空氣輔助霧化的細胞遞送參數(shù)的優(yōu)化

嚴心濤，王 策，王 耀，宋飛飛，武曉東*

（1. 復(fù)旦大學(xué) 工程與應(yīng)用技術(shù)研究院，上海 200433；2. 中國科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所 中科院生物醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)重點實驗室，江蘇 蘇州 215163）

1 引言

大面積皮膚傷口與多種突發(fā)事件、重大疾病緊密相關(guān)，是臨床上常見病癥，其遷延不愈的特性嚴重降低了患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命，并且在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟負擔［1-2］。由大面積皮膚創(chuàng)傷而引發(fā)的一系列嚴重并發(fā)癥和感染是威脅患者生命的兩個重要因素［3］。因此，除了給患者靜脈注射液體和營養(yǎng)素以抵消脫水和補充失去的蛋白質(zhì)外，采取有效的治療方法以減輕患者疼痛和挽回生命顯得至關(guān)重要。目前臨床實踐的有效治療方法主要為自體皮膚移植術(shù)［4-5］，但對于自體皮源本已稀缺的患者，該方法仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。

細胞移植術(shù)是解決這個問題的有效方法［6-8］，即從患者身上采集自體皮膚細胞（通常是角質(zhì)形成細胞）后直接遞送到傷口，或經(jīng)過細胞培養(yǎng)傳代后懸浮，再遞送到傷口。事實證明，細胞移植術(shù)可以顯著影響細胞在傷口中的分布和增殖［9-11］。近些年，細胞移植術(shù)已經(jīng)從靜脈注射、肌肉注射、注射器或移液槍的局部滴/注［12-13］發(fā)展到霧化式噴灑［14-16］。盡管靜脈注射、肌肉注射或局部細胞給藥均顯示出治療效果，但前兩種給藥方法會導(dǎo)致作用于傷口部位的細胞濃度低，治療效果不佳［12］；通過移液槍或注射器進行局部細胞給藥雖可減少患者疼痛，但細胞遞送效率低，且分布不均勻［13］。細胞懸浮液噴霧自體移植用自體表皮衍生細胞，使用更小的自體部位（供體部位與燒傷面積比例ε可達1∶100）即可在短時間內(nèi)完成再上皮化［16-17］，對于深部、大面積和不規(guī)則創(chuàng)面，該方法能實現(xiàn)細胞的快速和高效的遞送。目前涉及組織修復(fù)與再生應(yīng)用的空氣噴槍或霧化裝置仍存在一些缺陷，如生成的霧滴大小不一致、分布不均勻［18］，霧化參數(shù)對霧化特性的精確控制尚不清楚［9］，在輔助空氣壓力為69 kPa 下，細胞活化率僅為65%［19］，有相關(guān)文獻報道［20］對細胞霧化遞送4 天后，細胞增殖能力大受影響，細胞活化率降為45%。如何實現(xiàn)藥物的均勻化霧化、不同面積的霧化或較高的細胞活化率霧化是細胞給藥霧化遞送裝置開發(fā)中需面臨的幾個關(guān)鍵技術(shù)問題。

空氣輔助霧化方法具有僅需較低空氣壓力和射流壓力即可實現(xiàn)較好的霧化效果，以及較大的射流通道可避免堵塞等特點［21］，本文構(gòu)建了基于該霧化方法的可用于細胞遞送的霧化裝置，通過對其霧化特性測試方法研究，側(cè)重分析霧化高度、輔助氣體流量和射流流量等霧化參數(shù)對霧化特性和生物墨水（Bio-ink）遞送的影響，以指導(dǎo)霧化參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計和提高生物墨水的霧化噴涂效率。

2 裝置設(shè)計及試劑材料

2.1 裝置原理及設(shè)計

空氣輔助霧化的細胞遞送裝置（Air-Assisted Atomization Device，AAAD）的工作原理如圖1（a）所示，空氣泵輸出的氣體通過空氣濾芯過濾后分兩個流路，一路經(jīng)氣壓調(diào)節(jié)閥后在霧化噴嘴出口處形成穩(wěn)定的高速渦旋氣流，另一路也經(jīng)氣壓調(diào)節(jié)閥以穩(wěn)定壓力驅(qū)動無菌儲液管中細胞懸浮液，并在噴嘴的針管出口形成液柱或液膜。在噴嘴出口處，氣體與生物墨水之間會形成很高的相對速度，從而破壞液柱或液膜，改變生物墨水的流動性、表觀粘性和表面張力，最終使連續(xù)相的生物墨水變成分散相以達到霧化效果。其中，兩個流路中氣壓調(diào)節(jié)閥分別用于調(diào)節(jié)輔助空氣氣壓以控制氣體流量和調(diào)節(jié)無菌儲液管的驅(qū)動壓力以控制射流流量。為分析霧化高度對霧化性能的影響，霧化噴嘴可沿導(dǎo)桿做上下滑動。

圖1 AAAD 原理及裝置Fig.1 Principle and setup for air-assisted atomization device

AAAD 主要包含氣動控制模塊和霧化噴嘴模塊兩部分，實物分別如圖1（b）和圖1（c）所示。裝置主要組成部件包含流量為10 L/min 的微型空氣壓縮泵（中國，SKOOCOM），100 kPa 與200 kPa 量程且靈敏度均優(yōu)于0.2% 的精密調(diào)壓閥（日本，SMC），儲液筒（日本，MUSASHI），27G霧化針管（日本，MUSASHI），霧化針管的內(nèi)徑為200～250 μm，噴嘴的內(nèi)徑為0.7～1.0 mm。采用量程為5 L/min 且精度優(yōu)于1.5%的微型空氣流量計（中國，SENLOD）和量程為40 mL/min且精度優(yōu)于5%的微型液體流量計（瑞士，SENSIRION）來測量輔助氣體流量和射流流量。

2.2 試劑材料

人永生化表皮細胞（HaCaT，中國，COBIOER）用 含10% 胎 牛 血 清（FBS，中 國，TIANHANG）和1%青霉素/鏈霉素（A5955，Sigma）的高糖培養(yǎng)基（DMEM，Gibco）在T75 cm 培養(yǎng)瓶（美國，CORNING）中培養(yǎng)，孵育條件為37 ℃、CO2的體積分數(shù)為5%。每4 天傳代一次，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。當細胞達到90%以上匯合時，用胰蛋白酶（15090046，Gibco）收集細胞，將細胞懸液在室溫下以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，再將細胞重懸于無菌生理鹽水（ST341，中國，Beyotime）中，配制成細胞密度約為106cells/mL 的生物墨水。在霧化基本特性測試中，均以無菌生理鹽水為研究對象。

3 霧化特性測試方法

3.1 霧滴粒徑分布及均勻度分析

本文采用激光粒度儀（JL-3000，中國，JNGX）對霧滴粒徑進行測量。該儀器主要基于夫瑯和費（Fraunhofer）衍射理論測量霧滴尺寸及對應(yīng)的霧滴個數(shù)。霧化噴嘴產(chǎn)生的霧滴是由大小不等的霧滴群組成，本文霧滴粒徑分布采用體積累積分布表示，平均粒徑采用體積平均粒徑D［4，3］計算，即：

經(jīng)換算可得：

其中：n是各個單一粒徑對應(yīng)的霧滴個數(shù)；D是霧滴的粒徑，單位為μm；f是各單一粒徑的霧滴群對應(yīng)的體積頻度。

通常，霧滴粒徑是不連續(xù)的，但當霧滴數(shù)量足夠多時，可假設(shè)霧滴的粒徑累計分布是連續(xù)的，通常其符合Rosin-Rammler 分布（簡稱“R-R”分布）規(guī)律［22］，即：

其中：F(Di)表示霧滴粒徑小于Di的體積累計百分比；Dˉ為霧滴的特征尺寸，即F(Di)=0.632 對應(yīng)的霧滴粒徑；k為均勻度指數(shù)，k越大，表示霧滴粒徑分布的均勻性越好。對于符合“R-R”分布規(guī)律的霧化，若粒徑Di和Dj對應(yīng)的累計百分比分別為F(Di)和F(Dj)，則由式（3）不難推導(dǎo)出霧化均勻度指數(shù)k[Di，Dj]，即：

3.2 霧化角測試及霧化面積評估

霧化過程中霧滴群在空間呈圓錐狀分布，該圓錐的張角即為霧化角，其大小直接影響霧化面積A。本文采用工業(yè)相機（DMK 23G445，德國，THE IMAGING SOURCE）對霧化狀態(tài)攝像后，在Matlab（美國，MathWorks）中計算霧化角。使用寬工作距離范圍的物鏡（BLADE 2.4/12，Korea，F(xiàn)IM optcis），攝像分辨率為640×480 像素，其中每個像素對應(yīng)物方尺寸為139 μm。

由于單幀圖像信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）較低，邊界提取不準確，而隨著圖像疊加數(shù)量的增加，SNR 也將增大。經(jīng)測試，單幀圖像的SNR 僅為11.8 dB，用于霧化邊界提取誤差較大，通過對多幀圖像進行疊加，可顯著提高圖像的SNR。當疊加圖像達到227 幀時，圖像SNR為50 dB，對疊加后的高SNR 圖像進行二值化處理，能夠有效保留霧化邊界，且邊界更加清晰。隨著圖像的疊加數(shù)量增多，SNR 將進一步增大，如當疊加視頻中所有圖像時（總幀數(shù)為238），圖像SNR 可達65.5 dB。本文計算霧化角的方法是：先對霧化過程進行連續(xù)視頻拍攝，分析時，疊加視頻的所有幀的圖像，以提高圖像SNR，如圖2（a）為單幀圖像，圖2（b）為視頻疊加圖像；對霧化角圖像進行二值化，采用局部自適應(yīng)閾值分割算法，該算法可根據(jù)局部光強分布自動調(diào)整二值化閾值，對于邊界的識別更加準確和穩(wěn)定，如圖2（c）；圖2（d）為二值化圖像的邊界數(shù)據(jù)點，考慮到靠近噴嘴和遠離噴嘴處的霧化角度有所變化，因此數(shù)據(jù)點的分析也分為兩部分，采用最小二乘法擬合數(shù)據(jù)點，得到邊界直線方程，進而計算得到靠近噴嘴的霧化角θ1和遠離噴嘴處的霧化角θ2。如圖2（d）所示，計算出霧化角θ1和θ2后，可進一步估算出生物墨水噴灑在基板上的面積A，即：

圖2 霧化角測試方法Fig.2 Measurement method of atomization angle

其中：hN為最小二乘法擬合直線斷點位置距離噴嘴出口位置的高度，hF為霧化基板距離噴嘴出口位置的高度，單位均為mm。

3.3 霧滴沉降速度

由于霧滴沉降速度會影響細胞活性［23］，本文利用高速相機（HS1，德國，PCO）的雙快門捕獲功能來測算霧滴沉降速度，相機單次曝光時間設(shè)置 為10 μs，拍 攝 時 間 間 隔T為3.58 μs。采 用10×遠距離物鏡（375-039，日本，三豐），視場為1.65×2.75 mm2。由于曝光時間極短，拍攝圖像SNR 較低，如圖3（a），很難對視場中的霧滴進行準確定位。本文采用BM3D 去噪算法，可有效提高圖像質(zhì)量，如圖3（b）；利用二值化算法對圖像中的霧滴進行識別后，如圖3（c），根據(jù)霧滴光強分布計算得到霧滴質(zhì)心坐標(xT1，zT1) 和(xT2，zT2)，高速相機雙快門捕獲圖像處理前與處理后分別如圖3（d）和圖3（e）所示；再根據(jù)相鄰兩幀圖像中霧滴的坐標，分別計算出霧滴的橫向運動速度vx= |xT2-xT1|T，縱向運動速度vz=以及合速度。

圖3 霧滴沉降速度測試方法Fig.3 Measurement method of droplet settling velocity

3.4 細胞活化率測試

將配制好的生物墨水一部分用于無噴涂的陰性對照，采用注射器（2 mL，中國，KINDLY）擠壓遞送；另一部分用AAAD 噴灑。為了評估霧化后活細胞數(shù)與死細胞數(shù)比例，采用Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒（C2015M，中國，Beyotime）在37 ℃避光孵育30 min，再用倒置熒光顯微鏡（IX73，日本，OLYMPUS）拍攝熒光圖片，并利用ImageJ（美國，National Institutes of Health）對熒光圖像進行自動計數(shù)和Merge 處理。細胞活化率η由活細胞總數(shù)占細胞總數(shù)（含活細胞與死細胞）的百分比來表示。采用CCK-8 試劑盒（C0043，中國，Beyotime）檢測噴涂或未噴涂的細 胞 在24 h、48 h 及72 h 后 的 活 性，來 分 析AAAD 噴涂對細胞增殖性能的影響。

公開的文獻［15］中已分析了輔助空氣壓力PA對η的 影 響，即 在hF為100 mm，PA≤70 kPa時，PA對η無顯著差異。在本文中，重點分析hF和輔助空氣流量QA對η的影響。

3.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（Standard Deviation，SD），并使用Origin（美國，OriginLab）做非配對t檢驗（Unpaired t test）、單因素方差分析（One-Way ANOVA）或雙因素方差分析（Two-way ANOVA），以評估各實驗組之間的差異性。

4 結(jié)果與討論

4.1 射流流量和霧化高度對霧滴粒徑分布的影響

圖4 為霧滴粒徑分布及霧化參數(shù)對其影響。QA設(shè) 定 為3 L/min，在 不 同QL和 不 同hF的 霧 化條件下，經(jīng)激光粒度儀得到不同霧滴粒徑及對應(yīng)的體積頻度f，如圖4（a）所示，由式（2）可計算出D［4，3］，根據(jù)式（3）可以得到“R-R”分布曲線，在該曲線上分別選取25%和75%累計百分比對應(yīng)下的粒徑大小D25 和D75，一般選取D25 和D75之間的分布情況來說明顆粒的集中情況［15］，利用式（4）計算出k[D25，D75]來定性分析霧滴的均勻度程度。

通過雙因素方差分析，可得出hF、QL以及兩者間的交互作用均對D［4，3］有顯著影響。利用單因素方差分析來具體探究它們之間的關(guān)系，如圖4（b），不難得到：（1）在同等hF下，QL對D［4，3］有顯著影響，表現(xiàn)為QL越大，D［4，3］越大；（2）QL=0.2 mL/min 時，hF對D［4，3］無顯著影響；（3）以高度為25 mm 實驗組為參考組，在相同QL條件下，50 mm 實驗組與參考組差異不大，但75 mm 實驗組和100 mm 實驗組與參考組相比均顯著增大，這說明在霧化過程中，當hF大于一定值后，隨著其進一步增大，霧滴與霧滴間存在融合現(xiàn)象，使得D［4，3］有顯著增大趨勢，但當QL過低時，hF對D［4，3］無顯著影響。

圖4 霧滴粒徑分布及霧化參數(shù)對其影響，其中，H1～H4 分別表示霧化高度為25、50、75 及100 mmFig.4 Droplet size distribution and the influence of spray parameters on it，H1-H4 represented the spray height of 25，50，75 and 100 mm，respectively

封裝細胞的霧滴與基板發(fā)生撞擊中可能造成細胞損失，一般而言，D［4，3］越小，細胞活化率η越低［23］；但D［4，3］過大時，細胞位于霧滴邊緣概率會增加，霧滴與基板撞擊過程中，細胞受到的剪切應(yīng)力會增大，η降低［24］。因此，hF與QL在細胞遞送中是重要霧化參數(shù)。細胞傳送裝置在實際使用中QL一般低于5 mL/min［14，16，25］，否則會影響生物墨水的利用率。

經(jīng) 測 量，當QA=3 L/min 時，PA≈20 kPa。利用單因素方差分析可以得到：在H2 實驗組和H4 實驗組中，QL對k[D25，D75]有顯著不同的影響，但影響程度不一致，如圖4（c）所示，說明這兩組實驗的霧滴生成狀態(tài)不穩(wěn)定；但在H1～H4 四 組 實 驗 中，當QL相 同 時，hF對k[D25，D75]影響不大。為進一步分析噴嘴出口的輔助空氣流場對霧化的影響，研究了20～100 kPa 輔助氣體壓力下的霧滴分布狀態(tài)，如圖4（d）所 示，可 得 到：在PA≤50 kPa 時，各 實驗 組 的k[D25，D75] 相 差 不 顯 著；而 在PA≥60 kPa 時，各實驗組的k[D25，D75]顯著提高，尤其在80 kPa 和90 kPa 實驗組中，相對于前一個梯度實驗組而言，k[D25，D75]提高地非常顯 著。雖 然PA的 增 大 能 提 高k[D25，D75]，但同樣會影響細胞遞送中η值，在文獻［15］中已做了相關(guān)分析。因此，在一些生物材料需均勻化噴涂而不考慮η指標時，可以重點關(guān)注PA這項霧化參數(shù)。

4.2 霧化角及霧化面積的影響因素

圖5 為霧化參數(shù)對霧化角及霧化面積的影響。經(jīng)最小二乘法擬合邊界直線方程，在不同QL下可計算得到θ1和θ2，且hN≈25 mm。從圖5（a）中可看到：在QA為3 L/min 的實驗組中，隨著QL增大，θ1先從26.44°增加到30.81°之后一直遞減到8.04°，而θ2在15.55°～25.26°間上下波動；當QL≤7 mL min 時，θ1＞θ2；而 在QL為8 mL/min或9 mL/min 時，θ1＜θ2。結(jié) 果 表 明，在QA恒 定條件下，QL對θ1的影響比對θ2的影響顯著。利用式（5）可計算出在不同QL下的霧化面積A，其中取hN=25 mm。不難發(fā)現(xiàn)在固定hF下調(diào)節(jié)QL時，在QL=3 mL/min 條件下的A最大，且hF越大，差異越顯著；在hF=25 mm 時，霧化面積可控制在100 mm2內(nèi)，可滿足小面積噴灑的工況，如圖5（b）所示。

圖5 霧化參數(shù)對霧化角及霧化面積的影響Fig.5 Effect of atomization parameters on spray cone angle and spray area

為如圖5（c），在QL為3 mL min的實驗組中，當QA≤1.5 L/min 時，霧化不充分，且θ1略小于θ2；而 當QA≥2 L/min 時，霧 化 效 果 良 好，θ1和θ2會顯著增大，且趨于平穩(wěn)，θ1＞θ2。結(jié)果表明，在QL恒定條件下，為形成良好的霧化效果，QA需足夠大，建議不低于2 L/min。其中，部分霧化圖像如圖5（d）所示。

4.3 氣體流量和霧化高度對霧滴沉降速度的影響

圖6 （a）是霧滴沉降速度測試平臺；在QL為3 mL/min，QA≤5 L/min 時，如圖6（b）所示，H1實驗組的vx最高，隨著霧化高度hF變大，vx會降低，但H3 與H4 實驗組的vx變化不大；在各個實驗組中，QA對vx影響不大；由圖6（c）和圖6（d）可知，vz和vr均比vx大的多；在4 個實驗組中，H2 實驗 組 的vz和vr最 大；在 各 個 實 驗 組 中，QA對vz和vr影響也不顯著。

圖6 霧滴沉降速度測試及影響分析Fig.6 Measurement and influence analysis of drop velocities

結(jié)果表明，在輔助空氣低流量下，霧滴的運動速度受hF的影響較大；輔助氣體流場主要在噴嘴出口的小范圍內(nèi)影響vx，隨著hF變大，霧滴在空氣阻力作用下，vx會逐漸減??；霧滴的vz和vr在輔助氣體的作用下，有一段加速積累的過程，需運行一定距離后才會逐漸降低。霧滴的運動速度直接影響其與霧化基板之間的剪切應(yīng)力，為保證細胞霧化遞送中的細胞活化率η，霧滴的運動速度應(yīng)盡可能低。因此，對于本文設(shè)計的霧化噴嘴，應(yīng)避免在50 mm 的霧化高度噴涂。

4.4 生物墨水霧化的細胞活化率影響因素

經(jīng)倒置熒光顯微鏡拍攝和Image J 軟件分析后，可得出陰性對照組和不同hF下實驗組中η，如圖7（a）。經(jīng)單因素方差分析，得到hF對η有顯著的影響（p＜0.001）；將各個實驗組與陰性對照組作非配對t 檢驗，可得到在50 mm 的霧化高度進行細胞傳遞時，確實會顯著降低η（p＜0.001），如圖7（b）所示，該結(jié)果同時證明了η與霧滴粒徑分布和霧滴沉降速度均存在一定關(guān)聯(lián)。圖7（c）結(jié)果表明，當QA≤3 L/min 下，QA對η無顯著影響；而 在QA≥4 L/min 下，QA對η會 有 顯 著 負 作 用。采用CCK-8 試劑盒對HaCaT 細胞在24 h、48 h以及72 h 后增殖檢測的結(jié)果顯示，AAAD 噴涂對細胞增殖性能無顯著影響，如圖8 所示。

圖7 AAAD 噴涂的HaCaT 細胞活性Fig.7 Viability of cells sprayed by AAAD

圖8 細胞增殖不受AAAD 噴涂的影響Fig.8 Proliferation of cells was not impaired by AAAD sprayed

5 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種基于空氣輔助霧化技術(shù)的可用于細胞遞送的霧化裝置；系統(tǒng)地研究了霧滴粒徑分布、霧化角、霧滴沉降速度等霧化特性的光學(xué)測試方法、圖像優(yōu)化處理算法以及霧滴均勻度和霧化面積的定量評估方法；并利用統(tǒng)計學(xué)方法分析了多種霧化參數(shù)對霧化特性或細胞活化率的影響。結(jié)果表明：高于60 kPa 的輔助氣體壓力與霧滴均勻度呈正相關(guān)關(guān)系，但會降低細胞活化率；通過控制射流流量和霧化高度，可實現(xiàn)50～1 800 mm2大寬幅的霧化面積調(diào)節(jié)；霧滴的運動速度受霧化高度影響較大，且在50 mm 附近的運動速度最大，均值可達14 m/s；霧化高度顯著影響著霧滴的粒徑分布和運行速度，進而影響到細胞活化率，結(jié)果顯示霧化高度為50 mm 時對細胞活化率有非常顯著影響，陰性對照細胞活化率均值為92.98%，在50 mm 霧化高度時其僅為64.01%，而在100 mm 霧化高度時其可高達90.24%。本文研制的霧化裝置為細胞或生物材料提供了一種遞送手段，霧化特性測試方法的研究也對霧化參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計和細胞或生物材料的噴涂效率提升具有指導(dǎo)意義。此外，霧化裝置所需氣源的輸出流量不超過10 L/min 即可實現(xiàn)較好的霧化效果，這為未來開發(fā)一體化手持式的細胞霧化噴槍創(chuàng)造了有利條件，在細胞移植術(shù)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。