芍藥PlHSP70和PlDanJ基因的克隆及表達(dá)分析

賀丹，華超，何松林，曹健康，張明星，張佼蕊，劉藝平,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程研究中心，河南 鄭州 450002)

芍藥(Paeonialactiflora)與牡丹(Paeoniasuffruticosa)同屬于芍藥科芍藥屬，其花朵碩大、花色艷麗，觀賞性高[1-2]。芍藥屬品種豐富，其遠(yuǎn)緣雜交后代具有形態(tài)優(yōu)美、莖稈挺拔、花頭直立等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的抗性[3-6]。但芍藥屬的遠(yuǎn)緣雜交存在嚴(yán)重的不親和現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為花粉與柱頭識(shí)別困難、花粉萌發(fā)與花粉管生長困難等[7-9]。因此，探究芍藥屬組間遠(yuǎn)緣雜交授粉后，花粉在柱頭上的萌發(fā)與生長機(jī)制是芍藥屬育種的關(guān)鍵。

熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)又稱熱休克蛋白，是一類植物面對(duì)非生物脅迫下具有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白[10-11]。HSP70作為熱激蛋白中最保守的家族，在防止蛋白質(zhì)聚合、協(xié)助折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)重新折疊等方面起著重要作用[12-13]。DnaJ蛋白又稱為 HSP40蛋白，作為HSP70的輔助伴侶分子，可以協(xié)助HSP70完成蛋白折疊、解折疊等多種生命活動(dòng)進(jìn)程，還可以直接促進(jìn) HSP70 的ATP 酶活性[14-16]。有研究表明，HSP在花粉萌發(fā)與花粉管生長中具有重要作用，將HSP轉(zhuǎn)基因煙草和棉花與野生型植株、轉(zhuǎn)基因空株對(duì)比，轉(zhuǎn)基因植株花粉的萌發(fā)率和花粉管伸長顯著提高[17]。對(duì)擬南芥進(jìn)行熱處理后，發(fā)現(xiàn)HSP同源蛋白在花粉管中的表達(dá)水平顯著提高，當(dāng)敲除該同源蛋白后，花粉管的生長則出現(xiàn)了顯著的滯后，因此，推測HSP家族基因在花粉管的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[18]。但是，有關(guān)HSP家族基因?qū)ι炙幓ǚ郯l(fā)育的調(diào)控作用未見報(bào)道。本研究以芍藥‘粉玉奴’的柱頭為試驗(yàn)材料，基于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牡丹資源與育種課題組的遠(yuǎn)緣雜交不親和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行HSP家族基因的篩選和分析，并利用RACE技術(shù)克隆PlHSP70和PlDanJ基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期在芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交中，闡明HSP基因?qū)ǚ凵L的調(diào)控作用，為進(jìn)一步探究芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交不親和機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗(yàn)材料均采自于河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程研究中心，取芍藥‘粉玉奴’自交授粉和芍藥‘粉玉奴’×牡丹‘鳳丹白’雜交授粉后2、4、6、8、10、12、24和36 h的柱頭，并于2021年3月采集芍藥的葉、莖，4月采集芍藥的根、花芽、花、柱頭。每個(gè)樣品取0.2 g，3次重復(fù)，液氮速凍后存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組中熱激蛋白家族基因分析 基于前期研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：PRJNA592882)，篩選出芍藥HSP家族基因，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中基因的表達(dá)量(FPKM)繪制熱圖并進(jìn)行分析。利用擬南芥在線網(wǎng)站TAIR(https://www.Arabidopsis.org/)篩選擬南芥HSP家族基因，同時(shí)使用MEGA7軟件對(duì)芍藥、擬南芥這2個(gè)物種的HSP家族基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2PlHSP70、PlDanJ基因克隆 本試驗(yàn)使用改良的CTAB法提取芍藥‘粉玉奴’柱頭RNA[19]。RNA反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa，日本)，設(shè)置3次重復(fù)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，產(chǎn)物放于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

依據(jù)芍藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：PRJNA592882)中篩選的HSP70和DanJ基因序列信息，運(yùn)用NCBI在線網(wǎng)站搜索同源序列并進(jìn)行基因比對(duì)，依據(jù)比對(duì)結(jié)果選取同源性高的序列用于設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR中間序列擴(kuò)增。使用25μL反應(yīng)體系：2×GC Buffer I 12.5 μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5 μL，dNTP 0.2 μL，cDNA 1μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 10.1μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共設(shè)33個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸7 min。利用RACE克隆方法[20]，并通過DNAMAN軟件拼接，獲得PlHSP70與PlDanJ2條基因cDNA全長序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast工具分別對(duì)PlHSP70和PlDanJ基因進(jìn)行序列比對(duì)分析；通過在線網(wǎng)址TMPRED預(yù)測PlHSP70和PlDanJ蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；使用GOR4在線預(yù)測PlHSP70和PlDanJ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用網(wǎng)址Swiss-model進(jìn)行PlHSP70和PlDanJ蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；運(yùn)用DNAMAN9.0軟件進(jìn)行同源氨基酸序列比對(duì)；使用MEGA7軟件，按照鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)樹[21]。

1.2.4PlHSP70與PlDanJ基因的表達(dá)分析 本試驗(yàn)分別以芍藥‘粉玉奴’自交授粉和芍藥‘粉玉奴’×牡丹‘鳳丹白’雜交授粉后2、4、6、8、10、12、24和36 h的柱頭以及芍藥‘粉玉奴’根、莖、葉、花、芽、柱頭的cDNA 為模板，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，以β-Tubulin為內(nèi)參基因(表1)，反應(yīng)體系與程序設(shè)置參照HE等[22]方法進(jìn)行，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量[23]。

表1 芍藥PIHSP70與PIDanJ基因克隆及熒光定量 PCR 所用引物Table 1 Cloning of PIHSP70 and PIDanJ genes from Paeonia lactiflora and primers for quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥HSP家族基因分析

2.1.1 轉(zhuǎn)錄組中芍藥HSP家族基因表達(dá)模式 依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過差異表達(dá)分析篩選出20個(gè)熱激蛋白基因(圖1)。HSP70家族基因的表達(dá)量在自交24 h時(shí)高于雜交24 h。HSP90以及DanJ家族基因在雜交36 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于雜交24 h。目的基因Unigene40632_All(PlHSP70)在雜交36 h的表達(dá)量顯著高于雜交24 h,目的基因CL9793.Contig5_All(PlDanJ)在雜交24 h的表達(dá)量顯著高于雜交36 h，與其他DanJ家族基因具有顯著差異。

PL0101、PL0102、PL0103為自交24 h柱頭的表達(dá)量，PL0201、PL0202、PL0203為雜交24 h柱頭的表達(dá)量，PL0301、PL0302、PL0303為雜交36 h柱頭的表達(dá)量，圖中的9組樣品結(jié)果已進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。PL0101,PL0102,PL0103 are the expression levels of stigma at 24 h of selfing,PL201,PL202,PL203 are the expression levels of stigma at 24 h of hybridization,PL301,PL302,PL303 are the expression levels of stigma at 36 h of hybridization.

2.1.2 芍藥HSP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用MEGA7對(duì)篩選的29個(gè)芍藥HSP家族基因成員和32個(gè)擬南芥HSP家族基因成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖2)。整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹可以分為5個(gè)小簇，每個(gè)小簇均有芍藥熱激蛋白分布。目的基因Unigene40632_All(PlHSP70)位于第Ⅳ個(gè)小簇，目的基因CL9793.Contig5_All(PlDanJ)聚在第Ⅴ個(gè)小簇。

圖2 芍藥與擬南芥HSP家族基因進(jìn)化樹分析Fig.2 Evolution analysis of HSP gene family in Paeonia lactiflora and Arabidopsis thaliana

2.2 PlHSP70和PlDanJ基因克隆及生物學(xué)信息學(xué)分析

2.2.1PlHSP70和PlDanJ基因克隆 采用芍藥‘粉玉奴’柱頭中提取的RNA為模板，通過 RACE克隆技術(shù)獲得芍藥PlHSP70基因與PlDanJ基因的3′端與5′端 cDNA 序列。PlHSP70基因通過擴(kuò)增獲得3′端一條為289 bp的條帶(圖3)，5′端一條為101 bp的條帶(圖3)，最后拼接獲得PlHSP70基因的CDS區(qū)序列1 539 bp，共編碼513個(gè)氨基酸。PlDanJ基因通過擴(kuò)增獲得3′端一條為348 bp的條帶(圖3)，5′端一條為171 bp的條帶(圖3)，最后拼接獲得PlDanJ基因的CDS區(qū)序列1 269 bp，共編碼422個(gè)氨基酸。

1為PlDanJ-3′ RACE擴(kuò)增片段；2為PlHSP70-3′ RACE擴(kuò)增片段；3為PlDanJ-5′ RACE擴(kuò)增片段；4為PlHSP70-5′ RACE擴(kuò)增片段；M為10 000 marker。1 is the amplified fragment of PlDanJ-3′ RACE;2 is the amplified fragment of PlHSP70-3′ RACE;3 is the amplified fragment of PlDanJ-5′ RACE;4 is the amplified fragment of PlHSP70-5′ RACE; M is 10 000 marker.

運(yùn)用NCBI在線網(wǎng)址，分別獲取PlHSP70和PlDanJ氨基酸序列同源性較高的10種植物的HSP70和DanJ的氨基酸序列，使用DANMAN9.0軟件進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，PlHSP70與所選植物HSP70氨基酸序列整體相似性為90.5%，PlDanJ與所選植物DanJ氨基酸序列整體相似性為77.49%(圖4、圖5)。通過NCBI在線網(wǎng)址中CD-search工具進(jìn)行預(yù)測，PlHSP70在其N端具有NBD結(jié)構(gòu)域，PlDanJ具有保守結(jié)構(gòu)域J結(jié)構(gòu)域。

圖4 芍藥PlHSP70的氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的比對(duì)圖Fig.4 Comparison of amino acid sequences of Paeonia lactiflora PlHSP70 gene with those of other plant genes

圖5 芍藥PlDanJ的氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的比對(duì)圖Fig.5 Comparison of amino acid sequences of Paeonia lactiflora PlDanJ with those of other plant

運(yùn)用在線網(wǎng)址NCBI，分別利用PlHSP70與PlDanJ的氨基酸序列對(duì)不同物種的同源序列進(jìn)行比對(duì)，為進(jìn)一步探究PlHSP70、PlDanJ與其他HSP、DanJ類蛋白的進(jìn)化關(guān)系，選取同源性較高的10種植物，使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明(圖6、圖7)，PlHSP70a基因首先與可可聚為一個(gè)分支，同源性較高，與葡萄、苦瓜同源性較低；PlDanJ基因與石斛、蝴蝶蘭聚為一個(gè)分支，同源性相對(duì)較高，與黃連木同源性較低。

圖6 芍藥PlHSP70與其他物種HSP70基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of Paeonia lactiflora PlHSP70 and other species HSP70 genes

圖7 芍藥PlDanJ與其他物種DanJ基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of Paeonia lactiflora PlDanJ and other species DanJ

2.2.2 PlHSP70和PlDanJ理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測 PlHSP70編碼513個(gè)氨基酸，預(yù)測原子組成C2 508H4 041N693O779S24，根據(jù)蛋白理化性質(zhì)分析推測這是一個(gè)帶負(fù)電荷的穩(wěn)定親水性蛋白(表2)。PlDanJ蛋白編碼422個(gè)氨基酸，預(yù)測原子組成C2 031H3 223N591O647S27，根據(jù)蛋白理化性質(zhì)分析推測這是一個(gè)帶負(fù)電荷的穩(wěn)定親水性蛋白(表2)。將PlHSP70和PlDanJ序列輸入SignalP 5.0，結(jié)果顯示，預(yù)測PlHSP70和PlDanJ可能都不具有信號(hào)肽切割位點(diǎn)。

表2 芍藥PlHSP70與PlDanJ蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of Paeonia lactiflora PlHSP70 and PlDanJ proteins

PlHSP70中顯示α-螺旋(alpha helix，h)占34.38%，延伸鏈(extended strand，e)占14.06%，而最大的結(jié)構(gòu)元件是不規(guī)則卷曲(random coil，c)，占51.56%(圖8)。在PlDanJ中α-螺旋(alpha helix，h)占28.20%，延伸鏈(extended strand，e)占18.72%，而最大的結(jié)構(gòu)元件是不規(guī)則卷曲(random coil，c)，占53.08%(圖9)。PlHSP70和PlDanJ三級(jí)結(jié)構(gòu)表明其蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜。

A、B為PlHSP70二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，C為PlHSP70三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。A and B are the secondary structure prediction diagram of PlHSP70,and C is the tertiary structure prediction diagram of PlHSP70.

D、E為PlDanJ二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖；F為PlDanJ三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。D and E are the prediction diagram of PlDanJ secondary structure,and f is the prediction diagram of PlDanJ tertiary structure.

2.2.3 芍藥PIHSP70與PIDanJ基因的表達(dá)分析 通過熒光定量對(duì)PlHSP70與PlDanJ基因在芍藥不同部位的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。如圖10所示，PlHSP70在葉部相對(duì)表達(dá)量最高，在花瓣部位相對(duì)表達(dá)量最少；PlDanJ在根部相對(duì)表達(dá)量最高，在莖部相對(duì)表達(dá)量最少。

注：不同字母表示處理間存在顯著差異(P<0.05)。下同。Note:The different letters indicate significant differences among different treatments(P<0.05).The same as below.

如圖11所示，PlHSP70和PlDanJ的相對(duì)表達(dá)量在授粉后總體呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。2個(gè)基因在自交、雜交授粉后4 h的相對(duì)表達(dá)量都達(dá)到最高，在24 h之前自交授粉的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雜交授粉。在24和36 h，2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量都是雜交高于自交，且36 h的相對(duì)表達(dá)量高于24 h。

圖11 PlHSP70與PlDanJ在芍藥自交、雜交授粉后不同時(shí)間柱頭的相對(duì)表達(dá)量分析圖Fig.11 Analysis of relative expression levels of PlHSP70 and PlDanJ in stigma of Paeonia lactiflora at different times after self-crossing and cross-pollination

3 討論與結(jié)論

基于芍藥遠(yuǎn)緣雜交授粉后的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出20個(gè)HSP家族基因，與擬南芥的HSP基因氨基酸序列信息進(jìn)行進(jìn)化分析，本研究發(fā)現(xiàn)，芍藥HSP家族基因與擬南芥相似，可分成5個(gè)亞組。芍藥20個(gè)HSP家族基因在自交、雜交授粉后不同時(shí)期的柱頭中均有不同程度的表達(dá)，且在自交24 h前的表達(dá)量都顯著高于雜交24 h前的表達(dá)量。結(jié)合前期自交與雜交后花粉在柱頭的萌發(fā)與生長情況，發(fā)現(xiàn)自交后前期花粉管的整體生長情況較雜交后生長正常[24]，因此推測HSP家族基因的上調(diào)可能與芍藥授粉后花粉管前期的生長相關(guān)。

本研究通過RACE克隆得到芍藥熱激蛋白基因PlHSP70(GenBank登錄號(hào)：OM962998)和PlDanJ(GenBank登錄號(hào)：OM962997)，隨后分別對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，PlHSP70基因的氨基酸序列與所選植物的氨基酸序列的整體相似性高達(dá)90.5%，與所選植物HSP70蛋白具有極高的相似度。這與文心蘭HSP70進(jìn)化樹分析結(jié)果相似[25]。RT-qPCR結(jié)果分析表明，PlHSP70與PlDanJ分別在不同器官中的均有表達(dá)，這與馮保云等[25]、袁秀云等[26]研究的文心蘭、蝴蝶蘭等研究情況一致，說明HSP70作為保護(hù)蛋白參與了植物生長發(fā)育的各個(gè)階段。陳旭[27]通過對(duì)擬南芥和水稻花器官不同部位與不同時(shí)期的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大部分HSP70基因在花藥的不同發(fā)育時(shí)期和組織部位都具有表達(dá)變化，說明HSP70基因在花器官的發(fā)育過程中具有重要作用。本研究中PlHSP70與PlDanJ在不同器官中的表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性，PlHSP70在芍藥柱頭部位表達(dá)量較高，推測PlHSP70在芍藥花發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要的作用。PlDanJ在根部表達(dá)量最高，芽部次之，推測PlDanJ在芍藥營養(yǎng)器官發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要的作用。

HSP轉(zhuǎn)基因煙草和棉花與野生型植株、轉(zhuǎn)基因空株對(duì)比，轉(zhuǎn)基因植株花粉的萌發(fā)率和花粉管伸長顯著提高[17]。這可能是由于HSP70大量合成，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，促使線粒體數(shù)量增加，為花粉的發(fā)育提供足夠的能量[28]。HSP70與底物蛋白的結(jié)合需要在DanJ蛋白的幫助下完成，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的正確折疊及功能的正常發(fā)揮[15]。本研究中，在芍藥授粉后24 h之前，PlHSP70和PlDanJ在自交親和的表達(dá)水平均明顯高于雜交不親和的表達(dá)水平，且在前期研究中發(fā)現(xiàn)，自交授粉后1 h柱頭上的花粉大量萌發(fā)，在12 h可觀察到花粉管向花柱方向生長，而雜交授粉后1 h柱頭上的花粉未大量萌發(fā)，在12 h大量花粉管扭曲生長[24]。由此推測PlHSP70和PlDanJ基因在芍藥授粉后花粉的萌發(fā)及生長中起著重要的作用。PlHSP70和PlDanJ在授粉后24和36 h的表達(dá)量均表現(xiàn)為雜交略高于自交，但是整體低于前期的表達(dá)量，這與花粉的整體生長情況相吻合，在雜交授粉24 h后花粉萌發(fā)量達(dá)到最高[29]。MA等[30]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)DanJ基因的J結(jié)構(gòu)域可以激活 BIP1和BIP的ATP酶活性，協(xié)助HSP70基因發(fā)揮功能。因此，推測PlDanJ可能參與PlHSP70調(diào)控芍藥遠(yuǎn)緣雜交后花粉的生長，從而影響芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交不親和性。