不同環(huán)境下厭氧氨氧化菌對鹽度的響應及生物量作用

蘇 楊，楊 宏

（北京工業(yè)大學城市建設學部，北京市水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室，北京 100124）

厭氧氨氧化（ANAMMOX）是一種新型的微生物氮轉(zhuǎn)化途徑。厭氧氨氧化菌能夠氧化氨氮并生成N2，無需有機碳源和O2，減少藥劑投加費用和曝氣能耗〔1?2〕。盡管厭氧氨氧化較常規(guī)污水脫氮工藝具有明顯優(yōu)勢，但厭氧氨氧化菌對環(huán)境參數(shù)如溫度和鹽度非常敏感，阻礙了其進一步應用〔3〕。隨著工業(yè)活動與海水利用程度的增加，需要處理的含鹽含氮廢水增多〔4?5〕。厭氧氨氧化系統(tǒng)中微生物的菌群結(jié)構(gòu)可能影響厭氧氨氧化性能及在不利環(huán)境下的抵抗能力。因此，考察鹽濃度對厭氧氨氧化菌的影響具有重要意義。

厭氧氨氧化相關工藝的最佳溫度范圍在30~37 ℃，多應用于溫度較高的場景（如污泥消化液）〔3〕。厭氧氨氧化菌在15 ℃下的活性僅為35 ℃的1/10〔6〕。即使具有較高的活性，10 ℃的低溫條件下仍需700 d 的培養(yǎng)才能獲得適應低溫的厭氧氨氧化菌〔7〕。這對厭氧氨氧化菌在低溫條件下的脫氮效能提出挑戰(zhàn)。

低鹽度對于實驗室中溫運行的厭氧氨氧化反應器具有正向刺激作用〔8〕，低溫環(huán)境下低鹽度對厭氧氨氧化菌降解能力的影響尚不清楚。此外，高鹽度會降低細胞活性。鹽度條件下對厭氧氨氧化菌的增殖不利，導致厭氧氨氧化技術處理含鹽廢水非常困難。研究表明，當反應體系中的污泥生物量>10 g/L，厭氧氨氧化菌對鹽度（30 g/L）的適應時間縮短〔9?10〕。生物量在厭氧氨氧化菌適應鹽度中發(fā)揮的作用也有待進一步研究。筆者選用一系列SBR反應器，探究鹽度促進或抑制厭氧氨氧化菌的濃度閾值及菌群變化，比較中、低溫條件下低鹽度對厭氧氨氧化菌脫氮效能的影響，評估高鹽度沖擊下厭氧氨氧化菌對生物量的響應規(guī)律，以期為厭氧氨氧化工藝處理含鹽廢水的優(yōu)化控制提供一定理論參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

接種污泥為實驗室儲備的厭氧氨氧化顆粒污泥。實驗用水為人工配水，NH4+?N、NO2??N 分別由（NH4）2SO4和NaNO2提供，以靜置24 h 后的自來水稀釋至目標濃度。

無機培養(yǎng)液包括1.25 g/L NaHCO3、0.15 g/L CaCl2·2H2O、0.3 g/L MgSO4·7H2O、0.05 g/L KH2PO4、0.025 g/L FeSO4·7H2O，以及1 mL/L 的微量元素Ⅰ和Ⅱ。微量元素組成〔11〕見表1。基質(zhì)pH 由體積分數(shù)為1%的H2SO4溶液控制在7.7~8.0。

UV752N 紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司），便攜式溶解氧儀（美國HACH 公司），pHS-3C 型便攜式pH 計（上海儀電儀器有限公司），ZHWY-2102C 恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 實驗方法

（1）無添加/添加鹽度對厭氧氨氧化菌的促進及抑制實驗。在2 L SBR 反應器中培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥12 d，然后等分為2 部分，即對照組A0 和含鹽組A1，在有效體積為1 L 的SBR 反應器中于35 °C 下恒溫運行。SBR 循環(huán)周期為24 h（注入5 min，反應23.5 h，沉降20 min，出料5 min），換水比例為80%。初 始進水中氮質(zhì)量濃度為225 mg/L〔m（NO2??N）∶m（NH4+?N）=1.2∶1〕，A1 中的鹽逐漸增至14 g/L，每2 d 鹽度提升1.0 g/L。

（2）典型中、低溫條件下低鹽度對厭氧氨氧化顆粒污泥的短期影響實驗。設置4 個有效體積為0.5 L 的SBR 反應器，用蒸餾水調(diào)節(jié)相同的最終污泥質(zhì)量濃度（以VSS 計，約8 g/L）。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中設置不同的鹽度及溫度（B1：0、35 ℃；B2：5 g/L、35 ℃；B3：0、15 ℃；B4：5 g/L、15 ℃）。初始進水中氮質(zhì) 量 濃 度 為225 mg/L〔m（NO2??N）∶m（NH4+?N）=1.2∶1〕，SBR 循 環(huán) 周 期 為24 h（注 入5 min，反 應23.5 h，沉降20 min，出料5 min），換水比例為80%，共運行35 d。

（3）不同生物量下鹽度對厭氧氨氧化顆粒的短期抑制實驗。設置4 個有效體積為0.5 L 的SBR 反應器（C1、C2、C3、C4），用蒸餾水調(diào)節(jié)最終污泥質(zhì)量濃度分別約4、6、8、10 g/L（以VSS 計）。初始進水中氮質(zhì)量濃度為225 mg/L〔m（NO2??N）∶m（NH4+?N）=1.25∶1〕，SBR 循 環(huán)周期為24 h（注 入5 min，反 應23.5 h，沉降20 min，出料5 min），換水比例為80%，共運行35 d。此外，鹽度以5.0 g/L 為梯度，由0 g/L提升至20 g/L。

通過測定NH4+?N、NO2??N 和NO3??N，考察 鹽度、溫度及生物量對厭氧氨氧化顆粒污泥的影響。

1.3 比厭氧氨氧化活性

實驗運行期間，通過批次測試測定不同鹽度梯度的比厭氧氨氧化活性。

從反應器中收集厭氧氨氧化污泥樣品，用磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，對應pH 為7.4）洗滌3 次以去除殘留底物。將1.0 g/L 的污泥加入工作體積為100 mL 的血清瓶中。初始NH4+?N 和NO2??N 質(zhì)量濃度均為150 mg/L，在培養(yǎng)基中加入與SBR 反應器相同的鹽度（即0、5、9、14 g/L 的NaCl），用體積分數(shù)為1%的H2SO4控制培養(yǎng)基pH 在7.8 左右。血清瓶通入N（299.99%）10 min 以除去氧氣，立即用丁基橡膠密封并放入恒溫振蕩器中，溫度為（32±1）℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。每小時用注射器抽取5 mL 液體，測定NH4+?N 和NO2??N。SAA 按1.5 方 法 測 定。每 項參數(shù)重復測定取平均值。

1.4 分析方法

參照文獻〔12〕對水質(zhì)進行分析。NH4+?N 采 用納氏試劑分光光度法測定，NO2－?N 采用N?（1?萘基）?乙二胺光度法測定，NO3－?N 采用紫外分光光度法測定，DO 采用便攜式溶解氧儀測定，pH 采用便攜式pH 計測定。

為研究厭氧氨氧化系統(tǒng)的菌群結(jié)構(gòu)對鹽度的響應，分別以接種污泥、未添加鹽的對照組A0 及添加9 g/L 鹽度的污泥樣本進行高通量測定分析。針對V3~V4 區(qū)的16S rRNA 采用帶特異性引物341F（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTA CGGGNGGCWGCAG）/805RGACTGGAGTTCCTTGGC ACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）〔13〕進行擴增，隨后在Illumina HiSeq 2500 PE250 平臺上機測序。選取OTU 代表序列與數(shù)據(jù)庫Silva 最新序列比對物種信息，將OTU 代表序列（97%相似水平）在門、屬水平上分析樣品的群落組成與豐度關系。

1.5 參數(shù)計算方法

1.5.1 比厭氧氨氧化活性

比厭氧氨氧化活性（SAA）按式（1）計算。

1.5.2 化學計量比

化學計量比按式（2）、式（3）計算。

式中：SAA——比厭氧氨氧化活性，kg（/kg·d）；

Rs——亞硝氮相對氨氮的消耗比例；

Rp——硝態(tài)氮相對氨氮的生成比例；

HRT——水力停留時間，h；

VSS——污泥質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽度對厭氧氨氧化顆粒污泥的雙向影響

考察了鹽度對厭氧氨氧化顆粒污泥的影響，結(jié)果見圖1。

如圖1 所示，實驗分為2 個階段，第Ⅰ階段（第0 天~第18 天）比較厭氧氨氧化菌在未添加（A0）/添加鹽度（A1）環(huán)境下的脫氮性能。第Ⅱ階段（第19天~第34天）繼續(xù)考察A1提高鹽度后的抑制濃度。從第13天開始，A1 以2 d 為單位、1 g/L 為梯度逐漸提升鹽度。由于環(huán)境改變，A1 的出水基質(zhì)濃度在第0 天~第5 天升高，隨后逐漸降低。A0 和A1 的化學計量比Rs 在第3 天分別為1.15、1.24，與理論值1.15 相近〔14〕。

由圖1（a）、（b）還可知，添加鹽度在5 g/L 以下時，A1 出水始終低于A0。雖然該鹽度下A1 的氮容積去除負荷（NRR）增幅略微變緩，但至第Ⅰ階段結(jié)束時其仍高于A0，上述數(shù)據(jù)表明低鹽度有助于厭氧氨氧化系統(tǒng)的效率提升及穩(wěn)定。NRR 的增長速率可能與不同厭氧氨氧化菌屬對鹽度的適應性有關。鹽度增至9 g/L 時A0 出水才首次低于A1，A1 在10 g/L 時出現(xiàn) 亞 硝 氮 積 累，NH4+?N 保 持 在20.18 mg/L，NO2??N升 至36.12 mg/L，導 致A1 的NRR 低 于A0，約 為0.57 kg（/m3·d）。有研究表明，脫氮性能不會因低鹽度（如8.7 g/L）而被抑制，但鹽度超過10 g/L 后脫氮性能會逐漸變差〔13?14〕。本研究中，經(jīng)過4 d 的適應期A1 出水NO2??N 降至17.41 mg/L，表明只要保證適當?shù)鸟Z化梯度，厭氧氨氧化顆粒污泥能夠適應該含鹽量 的 廢 水。但 當 鹽 度 升 至14 g/L 時，NH4+?N 和NO2??N 都 不 再降低。至 第Ⅱ階 段結(jié)束，A1 出 水 的NH4+?N、NO2??N 分別升至20.04、30.04 mg/L。

圖1 無/有鹽度對厭氧氨氧化顆粒污泥的影響的進出水濃度Fig.1 Concentration of inlet and outlet water in the non-salinity/salinity environment

進一步考察了A1 的污泥活性隨鹽度的變化趨勢，如表2 所示。

表2 鹽度對SAA 的影響Table 2 Specific anammox activity after salinity addition

由表2 可見，不同鹽度條件下SAA 經(jīng)歷了先增長后降低的過程，鹽度為5 g/L時SAA約為0.11 kg/（kg·d），高于初始狀態(tài)〔0.09 kg/（kg·d）〕，表明低鹽度對提高厭氧氨氧化菌的脫氮性能產(chǎn)生正向刺激作用。鹽度為9、14 g/L 時，SAA 下降且降幅較大。整個實驗過程中SAA對鹽度的敏感度較高，進一步明確了鹽度對厭氧氨氧化菌雙向影響的濃度閾值。實驗中鹽度的正向刺激質(zhì)量濃度為5 g/L，不宜超過14 g/L。

2.2 低鹽度對中、低溫下厭氧氨氧化顆粒污泥的短期影響

由2.1 可知，添加低鹽度有助于厭氧氨氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。通過4 組批次實驗，考察典型低溫（15 ℃）和中溫（35 ℃）條件下低鹽度（5 g/L）對厭氧氨氧化顆粒污泥底物的降解能力是否有促進作用，結(jié)果見圖2。

由圖2 可見，經(jīng)過35 d 的運行，啟動初期溫度對厭氧氨氧化菌的影響明顯。無論是否添加鹽度，B1和B2 的脫氮性能均好于B3、B4（低溫條件）。其中，B1、B2 的氨氮雖然在0~3 d 由12.62、16.31 mg/L 短暫上升至30.25、36.38 mg/L，但在第4 天迅速下降，比B3、B4 提前約5 d。

圖2 低溫低鹽度對厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮性能Fig.2 Low temperature and salinity on the nitrogen removal performance of Anammox granular sludge

對于NO2??N，雖然B1~B4 均呈下降趨勢，但添加鹽度之初B4 的出水基質(zhì)顯然高于其他3 組。添加鹽度的B2、B4 的NO2??N 濃度均高于同樣溫度的對照組B1、B3 的NO2??N，10 d 后才實現(xiàn)對鹽度的適應。第10 天 為B1 和B2（溫 度 均 為35 ℃）出 水NO2??N 的 轉(zhuǎn) 折 點，此 后B2 出 水NO2??N 始 終 低 于B1。而 低 溫 下 的B4 出 水NO2??N 用 時18 d 才 低 于B3，表明低溫使厭氧氨氧化菌的性能下降〔15〕。至實驗結(jié) 束 時，B1~B4 的NO2??N 質(zhì) 量 濃 度 分 別為7.95、0.9、20.34、16.93 mg/L。李祥等〔16〕的研究指出溫度<15 ℃時，氮去除速率不足37 ℃時的1/3。而本研究中，B4 出 水NH4+?N 和NO2??N 低 于 同 溫 度 的B3 出水，略高于35 ℃的B1 出水，顯示低鹽度在低溫系統(tǒng)中能夠提升脫氮效能。此外，添加鹽度的B4、B2 出水NH4+?N 和NO2??N 濃度均分別低于同組的B3、B1出水，但35 ℃時的提升幅度仍高于15 ℃。

本研究和其他研究中，低于5 g/L 的鹽度可以正向刺激厭氧氨氧化菌〔17〕，但在低溫條件下厭氧氨氧化菌對鹽度更加敏感。在同系列溫度條件下，低濃度的鹽主要通過增強亞硝氮的降解能力，避免低溫下亞硝氮積累而引發(fā)的基質(zhì)抑制。出水殘留硝態(tài)氮也存在不同變化。B2 出水硝態(tài)氮先高于B1 出水，隨后逐漸降至與B1 出水相似；而處于低溫條件下的B4 出 水NO3??N 始 終 高 于B3 出 水，約 為B3 的2~3倍。圖2（d）顯示，與B1（未加鹽度）相比，加入低鹽度的B2 在初始階段更接近理論化學計量比；15 ℃時，添加鹽度的B4 在初始狀態(tài)不穩(wěn)定的條件下，恢復效果顯著。2 組同溫度系列試驗結(jié)束時更接近理論值。因此認為低溫條件下，低濃度鹽同樣可以促進厭氧氨氧化工藝的啟動及提高穩(wěn)定性。

2.3 高鹽度沖擊對不同生物量厭氧氨氧化顆粒污泥的短期抑制

不同于低溫低鹽度條件下厭氧氨氧化菌活性的提升，在適溫條件下，高鹽度不利于厭氧氨氧化工藝的穩(wěn)定運行。針對高鹽環(huán)境中，污泥生物量對厭氧氨氧化菌是否有緩解作用進行研究，結(jié)果見圖3。

圖3 不同生物量厭氧氨氧化顆粒污泥受鹽度沖擊時的變化情況Fig.3 Nitrogen removal performance of granular sludge with different biomass under impact of salinity

由圖3 可見，不同生物量的厭氧氨氧化顆粒污泥對鹽度沖擊的響應不同，C1~C4 在高鹽度環(huán)境（10 g/L）下均受到抑制。特別地，當C1 受到>5 g/L的 鹽 度 沖 擊 時，NH4+?N 和NO2??N 的 降 解 速 率 分 別降至0.037、0.046 kg/（kg·d），降解情況與2.1 中低鹽度的促進作用不同，推測可能是由于低生物量對較高鹽度梯度耐受性更差。當進水鹽度增至20 g/L時，NH4+?N 和NO2??N 降 解 速 率 的斜率未隨 鹽 度 的增加而進一步下降，鑒于SAA 較低，分析認為鹽度為15 g/L 時對C1 已造成相當程度的抑制。

此外，在高鹽度沖擊下低生物量反應器的化學計量比 顯著改變。與其他反應器相比，C1 的ΔNO2??N∶ΔNH4+?N（Rs）隨鹽度沖擊強度的增加波動幅度變大，特別對于15 g/L 以上的鹽度沖擊，Rs 迅速增至1.41，偏離穩(wěn)態(tài)值。這可能是由于鹽度快速變化導致可溶性有機碳和氨氮增加，促使反硝化過量消耗亞硝酸鹽。

實驗過程中，生物量對鹽度脅迫下的厭氧氨氧化顆粒污泥具有緩沖效應，鹽度對厭氧氨氧化顆粒污泥的抑制程度隨生物量的增加而降低。Jiachun YANG等〔10〕研究指出，當生物量高于10 g/L，厭氧氨氧化污泥的適應期更短，這可能是C4 相對C1~C3 活性更高的原因。由圖3（d）可見，不同生物量下SAA 隨鹽度的變化規(guī)律相似。當單位生物量鹽度為1.8 kg/kg 左右時，C1~C4 的SAA 降至初始值的50%；當單位生物量鹽度增至2.5 kg/kg 時，C1~C4 的SAA 僅為初始值的16.7%；隨著鹽度的繼續(xù)提升，SAA 下降速度變緩。因此本研究中，1.8 kg/kg 為厭氧氨氧化菌保持活性的單位生物量鹽度臨界值。B.KARTAL 等〔4〕指出厭氧氨氧化菌對單位生物量鹽度的最大耐受值為4 kg/kg（30 g/L）。

綜上可知，高生物量的C4 通過降低單位污泥的鹽度而增強厭氧氨氧化菌對鹽度的耐受度，因而具有更穩(wěn)定的脫氮性能，且當鹽度梯度較高（單次鹽度提升值≥5 g/L）時，基于對鹽度耐受度考慮，單位生物量鹽度不宜超過1.8 kg/kg。

3 結(jié)論

（1）低于5 g/L 的鹽度對厭氧氨氧化反應器有正向刺激作用，鹽度為9 g/L 時反應器的脫氮性能與對照組持平，鹽度高于14 g/L 后對厭氧氨氧化菌產(chǎn)生抑制。

（2）低鹽度（5 g/L）可以保證厭氧氨氧化顆粒系統(tǒng)的穩(wěn)定運行，尤其在低溫條件下，主要體現(xiàn)為低溫和鹽度沖擊條件下短程反硝化能力降低，殘留的亞硝氮迅速降低，硝酸鹽積累量增加。

（3）厭氧氨氧化顆粒污泥對鹽度沖擊的耐受度與污泥生物量有關。高生物量能夠緩解鹽度對厭氧氨氧化菌的抑制作用。