甘肅省天水市2020年豬鏈球菌II型的流行毒力基因分析

樊天喜，李健，吳錦艷，楊梅，付宏雅，李國(guó)圓，李紅梅，張明亮，李萬(wàn)宏

（1.張家川縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天水 741500；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730030；3.張家川縣張棉驛鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，甘肅 天水 741505）

豬鏈球菌?。⊿wine streptococcal diseases）是一種由豬鏈球菌（Streptococcus）引起的一種人畜共患傳染病，我國(guó)將其劃定為II類動(dòng)物疫?。?］。鏈球菌屬的細(xì)菌種類繁多，在自然界中分布廣泛，可引起人、豬、牛、馬、羊和禽等多種動(dòng)物感染。豬鏈球菌病是一種接觸性、熱性傳染病，可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥，會(huì)導(dǎo)致母豬流產(chǎn)以及仔豬的突然死亡［2］。

豬鏈球菌呈圓形或卵圓型，常呈鏈狀排列，長(zhǎng)短不一，是一種具有莢膜的革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，血清型復(fù)雜［3］。根據(jù)莢膜多糖抗原種類的多樣性，可以至少被劃分為35種不同的血清型［9］。但是，并非所有的血清型都具有致病性，大多數(shù)致病性血清型在1至9血清型。研究表明1，2，7和9是豬的致病菌［1］。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)豬鏈球菌血清型存在較大差異，河北、四川、廣東等省分離株多為2，7，9型［5-7］，東北地區(qū)多為1，2，7，9型［8］。西北地區(qū)中新疆分離株多為1，2型，甘肅、青海和寧夏等地區(qū)為2，7型［9-10］。豬鏈球菌具有多種血清型，在其他國(guó)家流行的菌株與中國(guó)存在較大的差異。在法國(guó)、意大利和西班牙等國(guó)家，感染豬鏈球菌的病豬中，血清型為II型的占70%；血清型9型的豬鏈球菌在比利時(shí)、荷蘭等國(guó)家被報(bào)道；在英國(guó)常見(jiàn)的血清型為1型、2型、14型。

豬鏈球菌的致病性和毒力因子相關(guān)，不同地區(qū)分離株毒力相差較大，主要與毒力因子的不同組合有關(guān)?；诙玖χ虏∫蜃拥牟煌?，可以將豬鏈球菌劃分為強(qiáng)毒株、弱毒株及無(wú)毒株。豬鏈球菌的毒力因子主要包括莢膜多糖（CPS）、胞外因子（EPF）、溶菌酶釋放蛋白（MRP）、溶血素（SLY）。其中，CPS可以保護(hù)細(xì)菌，抵抗吞噬。CPS的結(jié)構(gòu)成分與細(xì)菌的致病性和血清型有關(guān)，并且不同地區(qū)分離菌株的毒力基因存在較大的差異［11］。其中mrp、epf和sly被證明是強(qiáng)毒株的標(biāo)志［12］。同時(shí)，EPF和MRP的存在提高了菌株的致病力。

為了調(diào)查甘肅省天水市張家川縣的豬鏈球菌Ⅱ型及毒力基因流行情況，本研究對(duì)甘肅省天水市張家川縣10個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)疑似豬鏈球菌病例共采集血清樣本267份，進(jìn)行豬鏈球菌及豬鏈球菌II型的流行狀況檢測(cè)。同時(shí)，本研究設(shè)計(jì)并采用3對(duì)引物分別特異性擴(kuò)增溶菌酶釋放蛋白（MRP）、胞外因子（EPF）和溶血素（SLY）基因，進(jìn)行毒力因子的檢測(cè)，以期為本地區(qū)豬鏈球菌疫情預(yù)警和防控措施提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 無(wú)菌采自甘肅省天水市張家川縣的10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)豬血液樣本267份；無(wú)菌采集豬鏈球菌II型血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性豬的腦、肺臟和關(guān)節(jié)液等樣本18份。

1.1.2 試驗(yàn)材料 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）為OXOID公司產(chǎn)品，新生犢牛血清為四季青生物制品有限公司產(chǎn)品，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為南京生興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒為大連寶生物科技有限公司產(chǎn)品；菌株血清1、2、7和9型的豬鏈球菌（SS）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所豬病研究室提供2×Taqmaster Mix、DL2000DNA Marker，購(gòu) 自Ta?KaRa公司、基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生物有限公司；豬鏈球菌II型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司；引物合成由生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣本的采集 無(wú)菌采集不同年齡段豬前腔靜脈血，37℃靜置1 h后，4℃靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，收集血清樣本，存放于-80℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)將豬的腦、肺臟和關(guān)節(jié)液等樣本18份病料進(jìn)行研磨等處理后，放置4℃靜置過(guò)夜，后取上清液，存放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)與基因組DNA提取 用TSB培養(yǎng)基（含10%犢牛血清，30 mg/L NAD）37℃220 r/min分別培養(yǎng)1.2.1的菌株12 h，12 000 r/min離心5 min獲得細(xì)菌團(tuán)塊。按照1.2.2中的細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，抽提細(xì)菌的DNA，經(jīng)紫外線分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物合成 豬鏈球菌引物合成以豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶基因（gdh）為模板，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)上海生物工程有限公司合成引物，用ddH2O將引物稀釋至10 pmol/μL，保存在-20℃?zhèn)溆?。參照先前?bào)道［9］合成豬鏈球菌的3種主要毒力基因epf、mrp、sly的特異性引物，引物序列的具體信息如表1。

表1 擴(kuò)增豬鏈球菌毒力因子的引物序列Table 1 Primer sequence of amplication of streptococcus suis virulence factor

1.2.4 豬鏈球菌血清學(xué)檢測(cè) 使用豬鏈球菌ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和豬鏈球菌II型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)臨床樣品樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，2種ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的結(jié)果判定：豬鏈球菌ELISA結(jié)果判定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度；檢測(cè)范圍0.5~15 ng/L；豬鏈球菌II型ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果判定：在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔D630nm值，試驗(yàn)成立的條件是：陽(yáng)性對(duì)照孔D630nm值均應(yīng)≥0.8，且<2.0；陰性對(duì)照孔D630nm值均應(yīng)<0.3。如果樣品D630nm值≥0.35，判為陽(yáng)性，如果樣品D630nm值<0.35，判為陰性。詳細(xì)的操作步驟，參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 毒力因子PCR鑒定 將上述1.2.2中研磨的組織，取提取細(xì)菌的全基因組DNA，通過(guò)倍比稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，根據(jù)菌液濃度將細(xì)菌調(diào)整至1×109cfu/mL，然后10倍濃度梯度稀釋至1×10 cfu/mL，18份組織進(jìn)行豬II型鏈球菌epf、mrp、sly3種毒力基因的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃5 min；94℃30 s；退火溫度（sly：63℃、mrp：59℃、epf：60℃）30 s、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)，PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬鏈球菌血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

如表2陽(yáng)性率（%）顯示：267份被檢血清中豬鏈球菌抗體陽(yáng)性率達(dá)26.2%（70/267），10個(gè)豬場(chǎng)陽(yáng)性率高達(dá)60%（6/10），豬鏈球菌感染在天水市張家川縣豬場(chǎng)普遍存在，但各豬場(chǎng)感染率情況有一定差異，其中馬關(guān)鎮(zhèn)宏升養(yǎng)殖場(chǎng)和龍山鎮(zhèn)榆樹(shù)村養(yǎng)豬場(chǎng)的豬鏈球菌感染率較高，其余各村養(yǎng)殖場(chǎng)感染率較低。

表2 267份血清樣品豬鏈球菌抗體檢測(cè)結(jié)果Table.2 The antibody detection results of Streptococcussuis in 276 serum samples

2.2 豬2型鏈球菌血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

本研究中對(duì)結(jié)果2.1中豬鏈球菌血清抗體檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，進(jìn)一步進(jìn)行豬鏈球菌II型特異性血清學(xué)檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果如表3。70份豬鏈球菌陽(yáng)性血清抗體中豬II型鏈球菌抗體陽(yáng)性率為38.5%（27/70），267份被檢血清中豬II型鏈球菌抗體陽(yáng)性率10.1%（27/267），10個(gè)豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)40%（4/10），表明豬II型鏈球菌在天水市張家川縣各個(gè)村鎮(zhèn)分布范圍較廣，感染率較高，其中馬關(guān)鎮(zhèn)宏升養(yǎng)殖場(chǎng)、龍山鎮(zhèn)榆樹(shù)村和大陽(yáng)鎮(zhèn)小陽(yáng)村養(yǎng)豬場(chǎng)的豬鏈球菌II型感染率較高，其余各村養(yǎng)殖場(chǎng)感染率較低。

表3 豬II型鏈球菌抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.3 The antibody detection results of Streptococcussuis typeⅡ

2.3 毒力基因的鑒定及分布

用上述合成的3對(duì)豬鏈球菌引物對(duì)從豬的腦、肺臟和關(guān)節(jié)液（圖1）等18份樣本分離培養(yǎng)得到的18株鏈球菌，進(jìn)行mrp、epf和sly3種毒力基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR分別擴(kuò)增出626 bp（圖2-A）、885 bp（圖2-B）和1 502 bp（圖2-C）片段，與預(yù)期結(jié)果相符。然后，將上述檢測(cè)陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序分析結(jié)果表明mrp、epf和sly3種毒力基因與Genebank中序列同源性在95%~100%。18株II型豬鏈球菌的mrp、sly和epf中共有7種基因型，基因型為epf+mrp+sly+有5株，占27.7%；基因型為epf+mrp―sly+的有3株，占16.7%；epf+mrp―sly―的有3株，占16.7%；epf-mrp―sly+的有1株，占5.56%；epf―mrp+sly―的有3株，占16.7%；epf+mrp+sly―的有1株，占5.56%；epf+mrp―sly+的有2株占11.1%。上述結(jié)果表明甘肅省天水市張家川縣流行的豬鏈球菌II型以毒力相對(duì)較高的epf+mrp+sly+為主，其次是epf+mrp―sly+型、epf+mrp―sly―型和epf-mrp+sly―。

圖1 豬鏈球菌II型典型的關(guān)節(jié)炎臨床癥狀Figure 1 The representative clinical symptoms of arthritis of Streptococcussuis type II

圖2 PCR鑒定豬鏈球菌II型毒力因子結(jié)果Figure 2 PCR results of virulence factors of Streptococcussuis type II

3 討論

豬鏈球菌在我國(guó)各地都有發(fā)生，其傳播機(jī)制主要通過(guò)直接接觸或污染環(huán)境進(jìn)行水平傳播［13］。豬鏈球菌血清型II型是毒力最強(qiáng)、流行范圍最廣，最容易引起人和動(dòng)物感染的血清型［14-15］。該病不僅影響畜牧養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，也對(duì)相關(guān)從業(yè)者的健康以及公共安全造成危害隱患［3，16-17］，繼發(fā)腦膜炎、心內(nèi)膜炎、中毒性休克，甚至死亡，死亡率可達(dá)17.8%［13］。豬鏈球菌可感染黃牛、奶牛、羊、豬、馬、驢犬、貓及嚙齒類動(dòng)物。根據(jù)報(bào)道甘肅劉家峽養(yǎng)殖雜交鱘暴發(fā)疑似海豚鏈球菌病的病原情況，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA顯示海豚鏈球菌為血清Ⅱ型［18］；犬感染本菌后表現(xiàn)為突然死亡；貓通常表現(xiàn)為肺炎和濕性皮炎；馬感染該菌后主要表現(xiàn)為腦膜炎、咽喉炎、化膿性肺炎和骨髓炎；牛感染后主要表現(xiàn)為腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和腹膜炎等，給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)巨大隱患［19-20］。在我國(guó)至今已有多個(gè)省份報(bào)道豬鏈球菌的大面積流行，給我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。本次研究從甘肅省天水市張家川縣部分地區(qū)10個(gè)未免疫接種豬鏈球菌疫苗的標(biāo)準(zhǔn)化豬場(chǎng)采集267份血清以及18份豬的腦、肺臟和關(guān)節(jié)液病料。利用特異性豬鏈球菌和豬鏈球菌II型ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。267份血清樣品中鏈球菌抗體陽(yáng)性率為26.2%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)到60%。在感染豬鏈球菌的血清中檢測(cè)出豬II型鏈球菌抗體陽(yáng)性率為38.5%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為40%，表明在甘肅地區(qū)張家川縣豬II型鏈球菌血清型較為嚴(yán)重，其流行情況相較于甘肅省酒泉市地區(qū)稍好［13］。

豬鏈球菌的致病性和毒力因子相關(guān)報(bào)道，不同地區(qū)分離株毒力相差較大。mrp、epf和sly被證明是強(qiáng)毒株的標(biāo)志［12］。本研究進(jìn)一步對(duì)分離到的豬鏈球菌II型進(jìn)行mrp、sly、epf毒力基因的檢測(cè)，結(jié)果顯示該18株豬鏈球菌II型的mrp、sly和epf中共有7種基因型，基因型為epf+mrp+sly+有5株（27.7%）、基因型為epf+mrp―sly+的有3株（16.7%）、epf+mrp-sly-的有3株（16.7%）占；epf-mrp―sly+的有1株（5.56%）、epf-mrp+sly―的有3株（16.7%）、epf+mrp+sly-的有1株（5.56%）和epf+mrp―sly+的有2株（11.1%）。甘肅省天水市張家川縣流行的豬鏈球菌II型以毒力相對(duì)較高的epf+mrp+sly+為主，其次是epf+mrp―sly+型、epf+mrp―sly―型和epf-mrp+sly―，這與其他報(bào)道的豬鏈球菌血清型及毒力基因基本一致［21-26］。

在豬病診療過(guò)程中，準(zhǔn)確診斷和臨床對(duì)癥用藥是及時(shí)治療的關(guān)鍵。豬鏈球菌II型的基本治療原則，首先通過(guò)藥敏試驗(yàn)，篩選敏感抗菌藥及不合理配伍。通過(guò)藥敏試驗(yàn)研究對(duì)替加環(huán)素（100%）、美羅培南（98.98%）、頭孢噻肟（97.96%）、氨芐西林（96.94%）等對(duì)豬鏈球菌和豬鏈球菌II型高度敏感［28］。同時(shí)結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，例如淋巴結(jié)膿腫型，待膿腫成熟后，及時(shí)切開(kāi)排除膿汁，用3%雙氧水或0.1%高錳酸鉀液沖洗后涂以碘酊；出現(xiàn)發(fā)熱及跛行應(yīng)用氟尼辛葡甲胺等鎮(zhèn)痛退燒進(jìn)行肌肉注射；對(duì)敗血癥型及腦膜腦炎型，應(yīng)使用抗生素或磺胺類藥物，卡那霉素和氨芐西林鈉等聯(lián)合應(yīng)用，在獸醫(yī)臨床中都有良好治療效果。

專業(yè)化養(yǎng)豬場(chǎng)應(yīng)遵從“預(yù)防為主，治療為輔”的基本原則。切實(shí)做好隔離“傳染源”患病豬的措施；加強(qiáng)日常豬舍的消毒，切斷所有可能的“傳播途徑”；將健康的豬群?jiǎn)为?dú)飼養(yǎng)在衛(wèi)生環(huán)境良好的豬舍內(nèi)，保護(hù)所有的“易感宿主”均不能夠被患病豬或其它傳染源感染。潛伏感染豬群定期做好豬鏈球菌菌苗的預(yù)防接種，由于豬鏈球菌存在35種血清型，不同菌苗對(duì)不同血清型豬鏈球菌感染無(wú)交叉保護(hù)力或交叉保護(hù)力較小，預(yù)防用疫苗最好選擇相同血清型菌苗。豬鏈球菌病雖能夠通過(guò)接種疫苗來(lái)預(yù)防，但由于存在較多的血清型，另外還有相當(dāng)一部分并不能進(jìn)行血清分型，以及各血清型之間的交叉保護(hù)較差，使得商業(yè)化疫苗并不能對(duì)所有的菌株起作用，但是臨床上用于預(yù)防和治療的不二選擇仍然是抗生素。

豬鏈球菌株可以通過(guò)接觸污染的生肉產(chǎn)品或者患病動(dòng)物而導(dǎo)致人類感染，造成細(xì)菌性腦炎或引起中毒性休克綜合征，應(yīng)引起獸醫(yī)界以及醫(yī)學(xué)界的高度重視，加強(qiáng)豬鏈球菌株感染病豬及其相關(guān)制品的檢疫刻不容緩。感染人主要通過(guò)接觸病死豬，生豬飼養(yǎng)人員和屠宰加工人員是本病易感人群。在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中飼養(yǎng)人員要注意個(gè)人安全防護(hù)，有外傷時(shí)應(yīng)盡量避免接觸病豬，發(fā)現(xiàn)病豬要及時(shí)通知獸醫(yī)及時(shí)診療。屠宰加工人員在屠宰生豬時(shí)防止個(gè)人受傷，一旦受傷應(yīng)立即處理傷口，經(jīng)清洗消毒后使用抗菌素預(yù)防治療。