預(yù)處理對南美白對蝦剝殼效果和肌原纖維蛋白的影響

楊肖杰，黃 卉，李來好，楊賢慶，岑劍偉，潘 創(chuàng)，魏 涯，趙永強，郝淑賢，林 織

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.廣東順欣海洋漁業(yè)集團有限公司，廣東 陽江 529800）

南美白對蝦肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高，富含蛋白質(zhì)和多種對人體有益的氨基酸，且脂肪含量低，深受消費者喜愛。去殼是蝦仁生產(chǎn)的關(guān)鍵工序，但外殼通過附著纖維（表皮內(nèi)纖維）緊密地附著在表皮上，表皮內(nèi)纖維通過微管相互交叉從而牢固地連接在肌肉上，這種殼-肉連接結(jié)構(gòu)使鮮蝦殼難以剝離，因此剝殼前需進行預(yù)處理使殼-肉間的緊密連接松動以輔助后續(xù)剝殼。實現(xiàn)高效率去殼的同時保證蝦仁的品質(zhì)是當(dāng)前對蝦機械化生產(chǎn)的一個重要研究方向。

外源蛋白酶可以水解相應(yīng)的蛋白質(zhì)，近年來外源蛋白酶已被應(yīng)用于輔助快速脫殼去皮的加工領(lǐng)域。Dang等報道了使用Endocut-03L和Exocut-A0復(fù)合蛋白酶預(yù)處理可促進北極蝦（）凍蝦殼-肉連接松動、提高去殼率、減少工作量，且經(jīng)酶促處理后蝦仁在質(zhì)構(gòu)和色澤上優(yōu)于工業(yè)鹽水法處理蝦仁。楊肖杰等以南美白對蝦為原料，優(yōu)化了酶輔助剝殼的工藝參數(shù)，優(yōu)化條件下處理時間短且剝殼效果良好，剝殼后蝦肉pH值和肌纖維組織均無顯著變化，且色澤與鮮蝦較為接近。Dang等用蛋白質(zhì)組學(xué)和掃描電子顯微鏡進行分析和觀察，解釋了蛋白酶誘導(dǎo)蝦脫殼的機制，即酶處理引起蝦殼、表皮、殼-肉連接部位的大分子蛋白被水解，從而松動殼-肉連接。低溫處理是目前常用的剝殼預(yù)處理方法，包括速凍之后進行解凍、冰鹽水處理后再剝殼，但速凍之后解凍易造成蝦肉汁液流失率增加，影響蝦肉的感官品質(zhì)；研究表明，一定質(zhì)量濃度的冰鹽處理能明顯降低剝殼難度的同時保持產(chǎn)品品質(zhì)。但目前鮮有系統(tǒng)比較冷凍、冰鹽、酶處理對南美白對蝦剝殼效果及脫殼后蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)變化影響的報道。本實驗以南美白對蝦為研究對象，比較酶預(yù)處理、冷凍和冰鹽預(yù)處理南美白對蝦的剝殼用功、完全剝殼率，并探究不同預(yù)處理對剝殼后蝦仁質(zhì)構(gòu)、肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度、表面疏水性、Ca-ATPase活性、總巰基和活性巰基含量以及羰基含量的影響，同時通過傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜等分析不同預(yù)處理南美白對蝦蛋白結(jié)構(gòu)變化，為預(yù)處理輔助剝殼在對蝦機械剝殼的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活南美白對蝦長度約11～13 cm、40～45 只/kg，于2020年8月購自廣州當(dāng)?shù)爻校óa(chǎn)自廣東湛江），20 min內(nèi)送至實驗室、清洗，置于碎冰中冷休克20 min。

中性蛋白酶（≥200 U/mg、4 ℃保存） 中國合肥博美生物技術(shù)有限公司；BeyoColor彩色預(yù)染蛋白（6.5～270.0 kDa）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×）、考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒（常規(guī)法） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Nu PAGE12% Bis-Tris預(yù)制膠、Nu PAGEMOPS SDS電泳緩沖液（20×） 賽默飛科技（上海）有限公司；所使用的蛋白理化性質(zhì)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。NaCl為食品級，其他化學(xué)藥品和試劑均為分析級。

1.2 儀器與設(shè)備

T25組織勻漿機 德國IKA公司；3K30臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；QTS-25質(zhì)構(gòu)儀 英國CNS FARNEL有限公司；Alpha1-4冷凍干燥機 德國Christ公司；Sunrise-basic吸光度酶標(biāo)儀 德國TECAN公司；Chirscan圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理學(xué)有限公司；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國VARIAN公司；Mini Gel Tank PAGE電泳系統(tǒng) 美國賽默飛科技公司。

1.3 方法

1.3.1 剝殼預(yù)處理

原料蝦隨機分為9 份，每份12 只，3 份一組，進行3 種預(yù)處理實驗。冷凍處理（-21 ℃、24 h）和冰鹽處理（4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl、冰-水質(zhì)量比7∶3浸泡處理8 h）參考Yang Xiaojie等的方法，酶處理（（5±2）℃、0.7 mg/mL中性蛋白酶處理3.5 h）同楊肖杰等的方法。

1.3.2 可剝性分析

不同預(yù)處理后的蝦體可剝性以剝殼效果（剝殼用功和完全剝殼率）進行表征。仔細(xì)地切下對蝦前三腹節(jié)蝦身，稱質(zhì)量并記錄，參考Yang Xiaojie等的方法利用質(zhì)構(gòu)儀分析剝殼過程。剝殼后，蝦分為“完全剝殼”和“未完全剝殼”兩類，統(tǒng)計完全去殼蝦的剝殼用功/（mJ/g）和完全剝殼率/%。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)崔燕等的方法提取肌原纖維蛋白并略作修改。取前三腹節(jié)蝦肉3 g，剪碎加入10 倍體積預(yù)冷的Tris-馬來酸緩沖溶液（0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），充分勻漿60 s，將勻漿液10 000 r/min離心15 min，棄上清液。沉淀中加入10 倍體積預(yù)冷的Tris-馬來酸緩沖溶液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），勻漿60 s后放置1 h，10 000 r/min離心15 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液，收集備用。整個提取過程均在4 ℃下進行，利用Bradford法測定肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.4 肌原纖維蛋白理化性質(zhì)測定

參考Chelh和Lv Mingchun等的方法測定肌原纖維蛋白的表面疏水性。取1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液加入200 μL溴酚藍(lán)溶液（1 mg/mL），以肌原纖維蛋白溶解液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0）加入200 μL溴酚藍(lán)溶液（1 mg/mL）作空白。樣品混合均勻后在25 ℃條件下振蕩反應(yīng)15 min，10 000 r/min離心15 min，取0.5 mL上清液，用4.5 mL蒸餾水稀釋，利用酶標(biāo)儀測定其在595 nm波長處的吸光度。按下式計算溴酚藍(lán)結(jié)合量。根據(jù)每毫克肌原纖維蛋白結(jié)合的溴酚藍(lán)質(zhì)量確定其表面疏水性，單位μg/mg。

式中：為空白組吸光度；為樣品吸光度。

肌原纖維蛋白的Ca-ATPase活力、總巰基含量和活性巰基含量、羰基含量分別使用Ca-ATPase活力測定試劑盒（A070-4）、總巰基含量測定試劑盒（A063-2-1）、分型巰基含量測定試劑盒（A063-4-1）和羰基含量測定試劑盒（A087-1-2）測定。

1.3.5 圓二色光譜分析

參考李可等的方法并進行修改，使用圓二色光譜儀在室溫下對遠(yuǎn)紫外線區(qū)域（200～250 nm）進行圓二色光譜分析。雙蒸水調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度至0.05 mg/mL，注入狹縫寬度0.5 mm石英比色皿中進行分析。響應(yīng)時間0.5 s、掃描范圍190～260 nm、縫寬1.0 nm、掃描步階1 nm。通過自帶的CDNN軟件計算-螺旋相對含量的變化。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

肌原纖維蛋白溶液置于-80 ℃冷凍4 h后，真空冷凍干燥72 h，得到肌原纖維蛋白凍干粉末。參考劉芳芳等的方法進行傅里葉變換紅外光譜分析，使用Peakfit v 4.12軟件進行曲線擬合并分析數(shù)據(jù)。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光強度的測定參照Shi Jing等的方法并稍作修改，用Tris-馬來酸緩沖溶液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0）將肌原纖維蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用熒光分光光度計測定其內(nèi)源熒光光譜。測定條件：室溫下，激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速率1 000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm。以Tris-馬來酸緩沖溶液作空白。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

按照Pan Chuang等的方法進行SDS-PAGE分析。將30 μL的肌原纖維蛋白（1 mg/mL）溶液與10 μL的上樣緩沖液（5×）混合，沸水加熱5 min，上樣量10 μL。電泳結(jié)束后取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒進行染色和脫色。條帶的分子質(zhì)量通過與蛋白分子質(zhì)量Marker（6.5～270.0 kDa）進行比較來確定。

1.3.9 質(zhì)構(gòu)特性分析

參考楊肖杰等的方法對南美白對蝦蝦仁進行質(zhì)構(gòu)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗重復(fù)3 次，使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析分析（以＜0.05表示差異顯著），采用Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理對蝦體剝殼效果的影響

新鮮的南美白對蝦殼肉緊密相連，難以剝離，預(yù)處理有助于輔助南美白對蝦去殼，不同方式處理后南美白對蝦的剝殼效果如表1所示，完全剝殼率體現(xiàn)了蝦仁剝殼后的完整程度，成功剝殼的蝦仁應(yīng)保持蝦肉完整、蝦尾不斷裂，冷凍、冰鹽及酶預(yù)處理完全剝殼率分別是97.22%、88.89%和94.45%，3 個處理組間無顯著差異（＞0.05）。剝殼用功反映了殼-肉連接之間的松動程度，剝殼用功越小，蝦越容易剝離，不同處理后剝殼用功差異顯著（＜0.05），-21 ℃冷凍24 h后對蝦剝殼用功為7.99 mJ/g，冰鹽浸泡8 h后對蝦剝殼用功為9.50 mJ/g，酶低溫處理3.5 h后為5.96 mJ/g。綜合考慮，酶處理3.5 h對蝦殼的松動效果顯著，有助于剝殼。

表1 不同預(yù)處理對于蝦體剝殼效果的影響Table 1 Effect of different pretreatments on shrimp peeling

2.2 不同預(yù)處理對蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響

肌原纖維蛋白是肌肉組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占蛋白質(zhì)總量的40%～60%，與肌肉的持水性、嫩度等密切相關(guān)。不同預(yù)處理對肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的影響如表2所示，與鮮蝦相比，3 種輔助去殼對蝦仁肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度無顯著影響（＞0.05），可能是處理時間短，且蝦仁處于低溫狀態(tài)所致。鮮蝦中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度并不是最高的，可能是鮮蝦剛死后蝦肉尚處于僵直前期，其肌肉內(nèi)ATP的作用使得肌動蛋白和肌球蛋白分子結(jié)合，相互聚合形成分子質(zhì)量較大的分子，離心時沉淀在底部，所以提取的肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度偏低，造成新鮮蝦肌原纖維蛋白的含量略低于處理組。

表2 不同預(yù)處理對蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of pretreatments on the physicochemical properties of shrimp myofibrillar proteins

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基分布數(shù)量的一個重要指標(biāo)，可以用它來反映蛋白質(zhì)的變性程度，表面疏水性越高說明蛋白變性程度越大。與鮮蝦相比，冷凍和冰鹽處理表面疏水性顯著增加（＜0.05），可能是冷凍-解凍引起肌原纖維蛋白構(gòu)象的輕微變性伸展，表現(xiàn)為蛋白羰基化、肽主鏈斷裂以及分子間二硫鍵形成，埋藏在蛋白空間構(gòu)象內(nèi)部的疏水性脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團暴露，從而引起表面疏水性的增加。酶處理組的表面疏水性略有上升，但與鮮蝦無顯著差異（＞0.05），主要是因為（5±2）℃的低溫短時處理緩解了蛋白質(zhì)的變性，且沒有涉及到凍融過程。

巰基包括暴露在蛋白質(zhì)表面的（活性巰基）和埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的。從表2中可以看出，新鮮樣品的總巰基和活性巰基含量顯著高于其他3 個處理組，研究表明肌原纖維蛋白中含有大量易受氧自由基影響的巰基基團，且易轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)和分子間二硫鍵，引起蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚合、交聯(lián)，導(dǎo)致巰基含量降低，蛋白的氧化程度與巰基含量成反比。在預(yù)處理過程中，冷凍或中性蛋白酶的酶解作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露并被氧化生成二硫鍵，從而引起巰基含量的下降。酶處理組的巰基含量顯著高于冷凍和冰鹽組，更接近于鮮蝦，說明其蛋白氧化程度較低。此外，解凍過程中會產(chǎn)生熱量并發(fā)生擠壓，這也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊并影響巰基的含量。

蛋白側(cè)鏈含—NH—或—NH的氨基酸非常容易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的攻擊而氧化為羰基或者羰基衍生物，所以羰基含量常被用來衡量蛋白氧化的程度，含量越高表明蛋白氧化程度越高。如表1所示，冷凍處理肌原纖維蛋白的羰基含量為3.95 nmol/mg，與鮮蝦相比略微增加（＞0.05），而酶和冰鹽處理后肌原纖維蛋白羰基含量分別為5.58、6.18 nmol/mg，與鮮蝦相比分別增加了50.00%和66.13%，主要是因為氯化鈉的存在使蛋白質(zhì)表面賴氨酸殘基的-NH更易受到攻擊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基含量的上升，趙亞南等研究表明，在氯化鈉添加量為0%～4.5%時，羰基含量隨氯化鈉添加量的增加而顯著增加。

Ca-ATPase活力是表征肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)完整性的一個良好指標(biāo)，其變化能較好地反映肌原纖維蛋白的變性程度。肌球蛋白變性，特別是頭部區(qū)域變性，會引起Ca-ATPase活力下降，其原因可能是肌球蛋白頭部構(gòu)象改變及蛋白質(zhì)聚集。從表2中可以看出，Ca-ATPase活力的變化并不一定造成肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的顯著變化。與鮮蝦相比，處理組對蝦肌原纖維蛋白的Ca-ATPase活力都顯著下降（＜0.05），冷凍處理組下降至0.49 U/mg，下降了33.78%，冷凍-解凍過程中冰結(jié)晶的形成及由此引起的體系離子強度的增大都會造成肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)變化；此外，巰基的氧化作用也造成了Ca-ATPase活力的下降，兩者共同作用使冷凍處理組的Ca-ATPase活力最低。酶處理組Ca-ATPase活力下降至0.58 U/g，下降21.62%，主要是外源蛋白酶的酶解作用引起的，與儀淑敏等的研究結(jié)果相似。冰鹽處理組Ca-ATPase活力下降至0.66 U/g，下降了10.81%，這與秦求思等研究鷹爪蝦在冰溫貯藏下Ca-ATPase活力下降的結(jié)論一致。綜上，3 種預(yù)處理輔助剝殼對于Ca-ATPase活性影響程度由大到小依次是冷凍處理＞酶處理＞冰鹽處理。

2.3 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)在紅外區(qū)域有若干特征吸收帶，圖1為鮮蝦和各處理組肌原纖維蛋白的紅外光譜，酰胺II帶（1 500～1 600 cm）、酰胺I帶（1 600～1 700 cm）、2 929 cm處的特征吸收峰和3 296 cm處的單強峰分別是由C—N伸縮和N—H彎曲振動、羰基C＝O和雙鍵伸縮振動、C—H伸縮振動和O—H伸縮振動引起。其中，位于1 600～1 700 cm的酰胺I帶吸收峰強度最強，可反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。對比新鮮南美白對蝦肌原纖維蛋白紅外譜圖，經(jīng)不同預(yù)處理蝦肉蛋白各組分的峰位沒有明顯變化，但其特征峰強度有不同程度的減弱，表明預(yù)處理導(dǎo)致肌肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的破壞以及二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化和改變。

圖1 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白紅外光譜Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

通過對1 600～1 700 cm處的酰胺I帶進行二階導(dǎo)數(shù)處理和高斯曲線擬合，可放大一些細(xì)小峰變化，得到各子峰，由圖2可知，處理組的峰強度發(fā)生不同程度的減弱。圖2中各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系為：1 615～1 637 cm和1 682～1 700 cm對應(yīng)-折疊；1 646～1 664 cm對應(yīng)-螺旋；1 637～1 645 cm對應(yīng)無規(guī)卷曲；1 664～1 681 cm對應(yīng)-轉(zhuǎn)角。根據(jù)擬合后的峰面積計算出各二級結(jié)構(gòu)的相對含量，如表3所示，-螺旋和-折疊是新鮮蝦肉中主要的二級結(jié)構(gòu)，-螺旋通過肽鏈內(nèi)部的氫鍵穩(wěn)定，-折疊依賴于肽鏈之間的氫鍵，維持著肌原纖維蛋白的有序和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。與新鮮蝦肉肌原纖維蛋白相比，冷凍處理、酶處理和冰鹽處理后肌原纖維蛋白-螺旋的相對含量分別下降了5.93%、6.01%和3.85%，并無顯著變化，-螺旋相對含量的降低可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性的增加，這與上述預(yù)處理引起表面疏水性的增加結(jié)果相印證，但變化趨勢并不完全吻合。冷凍處理后肌原纖維蛋白-折疊相對含量減少2.89%，無規(guī)卷曲相對含量增加2.44%，變化不顯著（＞0.05）；酶和冰鹽處理后-折疊相對含量分別減少13.43%和14.26%，無規(guī)卷曲相對含量分別增加93.58%和87.55%，變化顯著（＜0.05），-轉(zhuǎn)角相對含量無顯著變化。說明酶處理和冰鹽處理引起-折疊肽鏈之間的氫鍵斷裂，向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，是一種有序到無序的變化。

圖2 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）高斯擬合紅外光譜Fig. 2 Gaussian fitting infrared spectra of amide I band (1 600-1 700 cm-1) of shrimp muscle myofibrillar proteins subjected to different pretreatments

表3 不同預(yù)處理對剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of different pretreatments on secondary structures of myofibrillar proteins in peeled shrimps

2.4 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白圓二色光譜分析結(jié)果

圓二色光譜遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～240 nm）的圓二色性主要由肽鍵的電子躍遷引起，能夠反映肽鏈主鏈的構(gòu)象，常用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析。肌原纖維蛋白的圓二色光譜通常在208 nm和222 nm波長處出現(xiàn)兩個負(fù)峰，這兩個峰即代表-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。圖3所示為典型的以-螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)，與鮮蝦相比，3 種預(yù)處理剝殼后肌原纖維蛋白的圓二色光譜特征峰強度略微發(fā)生改變，但肩峰的位置和形狀都沒有發(fā)生明顯變化，-螺旋相對含量發(fā)生變化，這與紅外光譜的結(jié)果不一致，可能是由于羰基化影響了蛋白的結(jié)構(gòu)特性，有研究表明羰基含量與-螺旋含量呈正相關(guān)，本研究中，處理后的肌原纖維蛋白氧化產(chǎn)生的羰基可能促進了-螺旋相對含量的增加。圓二色光譜對于-螺旋構(gòu)象的分析效果較好，而傅里葉變換紅外光譜分析-折疊、-轉(zhuǎn)角等其他結(jié)構(gòu)的結(jié)果更可靠，但具體原因需詳細(xì)探究。

圖3 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白圓二色光譜Fig. 3 CD spectra of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

2.5 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜分析結(jié)果

內(nèi)源性色氨酸熒光光譜能夠反映蛋白質(zhì)中氨基酸殘基及其微環(huán)境的變化，進而常被用于監(jiān)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境中，此時被激發(fā)的色氨酸具有相對較高的熒光強度。如圖4所示，在295 nm波長處激發(fā)的新鮮蝦肉肌原纖維蛋白在發(fā)射波長335 nm處具有最高的熒光強度，預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強度出現(xiàn)不同程度的降低，酶處理組降低4.78%，冷凍處理和冰鹽處理組分別降低10.18%和9.52%。蝦肉在處理過程中冰晶的生成、外源蛋白酶和內(nèi)源蛋白酶引起的蛋白質(zhì)變性和氧化作用使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開，色氨酸側(cè)鏈吲哚等熒光物質(zhì)的氧化和暴露引起內(nèi)源熒光強度降低，且最大熒光峰位置發(fā)生輕微的紅移，說明經(jīng)過處理后部分埋藏在肌原纖維蛋白內(nèi)部的氨基酸殘基處于極性程度更高的環(huán)境中，蛋白內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面引起蛋白的表面疏水性增加。本實驗中，3 種預(yù)處理都會引起肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強度減小，但酶處理組的變化較小，與上述肌原纖維蛋白的表面疏水性分析結(jié)果相印證。

圖4 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白的熒光光譜Fig. 4 Fluorescence spectra of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

2.6 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

從圖5可以看到清晰的肌球蛋白重鏈和輕鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白以及尚不明確的結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)蛋白條帶。蛋白質(zhì)分子發(fā)生降解主要表現(xiàn)為分子質(zhì)量較高處的條帶出現(xiàn)模糊、弱化和擴展，較低分子質(zhì)量區(qū)域則出現(xiàn)新的條帶或條帶顏色加深。與新鮮蝦肉相比，冷凍處理組和冰鹽處理組的泳道條帶無明顯變化，可能是由于處理時間較短且有溫度控制。酶處理組肌球蛋白重鏈（＞200 kDa）條帶、肌動蛋白（48 kDa）條帶顏色變淺，即肌球蛋白重鏈和肌動蛋白發(fā)生了輕微降解，95～130 kDa之間的條帶和45 kDa條帶變粗且顏色加深，可能是由于外源蛋白酶將大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)降解形成了較小分子質(zhì)量的片段。結(jié)合電泳分析結(jié)果可知，短時冷凍和冰鹽處理雖然在一定程度上影響了蛋白的某些理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，但沒有引起蛋白質(zhì)電泳圖譜中主要蛋白分子條帶變化；酶輔助剝殼會引起肌原纖維蛋白中大分子蛋白的輕微降解。

圖5 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE patterns of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

2.7 不同預(yù)處理對蝦仁質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表4所示，酶處理后的蝦仁硬度大于鮮蝦、冷凍和冰鹽處理蝦仁，可能是鮮蝦死后30 min正處于僵直前期，此時肌肉柔軟有彈性；而低溫解凍造成肌肉細(xì)胞的汁液流失，肉質(zhì)變軟。酶處理后彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和膠著性都顯著降低，其彈性和冰鹽處理組無顯著差異，內(nèi)聚性、膠著性與冷凍處理組無顯著差異，咀嚼性和鮮蝦無顯著差異。電泳分析結(jié)果顯示酶處理輔助剝殼后蝦肉肌動蛋白雖發(fā)生了輕微降解，但總體上蝦仁的質(zhì)構(gòu)特性略優(yōu)于冷凍、冰鹽處理組。本課題組之前的研究結(jié)果也顯示，與鮮蝦相比，酶輔助剝殼后蝦仁pH值無顯著變化，蝦仁能保持原有色澤，蝦肉肌纖維較為完整，排列較為緊密，沒有出現(xiàn)肌纖維束和肌內(nèi)膜破裂的情況。Dang等也報道了與工業(yè)鹽水前處理相比，酶處理使蝦的質(zhì)地和顏色方面品質(zhì)得到提升。

表4 不同預(yù)處理對蝦仁質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 4 Effects of pretreatments on the texture of peeled shrimps

3 結(jié) 論

本實驗探究了3 種不同預(yù)處理輔助剝殼對蝦體剝殼效果及蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。與冷凍和冰鹽處理相比，酶處理所需的剝殼用功最小且完全剝殼率較高。與鮮蝦相比，不同預(yù)處理組的肌原纖維蛋白均發(fā)生了不同程度的氧化，酶處理組表面疏水性增加但不顯著（＞0.05），總巰基含量、活性巰基含量和Ca-ATPase活力顯著下降（＜0.05），但下降程度總體小于冷凍和冰鹽處理組，羰基含量與冰鹽處理組無顯著差異。傅里葉變換紅外光譜結(jié)果顯示，3 個處理組肌原纖維蛋白的-螺旋、-轉(zhuǎn)角相對含量都無顯著變化，酶和冰鹽處理組出現(xiàn)了-折疊向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化的趨勢，但圓二色光譜分析結(jié)果顯示酶和冰鹽處理組肌原纖維蛋白的-螺旋相對含量增加；通過色氨酸熒光強度分析發(fā)現(xiàn)，酶處理組熒光強度明顯降低，色氨酸所處的微環(huán)境發(fā)生改變，但降低程度小于其他兩個處理組。SDS-PAGE圖譜顯示酶處理引起了部分大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的降解，但蝦仁的質(zhì)構(gòu)特性總體略優(yōu)于冷凍/冰鹽處理，冷凍和冰鹽處理引起了蛋白的某些理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化，而對蛋白電泳圖譜無明顯影響。綜上所述，酶處理過程省時（3.5 h）、所需剝殼用功較小且完全剝殼率達94.45%，同時對蛋白的理化特性和構(gòu)象的影響小于冷凍和冰鹽處理，可作為一種新型的預(yù)處理方法輔助對蝦去殼。但目前該方法仍處于探索階段，其對蝦仁風(fēng)味和貯存期品質(zhì)的影響有待進一步研究。