• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳酸菌產(chǎn)苯乳酸對指狀青霉的抑菌活性及作用機(jī)理

    2022-09-01 02:32:38郭宇逍鄧麗莉曾凱芳
    食品科學(xué) 2022年15期
    關(guān)鍵詞:霉病細(xì)胞膜孢子

    郭宇逍,洪 陽,鄧麗莉,2,曾凱芳,2,*

    (1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心,重慶 400715)

    柑橘是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值。柑橘果實在采摘、包裝、貯存和運輸?shù)恼麄€過程中都可能會受微生物侵染而發(fā)生腐爛。其中,由指狀青霉()引起的綠霉病是柑橘采后主要病害之一,在干旱地區(qū)和亞熱帶氣候區(qū)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,約占柑橘采后損失總量的90%。目前已有的防控方法中,多菌靈和咪唑類等化學(xué)殺菌劑使用最廣泛也最有效,但化學(xué)殺菌劑會引起環(huán)境污染、損害人體健康、使病原菌產(chǎn)生抗性等一系類問題,因此,亟待尋求一種綠色安全無污染的處理方式來減少或替代化學(xué)殺菌劑的使用。

    乳酸菌在食品體系中作為生物保護(hù)菌所具有的抗真菌特性能夠有效防治草莓、蘋果、圣女果等果蔬采后真菌病害,其重要機(jī)制之一是能產(chǎn)生有機(jī)酸,主要包括乳酸、乙酸、苯乳酸(phenyllactic acid,PLA),此外還包括羥基苯乳酸和吲哚-3-乳酸等。有機(jī)酸分子在較低的pH值環(huán)境下具有抑菌活性,且具有親脂性,可穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)生解離并釋放出質(zhì)子和陰離子,從而破壞膜的質(zhì)子動力,抑制細(xì)胞的正常代謝活動,導(dǎo)致ATP產(chǎn)量下降。有機(jī)酸對病原菌的抑制作用還可能包括對酶活性的抑制,以及有機(jī)酸的非解離組分對病原菌細(xì)胞膜的破壞。

    PLA作為乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸之一,可通過乳酸菌高效發(fā)酵的方式低成本大量獲得,且具有廣譜抑菌性,不僅能抑制腸道沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌生長,對青霉、黃曲霉、黑曲霉等真菌同樣具有良好的抑制效果。前人研究表明,PLA主要作用于細(xì)胞膜。Liu Fang等分析發(fā)現(xiàn),PLA處理改變了細(xì)胞形態(tài),且破壞了浮游細(xì)胞細(xì)胞膜完整性,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不同程度的ATP泄漏并嚴(yán)重受損。類似的,Ning Yawei等通過流式細(xì)胞儀和透射電子顯微鏡分析,證明PLA處理能破壞蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜的完整性和形態(tài)。但也有研究認(rèn)為,PLA還能夠作用于細(xì)胞壁、DNA。PLA對不同病原菌的抑制效果及抑制機(jī)理不同,且目前鮮見深入研究其抗病機(jī)制的報道。

    因此,本實驗選擇本課題組前期在泡菜中分離篩選得到的兩株乳酸菌CKXP13和CWXP24作為實驗菌株,這兩株菌對柑橘綠霉病都有良好的控制效果。但有關(guān)乳酸菌CKXP13和CWXP24所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)研究尚少,也鮮有研究其抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量及抑菌物質(zhì)作用機(jī)理的相關(guān)報道。綜上所述,本實驗旨在探究乳酸菌CKXP13和CWXP24的產(chǎn)酸能力和PLA的產(chǎn)量,并通過研究PLA對離體指狀青霉孢子的影響初步揭示PLA的抑菌機(jī)理,同時驗證PLA對柑橘綠霉病的防治效果,以期為控制柑橘采后綠霉病和抑制柑橘采后病原菌提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    豐臍橙(L. Osbeck)摘自重慶市北碚區(qū)。挑選無機(jī)械傷、無病害、成熟度和大小基本一致的果實,預(yù)冷后放至4 ℃冷庫中備用。

    指狀青霉()為本實驗室保藏,于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)7 d,得到孢子懸浮液后用無菌蒸餾水調(diào)至所需濃度。CKXP13和CWXP24為本實驗室前期實驗分離保藏。色譜純PLA上海阿拉丁生化科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    PB-10酸度計 德國賽多利斯股份有限公司;JSM-6510LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;SYNERGYH1MG全自動酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司;LC-20A高效液相色譜 日本島津公司;DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海INESA公司。

    1.3 方法

    1.3.1活化、發(fā)酵及產(chǎn)酸能力的測定

    乳酸菌活化/乳酸菌懸浮液制備:從-40 ℃冰箱中取出已篩選鑒定的兩株乳酸菌CKXP13和CWXP24,按1%(以體系體積計,下同)的接種量加入20 mL MRS肉湯中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,活化2 次后待用。

    乳酸菌無菌發(fā)酵液制備:以1%的接種量接種乳酸菌培養(yǎng)液于MRS肉湯中,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。每株菌的培養(yǎng)液于4 ℃條件下5 000 r/min離心15 min,上清液用0.22 μm孔徑水系濾頭過濾除菌,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    產(chǎn)酸能力的測定參照Ma Jiahong等的方法并作一定的修改,同時測定生長曲線。取活化后的兩株乳酸菌培養(yǎng)液各1 mL加入至100 mL MRS肉湯中,37 ℃靜置培養(yǎng)72 h,每6 h測定pH值與OD各一次,重復(fù)3 次。

    1.3.2 高效液相色譜法測定無菌發(fā)酵液中PLA質(zhì)量濃度

    液相色譜條件:選用LC-20A高效液相色譜儀、液相色譜C柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),Prominence SPD-M20A二極管陣列檢測器。流動相A:體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸-水溶液,流動相B:體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸-甲醇溶液。流速1 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長210 nm、進(jìn)樣量10 μL。

    梯度洗脫程序:0~20 min由10% B線性變化至100% B,20~23 min保持100% B,23~25 min由100% B線性變化至10% B,25~40 min保持10% B。

    1.3.3孢子存活率的測定

    在無菌蒸餾水中加入PLA,使其終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 mg/mL,再加入不同濃度的孢子懸浮液,使其終濃度為1×10個/mL,25 ℃環(huán)境下靜置16 h,取50 μL混合液于PDA培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)2 d,記錄培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)。以無菌蒸餾水替代PLA作為對照,重復(fù)3 次。按式(1)計算孢子存活率。

    1.3.4菌落直徑的測定

    在PDA培養(yǎng)基中加入適量PLA,使其終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 mg/mL,再接種5 μL孢子懸浮液(1×10個/mL),25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)8 d,每天觀察并測量菌落直徑。以無菌蒸餾水替代PLA為對照,重復(fù)3 次。

    1.3.5菌絲表面形態(tài)的觀察

    菌絲表面形態(tài)的觀察參照Tao Nengguo等的方法并稍作調(diào)整,將孢子懸浮液(1×10個/mL)接種于PDB液體培養(yǎng)基中,25 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h,5 000 r/min離心15 min,無菌蒸餾水洗3 次,收集菌絲體,用不同質(zhì)量濃度的PLA溶液(2.5、5.0、10.0 mg/mL)處理48 h,以無菌蒸餾水代替PLA作為對照。處理結(jié)束后,收集菌絲體,置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液(含0.1 mol/L磷酸緩沖液,pH 6.8)中,存放于4 ℃冰箱中過夜固定。固定結(jié)束后除去固定液,用磷酸緩沖液(0.1 mol/L、pH 6.8)清洗3 次,再用乙醇梯度脫水,分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、95%乙醇溶液脫水處理一次,每次10 min;用無水乙醇脫水處理3 次,每次10 min。脫水處理之后,依次加入體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、95%叔丁醇溶液進(jìn)行置換處理一次,每次10 min;用無水叔丁醇置換處理兩次,每次10 min。最后,將樣品放入恒溫干燥箱65 ℃過夜干燥,挑取樣品組織塊粘到金屬臺上,進(jìn)行噴金、鍍膜后在掃描電子顯微鏡(放大倍數(shù)5 000 倍、80 kV)下觀察并拍照。

    1.3.6菌絲胞外電導(dǎo)率的測定

    菌絲胞外電導(dǎo)率的測定參照Wang Wenjun等的方法并稍作調(diào)整,將10 mL含有孢子懸浮液(1×10個/mL)的PDB培養(yǎng)基置于25 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后5 000 r/min離心15 min收集菌絲體,無菌蒸餾水洗3 次,重懸于無菌蒸餾水中。取適量PLA溶液加入菌絲懸浮液中,使懸浮液中PLA終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 mg/mL。在處理0、3、6、9、12、24、48 h時測定胞外電導(dǎo)率,每組處理重復(fù)3 次,以無菌蒸餾水替代PLA作為對照。

    1.3.7 柑橘果實綠霉病干預(yù)實驗

    柑橘果實綠霉病干預(yù)實驗參照Ma Jiahong等的方法并稍作調(diào)整,柑橘果實先用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min,用清水沖洗后于室溫下自然晾干。所有果實隨機(jī)分為3 組,打孔接種前用乙醇擦拭消毒。用無菌打孔器在果實赤道部位對稱打兩個孔(直徑3 mm、深3 mm),每個孔接種10 μL孢子懸浮液(1×10個/mL)。待果實吸收孢子懸浮液后,每個孔接種20 μL不同質(zhì)量濃度PLA溶液(10、20 mg/mL)并置于室溫條件下。無菌蒸餾水替代PLA作為對照,每組處理10 個果實,每個處理重復(fù)3 次。待處理液充分吸收后,將果實單果包裝,貯藏于25 ℃、相對濕度95%的環(huán)境中。每天統(tǒng)計果實發(fā)病情況,發(fā)病率和病斑直徑分別按式(2)和式(3)計算。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    運用Excel 2016軟件統(tǒng)計分析所有得到的數(shù)據(jù),應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件、Adobe Photoshop CS6軟件繪制圖表;運用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,利用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性分析,<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 L. plantarum產(chǎn)酸能力分析結(jié)果

    如圖1所示,隨著培養(yǎng)時間的延長,兩株乳酸菌數(shù)量均逐漸增加,有機(jī)酸產(chǎn)物不斷積累,導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值不斷降低,并在72 h培養(yǎng)結(jié)束時均穩(wěn)定在4左右。生長曲線結(jié)果表明,兩株在培養(yǎng)6 h后均進(jìn)入生長對數(shù)期,相應(yīng)地,培養(yǎng)基pH值急劇下降,CKXP13在培養(yǎng)36 h后達(dá)到穩(wěn)定期,CWXP24在培養(yǎng)42 h后達(dá)到穩(wěn)定期,菌株達(dá)到穩(wěn)定期后,pH值變化逐漸平緩,并最終趨于穩(wěn)定。兩株均具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力,且有機(jī)酸產(chǎn)量與兩株的生長趨勢一致。

    圖1 兩株乳酸菌發(fā)酵液pH值變化及生長曲線Fig. 1 pH change of cultured broth and growth curves of two strains of L. plantarum

    2.2 L. plantarum無菌發(fā)酵液中PLA質(zhì)量濃度

    如表1所示,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=25 720+37 660,=0.998 1,再計算出無菌發(fā)酵液中的PLA質(zhì)量濃度。結(jié)果表明,兩株的無菌發(fā)酵液中均有PLA產(chǎn)生,且CWXP24顯示出較高的PLA合成能力,產(chǎn)量可達(dá)91.9 mg/L,CKXP13的PLA合成能力相對較弱,為42.4 mg/L。

    表1 兩株L. plantarum無菌發(fā)酵液中PLA的產(chǎn)量Table 1 Concentration of PLA in cell-free culture supernatants of two strains of L. plantarum

    2.3 PLA對P. digitatum的體外抑菌機(jī)理

    2.3.1 PLA對孢子存活率的影響

    如圖2所示,PLA在2.5~10.0 mg/mL范圍內(nèi)均表現(xiàn)出對孢子較強(qiáng)的致死能力,且隨著質(zhì)量濃度的增大,對的致死能力也不斷增強(qiáng)。2.5 mg/mL及5.0 mg/mL PLA處理組的孢子存活率分別為對照組的43.6%和18.9%,當(dāng)PLA質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時,平板上已無孢子萌發(fā),孢子存活率幾乎降低至0。

    圖2 PLA對P. digitatum孢子存活率的影響Fig. 2 Effects of PLA on spore viability of P. digitatum in vitro

    2.3.2 PLA對菌絲生長的影響

    如圖3所示,在菌絲的整個生長過程中,不同質(zhì)量濃度PLA均表現(xiàn)出對菌落生長較強(qiáng)的抑制能力,且隨著質(zhì)量濃度的增大,其對菌落生長的抑制能力也不斷增強(qiáng)。當(dāng)PLA質(zhì)量濃度達(dá)到10.0 mg/mL時,菌絲生長完全被抑制。2.5 mg/mL及5.0 mg/mL處理組的菌落直徑在培養(yǎng)8 d后分別為對照組的66.2%和28.5%。

    圖3 PLA對P. digitatum菌絲生長的影響Fig. 3 Effect of PLA on mycelial growth of P. digitatum in vitro

    2.3.3 PLA對菌絲形態(tài)的影響

    如圖4A所示,對照組的菌絲分布均勻,生長正常,菌絲表面平整光滑。2.5 mg/mL PLA處理組菌絲結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,菌絲整體分布不均勻,表面變得粗糙,出現(xiàn)褶皺(圖4B)。高質(zhì)量濃度的PLA處理組形態(tài)變化更加明顯,菌絲整體分布更加不規(guī)則,并相互纏繞、扭曲,表面褶皺更加明顯,出現(xiàn)塌陷和樹瘤狀凸起的情況(圖4C、D)。由此推測PLA可對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞,從而使內(nèi)容物泄漏。

    圖4 不同質(zhì)量濃度PLA處理對P. digitatum菌絲形態(tài)的影響(×5 000)Fig. 4 Effect of PLA on mycelial morphology of P. digitatum (× 5 000)

    2.3.4 PLA對菌絲胞外電導(dǎo)率的影響

    如圖5所示,隨著處理時間的延長,所有組別的電導(dǎo)率均逐漸升高。10.0 mg/mL PLA處理3 h時,其電導(dǎo)率急劇上升,達(dá)到71.0 μS/cm,明顯高于對照組(27.0 μS/cm)和其他處理組。2.5 mg/mL PLA處理組在前6 h與對照組差異不明顯,5.0、10 mg/ mL PLA處理48 h時,其電導(dǎo)率分別達(dá)到74.3、154.0 μS/cm,均明顯高于對照組(57.3 μS/cm)。電導(dǎo)率分析結(jié)果進(jìn)一步證明PLA處理可破壞菌絲細(xì)胞膜的通透性,細(xì)胞內(nèi)容物向外釋放,導(dǎo)致胞外電導(dǎo)率升高。

    圖5 PLA對P. digitatum菌絲胞外電導(dǎo)率的影響Fig. 5 Extracellular conductivity of P. digitatum mycelia treated with PLA

    2.4 PLA對柑橘果實綠霉病的控制效果

    如圖6所示,10 mg/mL和20 mg/mL PLA處理均可有效控制對柑橘果實的侵染,接種后5 d內(nèi)能夠不同程度地抑制柑橘果實綠霉病的發(fā)生。接種后5 d,20 mg/mL PLA處理顯著抑制了柑橘果實病斑直徑增長,且兩處理組均有效控制了柑橘果實發(fā)病初期的發(fā)病率。相對于對照組,20 mg/mL PLA處理組接種后第3天病斑直徑與發(fā)病率分別顯著降低了90.4%與78.0%;接種后第5天病斑直徑顯著降低了33.3%。10 mg/mL PLA處理組接種后第3天病斑直徑與發(fā)病率分別顯著降低了57.8%與49.9%;接種后第5天病斑直徑降低了15.2%。

    圖6 PLA對柑橘采后綠霉病病斑直徑和發(fā)病率的影響Fig. 6 Effect of PLA on lesion diameter and disease incidence of citrus fruit infected by P. digitatum

    3 討 論

    PLA作為具有抑菌活性的天然物質(zhì),可利用乳酸菌以高效發(fā)酵的方式進(jìn)行低成本的自然生產(chǎn),在果蔬采后貯藏領(lǐng)域顯示出極大的應(yīng)用潛力。本研究證明了CKXP13和CWXP24均能產(chǎn)PLA,且PLA能有效抑制指狀青霉生長,控制柑橘果實綠霉病。

    PLA主要由化學(xué)合成法和生物合成法兩種方法制備。相比于化學(xué)合成法,生物合成法成本低、操作簡單、條件溫和、對環(huán)境友好,因而受到廣泛關(guān)注。其中乳酸菌中已有多個菌屬被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)PLA,但大多乳酸菌的PLA合成量較低。本實驗中兩株均能分泌產(chǎn)生PLA,其中CWXP24在沒有任何優(yōu)化培養(yǎng)的條件下產(chǎn)量高達(dá)91.9 mg/L,但CKXP13產(chǎn)量較低,僅為42.4 mg/L,以往研究也表明,同一菌種不同菌株間的PLA產(chǎn)量可能存在顯著差異。

    本實驗發(fā)現(xiàn)PLA質(zhì)量濃度對孢子的致死效果和對菌絲生長的抑制效果呈正相關(guān),類似地,Guimar?es等發(fā)現(xiàn),PLA質(zhì)量濃度在0.1~8.0 mg/mL范圍內(nèi),的菌落直徑隨PLA質(zhì)量濃度升高而減小,當(dāng)PLA質(zhì)量濃度升至8 mg/mL時,菌落直徑減小為對照的50%。本實驗還對PLA可能的抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步研究,證明PLA處理對菌絲表面結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重破壞,使其發(fā)生明顯改變,這一結(jié)果與前人研究PLA處理對李斯特菌的影響所得結(jié)論相似,未使用PLA處理的李斯特菌細(xì)胞分布均勻、表面平滑,0.625 mg/mL的PLA處理后細(xì)胞外表面呈不規(guī)則褶皺,PLA質(zhì)量濃度增至1.25 mg/mL時細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞或局部破裂,部分胞內(nèi)物質(zhì)從細(xì)胞膜滲出,形成聚集和黏附,當(dāng)PLA處理質(zhì)量濃度持續(xù)升高至2.5 mg/mL,細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重,大部分細(xì)胞表面坍塌甚至破碎成細(xì)胞碎片,進(jìn)一步說明菌絲的這些變化可能是由于細(xì)胞通透性的增加,進(jìn)而導(dǎo)致小分子物質(zhì)和離子的泄漏、細(xì)胞代謝下降,最終抑制病原菌的生長。本實驗也發(fā)現(xiàn)PLA處理質(zhì)量濃度越高,菌絲的胞外電導(dǎo)率增加幅度越明顯,證明PLA能夠增加菌絲細(xì)胞膜的通透性,使細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏,這可能是PLA抑菌機(jī)理的重要組成部分。細(xì)胞膜作為病原菌細(xì)胞能量運輸及物質(zhì)傳遞的屏障,既能夠保證細(xì)胞本身代謝穩(wěn)定,又能起到調(diào)控物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)出與交換的作用。PLA本身為兩親性小分子,且?guī)в姓姾?,PLA的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了其更容易吸附在細(xì)胞膜表面,與細(xì)胞膜發(fā)生作用,所以細(xì)胞膜一般作為PLA與病原菌作用的第一個靶點。但袁景環(huán)等發(fā)現(xiàn),PLA處理的金黃色葡萄球菌和熒光假單胞菌培養(yǎng)液OD值和菌落總數(shù)均下降,說明PLA除了具有殺菌作用,還具有溶菌作用,通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察還發(fā)現(xiàn)PLA處理后的菌體嚴(yán)重變形、固縮或破裂,細(xì)胞內(nèi)容物外泄,推測PLA對這兩種細(xì)菌的作用位點之一為細(xì)胞壁。這與Dieuleveux等報道的PLA對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌機(jī)理類似,但也可能存在其他作用靶位,因此未來還需對PLA的抑菌機(jī)制進(jìn)一步研究。此外,本實驗對PLA控制柑橘果實采后綠霉病的效果進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)20 mg/mL乳酸處理可顯著減小柑橘果實的病斑直徑,且有效控制了柑橘果實的初期發(fā)病率,這一結(jié)果表明PLA對柑橘果實采后綠霉病具有一定的抑制作用。

    綜上所述,本實驗所選用兩株乳酸菌均能產(chǎn)PLA,可為產(chǎn)PLA的乳酸菌的開發(fā)和利用提供理論參考,且PLA作為一種新型綠色保鮮劑,應(yīng)用于柑橘果實采后保鮮具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。

    猜你喜歡
    霉病細(xì)胞膜孢子
    為什么對患水霉病的水產(chǎn)動物用藥越多死亡量越大?
    防治水霉病的幾點關(guān)鍵問題
    鯽魚黏孢子蟲病的診斷與防治
    臨海市2015年柑橘疫霉病大發(fā)生調(diào)查及綜合防治
    浙江柑橘(2016年3期)2016-03-11 20:12:49
    異基因造血干細(xì)胞移植后的毛霉病和鐮孢霉病
    制作孢子印
    無所不在的小孢子
    皮膚磨削術(shù)聯(lián)合表皮細(xì)胞膜片治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)療效觀察
    宮永寬:給生物醫(yī)用材料穿上仿細(xì)胞膜外衣
    石頭里的孢子花粉
    一级毛片女人18水好多| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99国产精品一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 性欧美人与动物交配| 一级作爱视频免费观看| 久久热在线av| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 女人被狂操c到高潮| 一区二区三区国产精品乱码| 午夜福利在线在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品,欧美在线| 亚洲黑人精品在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人人妻人人看人人澡| 亚洲专区字幕在线| 亚洲 国产 在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品av久久久久免费| 黄色视频不卡| 色综合站精品国产| 视频区欧美日本亚洲| 久久香蕉激情| 亚洲国产欧美网| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 一a级毛片在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久这里只有精品19| 中文字幕久久专区| 身体一侧抽搐| 窝窝影院91人妻| 日本三级黄在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产成人av教育| 国内精品久久久久久久电影| 中文字幕av电影在线播放| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 岛国视频午夜一区免费看| 国产成人影院久久av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜激情av网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 在线观看日韩欧美| 色综合婷婷激情| 亚洲专区中文字幕在线| 久久中文字幕一级| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 免费在线观看亚洲国产| 日韩有码中文字幕| 久久久久九九精品影院| 久久亚洲真实| 人人妻人人看人人澡| 在线免费观看的www视频| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲欧美精品综合久久99| av视频在线观看入口| 亚洲电影在线观看av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 国产精品一区二区三区四区久久 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲精品国产区一区二| 一区二区三区高清视频在线| 久久人人精品亚洲av| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲三区欧美一区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| svipshipincom国产片| 国产日本99.免费观看| 国产成人av教育| 正在播放国产对白刺激| 淫妇啪啪啪对白视频| 91在线观看av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产一区二区三区视频了| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲成人国产一区在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 久99久视频精品免费| 欧美一级毛片孕妇| 成人三级做爰电影| 国产av一区在线观看免费| 色播在线永久视频| 少妇 在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲国产精品999在线| 国产欧美日韩一区二区三| 国产一区二区在线av高清观看| 99国产综合亚洲精品| 视频在线观看一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美一级毛片孕妇| 午夜久久久久精精品| 午夜日韩欧美国产| 国产精品98久久久久久宅男小说| 无限看片的www在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 97碰自拍视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品永久免费网站| 成人18禁在线播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 美国免费a级毛片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 老司机午夜福利在线观看视频| 中文字幕高清在线视频| 精品不卡国产一区二区三区| 自线自在国产av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩三级视频一区二区三区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 午夜福利欧美成人| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲精品在线观看二区| 久久狼人影院| 久久久久久大精品| 成人手机av| 在线看三级毛片| 可以在线观看毛片的网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 免费看a级黄色片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 十八禁网站免费在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 麻豆成人午夜福利视频| 精品日产1卡2卡| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线国产一区二区在线| 国产视频一区二区在线看| 在线视频色国产色| 亚洲精品在线美女| 熟女电影av网| 成人国产综合亚洲| 国产99白浆流出| 国产av在哪里看| 欧美黄色片欧美黄色片| 丝袜美腿诱惑在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜免费鲁丝| 色哟哟哟哟哟哟| 国产又色又爽无遮挡免费看| 极品教师在线免费播放| 一本一本综合久久| 午夜成年电影在线免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲第一青青草原| 视频区欧美日本亚洲| 一夜夜www| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 曰老女人黄片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲人成77777在线视频| 久9热在线精品视频| 国产精品久久电影中文字幕| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜影院日韩av| 黄色视频不卡| 成年人黄色毛片网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 手机成人av网站| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 丁香欧美五月| 成人免费观看视频高清| 青草久久国产| svipshipincom国产片| 亚洲最大成人中文| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成在线人永久免费视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级片免费观看大全| 国产成人影院久久av| 成人三级做爰电影| netflix在线观看网站| 国产亚洲av高清不卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 手机成人av网站| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久久人人人人人| 搡老岳熟女国产| 波多野结衣高清作品| 国产高清有码在线观看视频 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本a在线网址| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 91大片在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利高清视频| 一区福利在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 可以在线观看的亚洲视频| 日本三级黄在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜福利在线观看吧| 欧美黄色淫秽网站| 麻豆一二三区av精品| 亚洲电影在线观看av| 久久狼人影院| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲第一电影网av| 老司机在亚洲福利影院| 日韩欧美国产一区二区入口| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产成人系列免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品免费视频内射| 黄片小视频在线播放| 一夜夜www| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久精品国产欧美久久久| 曰老女人黄片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品日韩av在线免费观看| а√天堂www在线а√下载| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 操出白浆在线播放| 精品日产1卡2卡| 看免费av毛片| 久热爱精品视频在线9| 久久精品人妻少妇| 他把我摸到了高潮在线观看| 两个人视频免费观看高清| 亚洲免费av在线视频| 最新美女视频免费是黄的| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美精品亚洲一区二区| 日本五十路高清| 露出奶头的视频| 精品欧美国产一区二区三| 午夜精品在线福利| 无人区码免费观看不卡| 亚洲一区高清亚洲精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 日本一本二区三区精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 成人18禁在线播放| 国产熟女xx| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产成人系列免费观看| 亚洲九九香蕉| av片东京热男人的天堂| 91老司机精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 黄色成人免费大全| 成人特级黄色片久久久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久草成人影院| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 丝袜美腿诱惑在线| 午夜精品在线福利| 成人18禁在线播放| 国产亚洲av高清不卡| 在线永久观看黄色视频| 午夜福利免费观看在线| 三级毛片av免费| 国产成人av激情在线播放| 人人妻人人看人人澡| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 91字幕亚洲| 久久久久久久久久黄片| 亚洲五月天丁香| 成人国语在线视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲性夜色夜夜综合| 午夜激情福利司机影院| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久热爱精品视频在线9| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美乱色亚洲激情| 一a级毛片在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产av一区在线观看免费| 国产黄片美女视频| 午夜影院日韩av| 天天添夜夜摸| 在线观看免费午夜福利视频| 在线国产一区二区在线| 亚洲 国产 在线| 国产黄a三级三级三级人| 精品一区二区三区四区五区乱码| 搞女人的毛片| 国产野战对白在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲精品美女久久av网站| 国产国语露脸激情在线看| 午夜免费鲁丝| 午夜免费成人在线视频| 日韩av在线大香蕉| 久久人妻av系列| 18禁观看日本| 嫩草影院精品99| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品一区二区精品视频观看| av在线播放免费不卡| 精品久久久久久久末码| 九色国产91popny在线| ponron亚洲| 久久精品成人免费网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 淫秽高清视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 亚洲av第一区精品v没综合| 精品午夜福利视频在线观看一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲第一青青草原| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲人成网站高清观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久久久午夜电影| 黄色片一级片一级黄色片| 在线国产一区二区在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 香蕉丝袜av| 成年女人毛片免费观看观看9| 又黄又爽又免费观看的视频| 无遮挡黄片免费观看| 夜夜爽天天搞| 国产人伦9x9x在线观看| 18禁观看日本| 黄色视频,在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成人三级黄色视频| 一区二区三区精品91| 国产成人av激情在线播放| 男人舔奶头视频| а√天堂www在线а√下载| 国产视频内射| 黄色成人免费大全| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美乱色亚洲激情| 亚洲成人精品中文字幕电影| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲人成77777在线视频| 99在线视频只有这里精品首页| 久久人妻av系列| 欧美日韩黄片免| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美在线二视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产黄a三级三级三级人| 国产v大片淫在线免费观看| 日本黄色视频三级网站网址| 黄色视频,在线免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 不卡av一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| cao死你这个sao货| 欧美最黄视频在线播放免费| 一级a爱片免费观看的视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲成人精品中文字幕电影| 69av精品久久久久久| 中文在线观看免费www的网站 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| ponron亚洲| 久久亚洲真实| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久精品人妻少妇| 老鸭窝网址在线观看| 久久青草综合色| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一本久久中文字幕| 国产激情欧美一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 91在线观看av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av福利片在线| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲熟妇熟女久久| 女人被狂操c到高潮| 午夜激情av网站| 女性生殖器流出的白浆| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品 国内视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 黄片大片在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| av在线播放免费不卡| 香蕉国产在线看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲第一青青草原| 亚洲欧美激情综合另类| 国产亚洲av高清不卡| 视频区欧美日本亚洲| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲国产看品久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品免费久久久久久久清纯| 伦理电影免费视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美日韩乱码在线| 国产单亲对白刺激| 久热爱精品视频在线9| 亚洲人成77777在线视频| 最近在线观看免费完整版| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品美女久久av网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 日韩免费av在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 无限看片的www在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线看三级毛片| 久久婷婷成人综合色麻豆| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 99re在线观看精品视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美日韩乱码在线| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲自拍偷在线| www.www免费av| 无限看片的www在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 成人国产一区最新在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| a级毛片在线看网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一a级毛片在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看66精品国产| 日韩av在线大香蕉| 国产亚洲精品一区二区www| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品日产1卡2卡| 91成人精品电影| 久久午夜亚洲精品久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 午夜福利高清视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美乱色亚洲激情| av在线播放免费不卡| 亚洲精华国产精华精| 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线观看66精品国产| 免费高清视频大片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲成人精品中文字幕电影| a级毛片在线看网站| 日日夜夜操网爽| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 操出白浆在线播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产成年人精品一区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产爱豆传媒在线观看 | 亚洲欧美激情综合另类| 成人特级黄色片久久久久久久| 大型av网站在线播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产一区二区在线av高清观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女午夜性视频免费| 精品一区二区三区四区五区乱码| 老司机靠b影院| 久久精品成人免费网站| 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美免费精品| 可以在线观看毛片的网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 级片在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲一区高清亚洲精品| 悠悠久久av| 欧美在线一区亚洲| 国产成人精品久久二区二区免费| АⅤ资源中文在线天堂| 91麻豆av在线| 日本五十路高清| 日本一区二区免费在线视频| 国产午夜福利久久久久久| 久久亚洲真实| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 淫秽高清视频在线观看| 一级毛片女人18水好多| 两个人免费观看高清视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 身体一侧抽搐| 俺也久久电影网| 欧美精品亚洲一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| АⅤ资源中文在线天堂| 两个人看的免费小视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久99久视频精品免费| 亚洲电影在线观看av| 日本a在线网址| 这个男人来自地球电影免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 自线自在国产av| 国产精华一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 国产黄色小视频在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 88av欧美| 九色国产91popny在线| 久热这里只有精品99| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲国产精品sss在线观看| 很黄的视频免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产真实乱freesex| 久久精品91蜜桃| 18禁美女被吸乳视频| 91九色精品人成在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美成人性av电影在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 美国免费a级毛片| 欧美在线一区亚洲| 精品不卡国产一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 日本 欧美在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品免费久久久久久久清纯| 国产伦一二天堂av在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 黄片小视频在线播放| 亚洲第一电影网av| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美中文日本在线观看视频| 国产男靠女视频免费网站| 99精品久久久久人妻精品| 丝袜在线中文字幕| 两性夫妻黄色片| 在线观看www视频免费| a在线观看视频网站| 日韩国内少妇激情av| 国产伦人伦偷精品视频| 无限看片的www在线观看| 日本免费a在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一夜夜www| 亚洲色图av天堂| 免费搜索国产男女视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲精华国产精华精| 熟女电影av网| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩中文字幕欧美一区二区| 俺也久久电影网| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲五月婷婷丁香|