K+、Ca2+對釀酒酵母的蔗糖乙醇發(fā)酵及理化特性的影響

袁瑞祥，伍時華，龍秀鋒

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

0 引言

乙醇以其清潔可再生等優(yōu)勢，為國家醫(yī)療衛(wèi)生、燃油等方面做出多重貢獻(xiàn)［1］，但其生產(chǎn)規(guī)模受原料所限。甘蔗糖蜜是制糖業(yè)的副產(chǎn)品，含有約50%的可發(fā)酵糖、蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，具有產(chǎn)量大、價格低廉等特點［2］。但甘蔗糖蜜中的金屬離子、膠體、色素、糠醛等物質(zhì)的存在，會影響酵母細(xì)胞的生長代謝［3］。糖蜜中的金屬離子一般來自于甘蔗施肥、制糖過程及石灰澄清脫色過程［4］，金屬離子一方面可以與細(xì)胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)結(jié)合，形成更穩(wěn)定的惰性酶復(fù)合物，直接干擾許多酶的活性［5］；另一方面可以使酵母細(xì)胞生成過量活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）引起細(xì)胞氧化損傷、DNA損傷、破壞細(xì)胞壁的完整性，影響細(xì)胞的生長代謝［6］。低外部K+濃度可以彌補(bǔ)脅迫下細(xì)胞內(nèi)離子的損失，而較高的K+濃度會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)對酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用［7］。據(jù)報道，K+、Ca2+可以通過影響蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性對酵母表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用［8］。過量金屬離子會增大發(fā)酵環(huán)境的滲透壓，抑制酵母細(xì)胞生長代謝，使得糖蜜發(fā)酵的乙醇濃度偏低，不利于糖蜜乙醇產(chǎn)業(yè)的長久可持續(xù)發(fā)展［9］。

本文通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）對甘蔗糖蜜中金屬離子的含量進(jìn)行測定，通過外源添加含量較高的金屬離子探究其對酵母細(xì)胞生長的影響。以對酵母生長抑制較強(qiáng)的K+、Ca2+為研究對象，探究其對蔗糖乙醇發(fā)酵過程中細(xì)胞生長、糖代謝和乙醇生成的影響；進(jìn)一步通過掃描電鏡（Scanning electron microscopy，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）分析高濃度K+、Ca2+脅迫條件下酵母細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分，測定胞內(nèi)海藻糖含量變化，探究K+、Ca2+對釀酒酵母細(xì)胞理化特性的影響，為實現(xiàn)高濃度甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵和選育耐受性菌株提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本論文所采用菌種為耐高糖的釀酒酵母GJ2008（Saccharomyces cerevisiaeGJ2008），由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

KCl、CaCl2、MgCl2·6H2O、FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、NaCl、硫酸、三氯乙酸（AR），西隴科學(xué)股份有限公司；酵母粉、蛋白胨（BR），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙腈，成都市科隆化學(xué)品有限公司；D-海藻糖、蒽酮，北京索萊寶科技有限公司；甘油含量測定試劑盒，泉州市睿信生物科技有限公司；葡萄糖（BR）、戊二醛（AR），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蔗糖（市售）。

1.2 儀器與設(shè)備

賽里安456GC氣相色譜儀，荷蘭賽里安儀器公司；HITACHI高效液相色譜儀，日本株式會社日立制作所；Agilent 7700電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司；Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司；Phenom飛納臺式掃描電鏡，上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；FTIR傅里葉變換紅外光譜儀，上海興和儀器有限公司；UV-8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基及種子液的制備

一（二）級種子培養(yǎng)基：葡萄糖20（50）g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖250 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

從斜面試管中挑取1環(huán)釀酒酵母GJ2008接種至一級種子培養(yǎng)基（250 mL裝液量50 mL），30℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h；將10倍濃縮的菌懸液以1%（v/v）接入二級種子培養(yǎng)基（500 mL裝液量200 mL）中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，離心棄上清液，加無菌水稀釋為10倍濃縮種子懸液。

1.3.2 甘蔗糖蜜中總糖及金屬離子測定

將甘蔗糖蜜與超純水1：1稀釋攪拌均勻，緩慢沿杯壁滴入濃硫酸調(diào)pH至3，90℃水浴加熱酸化30 min，靜置冷卻后，用新配置的15%石灰乳調(diào)pH至7.0，8000 r/min離心20 min除去沉淀［10］。采用高效液相色譜儀測定上清液中總糖含量，檢測分析條件參照曾令杰等［11］和GB/T 9735-2008國家標(biāo)準(zhǔn)［12］，通過ICP-MS測定金屬離子種類及含量。

1.3.3 外源添加金屬離子對酵母細(xì)胞生長的影響

將10倍濃縮菌懸液接種1%（v/v）至蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基（500 mL裝液量200 mL），根據(jù)1.3.2所測金屬離子種類及含量，分別添加至培養(yǎng)基中作為處理組，以未添加的菌液作為對照組，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，定時取樣，測定酵母菌懸液在560 nm下的吸光度值，以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.4 K+、Ca2+對酵母的蔗糖乙醇發(fā)酵過程的影響

根據(jù)所測總糖含量及理論產(chǎn)15%（v/v）乙醇而配制250 g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)1.3.3試驗結(jié)果，分別添加15.64 g/L K+、8.17 g/L Ca2+于250 g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中作為處理組，以未添加K+、Ca2+的250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵為對照組；用透氣膜加牛皮紙密封三角瓶口后（微通氧發(fā)酵環(huán)境）于30℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)36 h。定時取樣離心，沉淀用于測定酵母菌懸液在560 nm下的吸光度值，繪制生長曲線；上清液采用高效液相色譜儀用于測定蔗糖、葡萄糖、果糖含量，檢測分析條件參照曾令杰等方法［11］；采用氣相色譜儀測定發(fā)酵過程乙醇的生成情況，檢測分析條件參照吳佳敏等［13］方法。

1.3.5 K+、Ca2+對酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

按照1.3.4的培養(yǎng)方法，取9 h的發(fā)酵液3 mL，5000 r/min離心10 min，棄上清；加入2.5%戊二醛1 mL，4℃固定過夜，離心收集菌體；用PBS緩沖液清洗3次，30%～100%的乙醇梯度脫水處理，5000 r/min離心10 min收集菌體，真空冷凍干燥后噴金，用掃描電子顯微鏡觀察酵母菌的形態(tài)變化。

1.3.6 K+、Ca2+對酵母細(xì)胞壁分子結(jié)構(gòu)的影響

按照1.3.4的培養(yǎng)方法，取9 h的發(fā)酵液3 mL，5000 r/min離心10 min，棄上清；用PBS緩沖液清洗3次，真空冷凍干燥后，將干燥的酵母菌體與溴化鉀研磨均勻壓片，用FTIR儀對干燥酵母細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.3.7 K+、Ca2+對酵母胞內(nèi)海藻糖含量的影響

參考安佳星等［14］的海藻糖測定方法，將活化后的酵母細(xì)胞于250 g/L蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h后，分別添加15.64 g/L K+、8.17 g/L Ca2+作為處理組繼續(xù)培養(yǎng)；分別取兩份處理0 h、3 h、6 h培養(yǎng)液各4 mL，12000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀用水洗滌3次，其中一份烘干稱重，另一份加入4 mL 0.5 mol/L三氯乙酸冰浴1 h，離心后取1 mL上清液于冷水浴的比色管中，加入5 mL硫酸蒽酮試劑，混勻后沸水浴10 min，再冰水浴中冷卻后測定620 nm下的吸光度值。繪制海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=10.015x+0.0221（R2=0.9994）。

1.4 計算公式

（1）殘總糖濃度（g/L）=殘果糖（g/L）+殘葡萄糖（g/L）+殘蔗糖（g/L）×1.05；

（2）糖類變化速率［g/（L·h）］=糖類減少量（g/L）/取樣間隔時間（h）；

（3）乙醇生成速率［g/（L·h）］=乙醇生成量（g/L）/取樣間隔時間（h）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

論文數(shù)據(jù)均為3次平行實驗的平均值。采用軟件SPSS 19.0和Origin Pro 9.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗糖蜜中總糖、金屬離子含量測定及其對釀酒酵母細(xì)胞生長的影響

2.1.1 甘蔗糖蜜中總糖及金屬離子含量測定

甘蔗糖蜜中的金屬離子一般來自甘蔗種植施肥、制糖和糖蜜預(yù)處理過程［9］，本研究采用熱酸法對甘蔗糖蜜進(jìn)行預(yù)處理，測得預(yù)處理后的糖蜜樣液總糖含量為273.3±4.09 g/L，共檢測到58種金屬離子，所測含量較高的金屬離子種類及含量結(jié)果如表1所示。大多數(shù)金屬離子在甘蔗糖蜜中含量較低，含量較高的金屬離子種類分別為K+（15.64 g/L）、Ca2+（8.17 g/L）、Mg2+（2.76 g/L）。周嫄［10］研究了不同預(yù)處理方式對糖蜜中金屬離子含量的影響，通過熱酸法預(yù)處理測得糖蜜中K+含量為16.46 g/L。王進(jìn)［15］的研究中，廣西金光糖廠甘蔗糖蜜中K+含量為16.68 g/L、Mg2+含量為2.54 g/L，與本研究結(jié)果相似。而楊麗峰［16］所測糖蜜中K+（6.62 g/L）、Ca2+（1.48 g/L）離子含量與本論文所測結(jié)果有較大的差別，這可能與甘蔗產(chǎn)地、制糖及預(yù)處理方式的不同有關(guān)。

表1 甘蔗糖蜜中金屬離子種類及含量

2.1.2 甘蔗糖蜜中金屬離子對釀酒酵母細(xì)胞生長的影響

適量金屬離子可通過降低質(zhì)膜通透性保護(hù)線粒體功能，對細(xì)胞生長、活力和乙醇代謝有顯著影響［17］，但過量金屬離子會對酵母產(chǎn)生毒害作用［18］。根據(jù)甘蔗糖蜜中金屬離子含量測定結(jié)果，外源添加含量較高的前6種金屬離子進(jìn)行250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵試驗，定時取樣測定菌液OD值繪制細(xì)胞生長曲線，并結(jié)合細(xì)胞生長速率，研究其對釀酒酵母GJ2008生長的影響，結(jié)果如圖1所示。

綜合分析圖1的細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞生長速率可知，與未添加金屬離子的對照組比較，分別添加K+、Ca2+試驗組的細(xì)胞生長受到較強(qiáng)抑制，相比之下，添加Ca2+試驗組的細(xì)胞生長受到的抑制比添加K+試驗組的強(qiáng)，表現(xiàn)在（1）細(xì)胞生長減慢，例如發(fā)酵至12 h的菌體OD值分別比對照組減少16.3%、24.21%，0～12 h的細(xì)胞生長速率分別比對照組降低29.72%、42.7%；（2）達(dá)到生長穩(wěn)定期的快速生長時間延長6 h；（3）發(fā)酵36 h的細(xì)胞生物量相對較低，比對照組分別減少9.83%、18.45%。據(jù)此，本文進(jìn)一步研究K+、Ca2+對釀酒酵母的蔗糖乙醇發(fā)酵和理化特性的影響。

圖1 添加不同金屬離子的250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母GJ2008細(xì)胞生長曲線及生長速率圖

2.2 K+、C a2+對釀酒酵母蔗糖乙醇發(fā)酵的影響

2.2.1 K+、Ca2+對蔗糖乙醇發(fā)酵的糖代謝影響

蔗糖乙醇發(fā)酵過程中，釀酒酵母通過蔗糖水解酶將胞外蔗糖水解為葡萄糖和果糖，利用其進(jìn)行生長代謝，殘葡萄糖和殘果糖的含量由蔗糖水解生成量與同期消耗量所決定［19］。結(jié)果如圖2所示。

圖2 添加K+、Ca2+的250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中殘?zhí)乔€及蔗糖水解和果糖、葡萄糖消耗速率圖

由圖2A的殘蔗糖曲線及水解速率可知，對照組在發(fā)酵6～12 h蔗糖水解速率最快（26.88 g/（L·h）），蔗糖大量水解（占比60.88%）。與對照組相比，分別添加K+、Ca2+試驗組的蔗糖水解緩慢、水解時間延長，發(fā)酵6～12 h的蔗糖水解量分別降低48.49%、45.67%，最大蔗糖水解速率分別比對照組降低了38.06%、45.72%，且分別在滯后12 h、18 h兩處理組蔗糖才幾乎水解完全（0.059 g/L、1.61 g/L）。

由圖2B的殘果糖曲線及消耗速率可知，對照組在發(fā)酵6～12 h果糖消耗速率達(dá)到最大（9.35 g/（L·h）），果糖消耗量最多（56.08 g/L），發(fā)酵12 h的殘果糖濃度最高（56.4 g/L），發(fā)酵42 h仍有剩余（30.1 g/L）。與對照組相比，分別添加K+、Ca2+試驗組的殘果糖消耗緩慢，6～12 h的果糖消耗量分別降低56.58%、58.42%，最大果糖消耗速率明顯降低（35.29%、56.04%），殘果糖濃度分別滯后12 h、18 h達(dá)到最大值（56.2 g/L、69.6 g/L），且42 h的殘果糖濃度偏高，分別是對照組的1.68倍、1.85倍。

由圖2C的殘葡萄糖曲線及消耗速率可知，對照組在發(fā)酵6～12 h葡萄糖消耗速率達(dá)到最大12.58 g/（L·h），葡萄糖消耗量最多（75.48 g/L），發(fā)酵12 h殘葡萄糖濃度最高（28.6 g/L），42 h已消耗完全。與對照組比較，分別添加K+、Ca2+試驗組的殘葡萄糖消耗緩慢，發(fā)酵6~12 h的葡萄糖消耗量分別降低56.58%、58.42%，最大葡萄糖消耗速率分別比對照組降低了42.37%、51.99%，殘葡萄糖濃度均滯后6 h達(dá)到最大值（31.35 g/L、41.75 g/L），且發(fā)酵42 h的殘葡萄糖濃度偏高（14.2 g/L、19.55 g/L）。

2.2.2 K+、Ca2+對釀酒酵母的蔗糖乙醇發(fā)酵過程總糖消耗與乙醇生成的影響

在蔗糖乙醇發(fā)酵過程中，蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖、果糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸［19］，在丙酮酸脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛最終生成乙醇。本研究通過定時取樣測定乙醇濃度和計算總糖含量，研究K+、Ca2+對酵母細(xì)胞總糖消耗、乙醇生成的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 添加K+、Ca2+的250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過程中殘總糖、乙醇生成曲線及殘總糖消耗、乙醇生成速率圖

總糖消耗的實質(zhì)是蔗糖水解產(chǎn)生的葡萄糖和果糖消耗。由圖3可知，對照組在發(fā)酵6～12 h總糖消耗及乙醇生成速率均達(dá)到最大值（21.93 g/（L·h）、7.65 g/（L·h）），發(fā)酵6～24 h，酵母細(xì)胞生長活力旺盛，總糖大量消耗（占比70.37%），同期乙醇快速積累（占比81.09%），發(fā)酵24 h后隨著乙醇濃度升高抑制細(xì)胞活性、營養(yǎng)物質(zhì)減少等因素，殘總糖濃度與乙醇生成量趨于平穩(wěn)。與對照組比較，添加K+、Ca2+試驗組的總糖消耗、乙醇生成緩慢，最大總糖消耗速率分別降低39.31%、54.76%，最大乙醇生成速率分別降低37.91%、50.07%，發(fā)酵6～24 h的總糖消耗量分別降低11.9%、27.85%，同期乙醇生成量分別減少20.64%、37.87%；發(fā)酵42 h的殘總糖濃度高、乙醇生成量低，殘總糖濃度分別是對照組的2.16倍、2.79倍，乙醇終濃度與對照組相比分別減少18.03%、23.81%。表明高濃度K+、Ca2+存在時，酵母細(xì)胞的糖代謝及發(fā)酵產(chǎn)乙醇性能受到較強(qiáng)抑制，且Ca2+對酵母的綜合抑制效果較K+更明顯。

2.3 K+、C a2+對酵母細(xì)胞理化特性的影響

2.3.1 K+、Ca2+對酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

為探究K+、Ca2+對酵母細(xì)胞形態(tài)的影響，本研究采用掃描電子顯微鏡觀察K+、Ca2+脅迫條件下釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)的變化情況，結(jié)果如圖4所示。

圖4 K+與Ca2+處理對釀酒酵母GJ2008形態(tài)變化的影響（*10000）

正常發(fā)酵的酵母細(xì)胞（圖4A）形態(tài)完整、分散均勻，出芽率高、飽滿圓潤、不粘連，體積較大且無褶皺破損；而K+、Ca2+處理組中的酵母細(xì)胞（圖4B、4C）表面粗糙、存在較多絮狀物，體積偏小、胞間粘結(jié)成團(tuán)塊狀，部分表面出現(xiàn)凹陷、空洞、褶皺變形；由SEM圖可知，發(fā)酵體系中存在高濃度的金屬離子K+、Ca2+時，釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)受到破壞，表面存在絮狀物且出現(xiàn)胞間粘連、堆積現(xiàn)象，使得酵母細(xì)胞物質(zhì)運輸及信息傳遞功能受阻，影響細(xì)胞正常生長與代謝，導(dǎo)致酵母細(xì)胞發(fā)酵能力下降，甚至導(dǎo)致細(xì)胞損傷與死亡［20］。

2.3.2 FTIR分析K+、Ca2+對酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞壁外層含豐富甘露糖蛋白，內(nèi)層主要物質(zhì)為β-葡聚糖與少量幾丁質(zhì)，這些物質(zhì)富含大量活性基團(tuán)，對細(xì)胞的形態(tài)、活力具有嚴(yán)格的控制［21］。本研究通過紅外光譜分析考察了K+、Ca2+處理條件下釀酒酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，如圖5所示。

根據(jù)前人研究結(jié)果，3319.3 cm-1處有一個很強(qiáng)的特征吸收峰，是幾丁質(zhì)中的O-H與仲胺基N-H的伸縮振動引起的［22］；1652 cm-1、1542.9 cm-1、1242.1 cm-1附近的吸收峰一般為酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶，一般由-COOH中C-O的伸縮振動、N-H的彎曲振動和C-N的伸縮振動引起，反映蛋白質(zhì)分子的狀態(tài)［11，22］；1078.1 cm-1附近的吸收峰一般為細(xì)胞壁中碳水化合物或多糖的C-O伸縮振動峰［14，22］，反映酵母細(xì)胞壁中碳水化合物和多糖環(huán)鍵的狀態(tài)；在指紋區(qū)894.9 cm-1吸收峰可能對應(yīng)于細(xì)胞壁多糖的β糖中C1-H沿鍵軸方向氫的彎曲振動，反映酵母細(xì)胞表面的多糖羥基骨架的變化情況［22］。

由圖5可以看出，K+、Ca2+處理組在3319.3 cm-1的透過率明顯高于對照組，推測酵母細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)在高濃度K+、Ca2+條件下發(fā)生變化。蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜的主要成分之一，處理組中的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶特征吸收峰值顯著減弱，表明蛋白質(zhì)的特征官能團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能是脅迫條件下的細(xì)胞膜發(fā)生破損。在1078.1 cm-1、894.9 cm-1附近的透過率明顯增強(qiáng)，表明K+、Ca2+改變了釀酒酵母的多糖羥基骨架，導(dǎo)致酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。綜合上述結(jié)果可知，K+、Ca2+能通過改變酵母細(xì)胞的幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖等結(jié)構(gòu)對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，從而影響細(xì)胞的正常生長及代謝。

圖5 K+、Ca2+處理條件下釀酒酵母細(xì)胞紅外光譜圖

2.3.3 甘蔗糖蜜中K+、Ca2+對胞內(nèi)海藻糖含量的影響

海藻糖由兩分子葡萄糖經(jīng)糖苷鍵連接而成，是胞內(nèi)應(yīng)激代謝產(chǎn)物之一，可通過抑制酵母胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，防止細(xì)胞死亡，具有穩(wěn)定脂膜、蛋白質(zhì)和生物膜系統(tǒng)的特性［23-24］。本研究考察了K+、Ca2+處理條件下酵母細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖含量的變化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 K+、Ca2+脅迫下對釀酒酵母GJ2008胞內(nèi)海藻糖含量的影響

由圖6可知，空白對照組與處理組的胞內(nèi)海藻糖含量在0 h時沒有顯著差異（P＜0.05），處理3 h的各組酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖含量緩慢增加，隨著處理時間的延長，胞內(nèi)海藻糖含量均逐漸升高趨勢；6 h時，經(jīng)K+、Ca2+處理后的胞內(nèi)海藻糖含量分別是對照組的1.66倍、1.76倍。出現(xiàn)此現(xiàn)象的可能原因是K+、Ca2+處理的酵母細(xì)胞面臨高濃度金屬離子的脅迫作用，細(xì)胞通過快速合成海藻糖以穩(wěn)定生物膜系統(tǒng)，導(dǎo)致含量明顯高于對照組。此外，隨著發(fā)酵的進(jìn)行乙醇不斷積累，空白對照組中高濃度乙醇誘導(dǎo)海藻糖合成酶基因（TPS1、TPS2、TLS1）和海藻糖酶基因（NTH1、NTH2、ATH1）的表達(dá)，促使酵母細(xì)胞海藻糖含量增加以抵御乙醇脅迫［25］。

3 討論

甘蔗糖蜜中含有約50%的可發(fā)酵糖，可用于生物乙醇的發(fā)酵，因含大量金屬離子、膠體、色素等物質(zhì)，影響酵母的生長代謝導(dǎo)致發(fā)酵醪液中酒精含量偏低。本文對糖蜜樣品進(jìn)行熱酸預(yù)處理后，測得總糖含量為273.3±4.09 g/L，檢測到含量較多的金屬離子為K+（15.64 g/L）、Ca2+（8.17 g/L），與周嫄［10］所測預(yù)處理糖蜜中K+（16.46 g/L）、王進(jìn)［15］所測甘蔗糖蜜中K+（16.68 g/L）、Mg2+（2.54 g/L）含量相似。本文依據(jù)所測甘蔗糖蜜預(yù)處理后含量較高的前六種金屬離子進(jìn)行發(fā)酵實驗，通過對細(xì)胞生物量的測定，與對照組相比，K+、Ca2+處理組均出現(xiàn)細(xì)胞生物量偏低，可能是由于處理組酵母生長環(huán)境滲透壓增大，引起胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，降低酵母細(xì)胞活力［26］。K+、Ca2+處理組中蔗糖水解速率慢、葡萄糖/果糖消耗速率低，殘?zhí)橇科?、乙醇生成量偏低的原因可能是由于?xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，蔗糖水解酶活性受到抑制而影響蔗糖的正常水解速率［27］。此外，由殘果糖、殘葡萄糖曲線可知，對照組和處理組中的殘果糖含量均明顯高于殘葡萄糖含量，產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是酵母細(xì)胞己糖跨膜轉(zhuǎn)運對葡萄糖和果糖的親和力不同［19］。

通過SEM圖像可以直觀的看到處理前后釀酒酵母細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的變化，經(jīng)K+、Ca2+處理后的細(xì)胞表面出現(xiàn)絮狀物、部分細(xì)胞壁塌陷，且細(xì)胞有堆積現(xiàn)象，這與姜敏［20］通過掃描電鏡對比啤酒酵母和分別吸附Cd2+、Zn2+的啤酒酵母表面形貌變化結(jié)果大體一致。結(jié)合傅里葉紅外光譜可以看出，經(jīng)K+、Ca2+處理后的釀酒酵母，其蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、多糖羥基骨架等分子成分官能團(tuán)發(fā)生明顯變化，表明細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，且抑制程度越強(qiáng)，官能團(tuán)變化越明顯。與曾令杰等［11］研究甲酸對酵母細(xì)胞毒性作用紅外結(jié)果變化趨勢一致。海藻糖是釀酒酵母應(yīng)對脅迫環(huán)境產(chǎn)生的重要應(yīng)激產(chǎn)物，特異性保護(hù)菌體蛋白質(zhì)、生物膜和核酸等大分子結(jié)構(gòu)［28］，高濃度K+、Ca2+存在時，胞內(nèi)海藻糖含量出現(xiàn)顯著增大，這與胡夢蝶［29］研究的魯氏酵母應(yīng)對乙醇和高溫脅迫時胞內(nèi)海藻糖積累的結(jié)果較為相似。

4 結(jié)論

對熱酸預(yù)處理后的甘蔗糖蜜進(jìn)行總糖、金屬離子含量測定，依據(jù)所測總糖（273.3±4.09 g/L）及金屬離子含量進(jìn)行生物量的測定，發(fā)現(xiàn)K+（15.64 g/L）、Ca2+（8.17 g/L）處理組與對照組相比，最大細(xì)胞生物量分別減少9.83%、18.45%。開展250 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵試驗，與對照組相比，經(jīng)K+、Ca2+處理后，蔗糖水解速率減慢（38.06%、45.72%），水解時間延長；42 h的殘果糖濃度分別是對照組的1.68倍、1.85倍，殘葡萄糖濃度均有剩余（14.2 g/L、19.55 g/L），殘總糖濃度分別是對照組的2.16倍、2.79倍，乙醇生成量減少（18.03%、23.81%）；對比發(fā)現(xiàn)各組殘果糖明顯高于殘葡萄糖量，是導(dǎo)致殘總糖剩余的重要原因。從SEM圖像可以看出，處理組的酵母細(xì)胞表面出現(xiàn)絮狀物，并且細(xì)胞堆積、破裂、粘連，使細(xì)胞無法進(jìn)行正常生理代謝甚至死亡。FTIR圖譜表明處理組中細(xì)胞蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、多糖羥基骨架等結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，且抑制程度越強(qiáng)，結(jié)構(gòu)變化越明顯。為了應(yīng)對高濃度K+、Ca2+的抑制作用，處理6 h的酵母細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖含量出現(xiàn)顯著提高，分別是對照組的1.66倍、1.76倍，說明酵母在K+、Ca2+脅迫條件下可通過合成大量海藻糖以抵御金屬離子脅迫。此外，綜合對比發(fā)現(xiàn)，Ca2+處理組對釀酒酵母GJ2008的抑制作用強(qiáng)于K+處理組。本研究結(jié)果有助于了解釀酒酵母在K+、Ca2+脅迫條件下蔗糖乙醇發(fā)酵過程的蔗糖水解、葡萄糖和果糖消耗、乙醇生成及理化特性的變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究金屬離子對釀酒酵母的毒性機(jī)理，選育耐受型菌株，實現(xiàn)高濃度甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵提供試驗基礎(chǔ)。