黃連素對PCOS大鼠腸道菌群以及LPS/NF?κB信號(hào)通路的影響

趙粉琴，丁曉楠，安明霞，趙艷，劉潔穎

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是內(nèi)分泌代謝異常綜合性疾?。?］，高雄激素、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為代謝異常表型，卵巢功能障礙為生殖異常表型［2］。其病因不單單僅限于下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂，腸道菌群的改變導(dǎo)致糖脂代謝紊亂也不容小覷［3］。研究表明，腸道菌群多樣性的紊亂可能通過改變短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等小分子的產(chǎn)生，活化核因子κB（nuclear fac?tor-κB，NF-κB）炎癥信號(hào)通路［4］，刺激產(chǎn)生胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂導(dǎo)致肥胖，同時(shí)這些小分子物質(zhì)經(jīng)神經(jīng)及體液系統(tǒng)上傳信號(hào)至大腦中樞（包括下丘腦及垂體），最終導(dǎo)致促性黃體生成素（LH）及雄激素（T）分泌異常增加［5］，高雄激素血癥可能是引起PCOS腸道菌群生態(tài)失調(diào)的獨(dú)立因素之一［6］，胰島素抵抗導(dǎo)致肥胖是PCOS重要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，卵泡發(fā)育異常是PCOS的核心病理特征，腸道菌群失調(diào)是誘因，通過來改善患者腸道菌群失調(diào)，可能有助于PCOS的治療［7］。目前對于PCOS疾病的治療仍以減體質(zhì)量和改善激素紊亂狀態(tài)為主，但激素的副作用以及長期用藥的局限性，限制了其在臨床應(yīng)用，因此尋求一種新的治療策略就顯得尤為重要。

研究表明黃連素可通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)［8-10］、改善胰島素抵抗［11］和機(jī)體慢性炎性從而達(dá)到降脂、降糖、減體質(zhì)量作用。黃連素是否也會(huì)通過改善PCOS腸道菌群失調(diào)，治療PCOS慢性炎性狀態(tài)而達(dá)到平衡激素分泌紊亂狀態(tài)呢？本研究旨在探討腸道菌群與PCOS代謝異常之間的相關(guān)性，以及黃連素對腸道菌群以及LPS/NF-κB信號(hào)通路干預(yù)效應(yīng)，為PCOS疾病的治療提供新思路和方法。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 雌性SPF級SD大鼠6周齡60只，體質(zhì)量為（200±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（甘）2004-0006。

1.1.2 藥品和試劑 來曲唑（2.5 mg/片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H19991001），黃連素（0.1 g/片，北京中新制藥廠，國藥準(zhǔn)字H11020962），鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023370），達(dá)英-35（炔雌醇環(huán)丙孕酮片，每片含2 mg醋酸環(huán)丙孕酮和0.035 mg炔雌醇，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140114），羧甲基纖維素鈉（CMC）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，國藥準(zhǔn)字H20181203），性激素和炎性因子試劑酶聯(lián)免疫試劑盒購自江蘇菲亞生物科技有限公司LH（MM-0624R1），F(xiàn)SH（MM-0566R1），T（MM-0624R2），E2（MM-0575R1），P（MM-0551 R1），白細(xì)胞介素1β（IL-1β，MM-0047R2），γ干擾素（IFN-γ，MM-0198R2），腫瘤壞死因子α（TNF-α，MM-0180R2），脂多糖（LPS，MM-0647R2），電子分析秤（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，京制00000246號(hào)），（欣舒測AB-103G血糖儀，批號(hào)：CZ119799）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組、造模以及藥物干預(yù) 動(dòng)物造模：用來曲唑1 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃3周，以陰道脫落細(xì)胞顯示動(dòng)物處于動(dòng)情間期為造模成功；將大鼠隨機(jī)分為對照組（K）、PCOS模型組（M組）、二甲雙胍組（E組）、黃連素組（H組）、達(dá)英-35組（D組）以及黃連素+二甲雙胍+達(dá)英-35組（3藥物合用，HED組），每組10只。二甲雙胍組：二甲雙胍劑量為0.135 g/（kg·d），70 kg人的劑量1.5 g/d；黃連素組：黃連素劑量為0.216 g/（kg·d），換算成大鼠劑量0.108 g/（kg·d），70 kg人的劑量1.2 g/d，相當(dāng)于人的劑 量 的2倍［12-13］；達(dá) 英 組：達(dá) 英-35劑 量 為0.18 mg/（kg·d），70 kg人的劑量按照醋酸環(huán)丙孕酮2 mg/d劑量用藥；黃連素+二甲雙胍+達(dá)英-35組：3藥物合用；連續(xù)灌胃28 d。

1.2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.2.1 大鼠體質(zhì)量變化 每7 d測體質(zhì)量一次，早晨添加飼料前測定。

1.2.2.2 大鼠血清性激素、空腹胰島素、血糖、LPS以及炎性因子水平的檢測 末次給藥后禁食12 h，取尾尖血測血糖。其余檢測血清指標(biāo)在處死前心臟取血1.5 mL，在4℃以3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清移入EP管。采用ELISA 96孔檢測法檢測血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）、雌激素（E2）和孕酮（P）；炎性因子和脂多糖（LPS）按試劑盒操作步驟進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長進(jìn)行吸光度（OD）檢測。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）。HOMA-IR公式為：

HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mIU/L）/22.5

1.2.2.3 16s rDNA擴(kuò)增子焦磷酸測序腸道菌群分析 每個(gè)糞便樣品的冷凍試樣（約5 g），采用SDS裂解液凍融法進(jìn)行DNA提取，基因組DNA通過PowerMax提取試劑盒（MoBio Laboratories，Carls?bad，CA，USA）提取，采用Barcode的16s rRNA基因V4區(qū)引物，PCR產(chǎn)物用AMPure XP Beads（Beckman Coulter，Indianapolis，IN）純化，并且使用PicoGreen dsDNA，Assay Kit（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）進(jìn)行量化。定量后使用Illlumina Nova?seq 6000 pair-end 2×150 bp平臺(tái)測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用One-Way ANOAY方差分析，組間比較采用LSD法和Dunnett法分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體質(zhì)量變化分析

如圖1，各組大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間呈上漲趨勢，與對照組比較，PCOS模型大鼠體質(zhì)量每周時(shí)間點(diǎn)都增加（P<0.01）；與模型組比較，給藥后，隨著時(shí)間延長，大鼠體質(zhì)量逐漸下降，黃連素組第7天，其他藥物的第28天，大鼠體質(zhì)量下降最顯著（P<0.05）。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化分析Figure 1 Changes of weight in rats

2.2 大鼠血清性激素水平變化分析

由圖2可知，相對于對照組，PCOS模型組大鼠有較高的LH、T水平以及LH/FSH比值（P<0.01）；藥物能降低模型組大鼠血清LH、T水平和LH/FSH比值，尤以黃連素組、三藥連用組對T水平和LH/FSH影響最顯著（P<0.05），而對血清FSH、E2和P水平影響不明顯。

圖2 各組大鼠激素水平比較Figure 2 Changes of FSH，LH、E2、T and Pin rats

2.3 大鼠血清胰島素含量、胰島素指數(shù)（HOMAIR）、脂多糖（LPS）、IL-1β、INF-γ和TNF-α變化分析

與對照組比較，PCOS組大鼠血清胰島素、脂多糖、IL-1β、INF-γ和TNF-α含量和HOMA-IR明顯增加（P<0.01，0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35組、二甲雙胍組和黃連素組大鼠血清HOMA-IR、脂多糖、IL-1β、INF-γ和TNF-α含量降低，尤以血清IL-1β黃連素組和三藥連用組降低較為顯著（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清胰島素含量、HOMA-IR、LPS、IL-1β、INF-γ和TNF-α變化Table 1 Changes of LPS、IL-1β、INF-γand TNF-αin rats（n=10）

2.4 腸道菌群的變化

2.4.1 OUT聚類分析 通過韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，屬水平上在2 221個(gè)屬中找出對照組92個(gè)、模型組58個(gè)、達(dá)英組155個(gè)、二甲雙胍組112個(gè)、黃連素組157個(gè)、三藥連用組249個(gè)（圖3-A）。Ternary三元相圖優(yōu)勢物種分析，模型組優(yōu)勢物種為普氏菌屬（Prevotella），黃連素組優(yōu)勢物種為擬桿菌屬（Bacteroides），三藥連用優(yōu)勢物種為蘇黎世桿菌科（Turicibacter）（圖3-B）。組間豐度曲線，折線長短與OUT菌落豐富度，折線平緩程度與群落組成的均勻度，折線陡峭與群落豐度差異呈正相關(guān)。說明模型組OUT數(shù)量少，豐度差異小，均勻度低，藥物組OUT數(shù)量增加，豐度差異大，均勻度高（圖4）。菌群alpha分析結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組菌群多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和豐富度Chao指數(shù)下降（P<0.05），但是各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，圖5）。NMDS圖對不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行Beta多樣性分析，同類樣本菌群聚為一起，腸道菌群結(jié)構(gòu)組成在PC2和PC1維度上均存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.017<0.05）（圖6）。PC1總變異率為24.95%，PC2總變異率為12.02%，說明模型組和藥物組菌群存在差異。

圖3 OUT腸道菌群分類Figure 3 OUT intestinal flora classification

圖4 樣本間和組間的豐度曲線圖Figure 4 Abundance curves between samples and groups

圖5 OUT腸道菌群Alpha多樣性分析Figure 5 OUT Alpha diversity analysis of intestinal flora

圖6 各組樣本腸道菌群PCoAFigure 6 Intestinal microflora PCoA of each group

2.4.2 腸道的微生物菌群分類分析 如表2，圖7所示，與對照組比較，PCOS組門、綱、目、科、屬水平群落數(shù)量都顯著減少（P<0.05）；與模型組比較，藥物治療后不同分類水平群落組成數(shù)量均增加，尤其二甲雙胍和黃連素在屬和種水平菌數(shù)量增加（P<0.05）。如表3，圖8所示，在門（phylunm）水平上，相對于對照組，PCOS組擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門相對豐度以及擬桿菌門/厚壁菌門比值下降（P<0.05），而厚壁菌門相對豐度上升（P<0.05）；二甲雙胍提高了模型組大鼠擬桿菌門相對豐度（P<0.05），達(dá)英-35減低模型組大鼠厚壁菌門相對豐度，提高擬桿菌門/厚壁菌門比值（P<0.05），黃連素提高模型組大鼠疣微菌門相對豐度（P<0.05）。

圖7 腸道菌群不同分類水平群落組成數(shù)量Figure 7 Composition of intestinal flora at different classification levels

圖8 門水平各組樣本腸道菌群的相對豐度Figure 8 Relative abundance of intestinal microflora at phylum leve

表2 各組菌群門、綱、目、科、屬、種類群落組成量比較（n=10）Table 2 Comparison of community composition of phyla，class，order，family，genus and species in each group（n=10）

表3 物種門水平上相對豐度比較（n=10）Table 3 Comparison of relative abundance at phylum level（n=10） %

2.4.3 腸道菌群屬水平分析 如表4和圖9所示，屬分類相對豐度占比，結(jié)合圖10屬聚類熱圖，與對照組比較，PCOS模型組擬桿菌屬、糞球菌屬、薩特氏菌屬、乳酸菌屬相對豐度明顯降低于正常組（P<0.01，P<0.05），而普氏菌屬（P<0.01）、顫螺菌屬和厭氧菌屬相對豐度增加；與模型組比較，達(dá)英-35、二甲雙胍和黃連素組擬桿菌屬和薩特氏菌屬相對豐度明顯增加（P<0.05），尤其是黃連素對薩特氏菌屬相對豐度增加較為顯著（P<0.01）。聚類熱圖分析雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）對照組占比為（0.033%），相對豐度明顯高于PCOS模型組（0.000 3%），達(dá) 英 組（0.014%），二 甲 雙 胍 組（0.001 8%），黃連素組（0.000 53%）相對豐度高于模型組，尤其是三藥組（0.097%），相對豐度明顯高于模型組。

圖9 屬水平各組樣本腸道菌群的相對豐度Figure 9 Relative abundance of intestinal microflora at genus level

圖10 腸道菌群屬水平的聚類熱圖Figure 10 10 Cluster heat map of intestinal flora at genus level

表4 物種屬水平上相對豐度比較（n=10）Table 4 Relative abundance of species at genus leve（ln=10） %

2.4.4 各組間菌群差異分析 本研究利用LEfSe方法在各組之間尋找差異菌種（圖11）和進(jìn)化分支圖（圖12），結(jié)果顯示：有19個(gè)菌種相對豐度在兩組間存在差異（LDA>2），其中達(dá)英組產(chǎn)氣桿菌（Aero?coccaceae）和凸腹真桿菌（Eubacterium）相對豐度高于對照組，黃連素組擬桿菌（Bacteroides）相對豐度高于對照組，三藥連用雙歧桿菌科（Bifldobacteria?ceae）、雙歧桿菌（Bifldobacteriacles）、雙歧桿菌（Bifl?dobacterium）、放線菌（Actinobacteria）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、巨球菌（Megasphaera）、棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）相對豐度高于對照組。達(dá)英組代表物種為產(chǎn)氣桿菌（Aerococcaceae），黃連素組代表物種為擬桿菌（Bacteroides），三藥連用代表物種為雙歧桿菌（Bifldobacteriaceae）、雙歧桿菌（Bi?fldobacteriacles）、放線桿菌（Actinobacteria）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。

圖11 各組樣本腸道菌群LDA值分布柱狀Figure 11 Columnar distribution of LDA values of intestinal flora

圖12 各組樣本腸道菌群特有物種分析Figure 12 Analysis of intestinal microflora unique

2.4.5 基于BugBase的5類表型分類比較 如表5所示，與正常組比較，PCOS模型組需氧菌（Aerobic）和革蘭氏陽性（Gram Positive）下降（P<0.05）；厭氧菌（Anaerobic）、革蘭氏陰性（Gram Negative）和潛在的致病性（Potentially Pathogenic）增加（P<0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組、黃連素組和HED組革蘭氏陰性（Gram Negative）和潛在的致病性（Potentially Pathogenic）下降（P<0.05），革蘭氏陽性（Gram Positive）增加（P<0.05），尤其是三藥連用效果最佳。

表5 基于BugBase分類比較（n=10）Table 5 Classification comparison based on BugBase（n=10） %

3 討論

已經(jīng)有研究表明，腸道菌群在PCOS發(fā)病中有著重要作用。多囊卵巢綜合征（PCOS）表現(xiàn)出月經(jīng)紊亂、卵泡發(fā)育障礙、高雄激素肥胖［14］、胰島素抵抗（IR）（占50%~70%）［15-16］、心血管疾病［17］以及糖脂代謝等問題［18］都與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，而且肥胖和胰島素抵抗加重了高雄激素血癥的癥狀，形成了促進(jìn)多囊卵巢綜合征發(fā)展的惡性循環(huán)［19］。

本研究結(jié)果顯示PCOS模型大鼠體質(zhì)量升高，血清睪酮（T）、黃體生成素（LH）以及LH/FSH明顯升高，腸道菌群菌屬減少，群落組成的豐富度和均勻度降低，導(dǎo)致肥胖［20-21］的“胖菌”厚壁菌門及放線菌門比例增高，“瘦菌”的擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門相對豐度下降。有益菌擬桿菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和薩特氏菌屬相對豐度減低，而致炎菌普氏菌屬和瘤胃球菌屬、顫螺菌屬和厭氧菌屬相對豐度增加，與Lindheim等的［22］研究一結(jié)果致。PCOS腸道菌群失調(diào)，致病菌大量繁殖，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素脂多糖（LPS），使腸道黏膜屏障受損，引發(fā)炎癥性肥胖以及胰島素抵抗，同時(shí)過多脂多糖入血，激活NF-κB信號(hào)，釋放炎性因子，血清IL-1β、INF-γ和TNF-α水平明顯增加，干擾胰島素信號(hào)表達(dá)，導(dǎo)致過多胰島素分泌即IR，IR反過來加重肥胖以及PCOS的發(fā)生［23-24］。

給予藥物干預(yù)后，模型大鼠體質(zhì)量下降，睪酮水平、LH水平下降，胰島素分泌減少，LPS、IL-1β、INF-γ和TNF-α水平明顯減少，尤以黃連素作用最顯著，黃連素可以下調(diào)NF-κB活性［25］，抑制炎癥因子（IL-1β、INF-γ）的分泌，同時(shí)也是胰島素增敏劑［26］，通過TNF-α抗體中和TNF-α，可以改善肥胖大鼠的胰島素抵抗。同時(shí)腸道菌群的豐富度和均勻度增加，在門水平提高擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門相對豐度，在屬水平擬桿菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和薩特氏菌屬等有益菌屬相對豐度提高，而普氏菌屬、瘤胃球菌屬、顫螺菌屬和厭氧菌屬等致病菌屬相對豐度下降。這與黃連素［27］增加了腸道擬桿菌相對豐度，顯著抑制糞腸球菌的生長，增加有益菌乳酸菌和雙歧桿菌的生長［28-29］有關(guān)。薩特氏菌屬、擬桿菌屬、普氏菌屬、乳酸菌屬和雙歧桿菌屬除了能抑制有害微生物生長，還可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SC?FAs）［30］。短鏈脂肪酸作用有抗炎、保護(hù)腸黏膜功能、調(diào)節(jié)胰島素和胰高血糖素分泌，調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)［31］。而且黃連素可以大幅度增加疣微菌門的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）相對豐度，研究發(fā)現(xiàn)該菌與肥胖呈負(fù)相關(guān)［32］，增加該菌豐度可改善與肥胖相關(guān)的代謝異常，改善伴有肥胖、胰島素抵抗及降低血漿脂多糖的作用［33］，這可能是黃連素治療肥胖型PCOS的主要作用機(jī)制。

綜合以上研究，二甲雙胍和黃連素明顯改善胰島素抵抗和減輕體質(zhì)量，達(dá)英-35可以改善性激素分泌紊亂狀態(tài)。黃連素和三藥聯(lián)合在改善激素和炎性因子分泌紊亂及調(diào)整腸道菌群失調(diào)等方面作用明顯。但是，黃連素改善PCOS大鼠腸道菌群可能只是一方面作用，是否可以作為長期管理PCOS的藥物，還有待以后進(jìn)一步研究。