蛋白質(zhì)ACTB、ACTA1、MYL1、TNNC2、TNNT3、ACTN2、TPM2、TNNI2有顯著影響，pH值及MYL1、ACTA1、ACTN3對蒸煮損失有重要影響，MYL2與ACTN3對離心損失有重要影響。