藏紅花素通過Nrf2/HO-1通路對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護(hù)作用*

楊歡歡，段毅

（石家莊市第三醫(yī)院，石家莊 050011）

腦卒中是危害人類生命健康的3大疾病之一，其中缺血性腦卒中約占80%[1]。血腦屏障（BBB）能夠阻止某些物質(zhì)進(jìn)入腦組織，對維持腦神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。通過藥物溶栓或手術(shù)治療實(shí)現(xiàn)血流再通是搶救缺血性腦卒中患者的關(guān)鍵，但血流再灌注后將導(dǎo)致活性氧（ROS）和炎癥因子大量釋放，加重氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，破壞BBB結(jié)構(gòu)和通透性而引發(fā)血管源性腦水腫，是導(dǎo)致缺血性腦卒中患者死亡和殘疾的重要因素[2-3]。核因子E2相關(guān)因子 2（Nrf2）/血紅素加氧酶 1（HO-1）信號通路在機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-5]。藏紅花素是中藥藏紅花的主要活性成分，屬于類胡蘿卜素類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素能夠通過抗炎、抗氧化、保護(hù)線粒體對缺血性腦損傷起到一定保護(hù)作用[6]；能夠通過維持BBB完整性防止老年大鼠腦缺血損傷，但其機(jī)制尚未明確[7]。本研究探討了藏紅花素對腦缺血再灌注后BBB的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 240只清潔級健康雄性SD大鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-004]，體質(zhì)量 220～250 g，動物合格號：202005011；實(shí)驗(yàn)動物飼料購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。清潔環(huán)境分籠飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23～25）℃、相對濕度（45～65）%、光照黑暗12 h/12 h，飲水進(jìn)食不限。

1.2 藥物與試劑 藏紅花素（純度≥98%）購自美國Sigma公司（批號：18215-2G）；尼莫地平注射液購自濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號：200417）；紅四氮唑（TTC）、伊文思藍(lán)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號：20191108、20190613）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：200124、191218、200316、200109）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司（批號：7E284L5、8E406G3、4E317F2）；胞漿胞核蛋白制備試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司（批號：0918A20）；二辛可寧酸（BCA）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號：PC0020、DA1015）；閉合蛋白（Occludin）、閉鎖連接蛋白-1（ZO-1）、Nrf2、HO-1、核因子-κB p65（NF-κB p65）抗體、β-肌動蛋白（β-actin）和IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號：2001P19、2002P25、1911P03、2001P14、1909P16、1910P22-b、1908P30A）。

1.3 主要儀器 GFL-230型烤箱（天津市萊波瑞儀器設(shè)備有限公司）；PE型全自動酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）；UV-1200紫外-可見光分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；RM2245型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；Mini-Protoan Tcua型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；CX-21型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組、給藥與模型制備 按隨機(jī)數(shù)字表法將240只SD大鼠分為假手術(shù)組，模型組，低、中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組，每組40只。因口服給藥方式，影響藥物吸收的因素較多，個(gè)體差異較大，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，藏紅花素給藥方式多為腹腔注射給藥[8-9]。造模手術(shù)前7 d開始，低、中、高劑量藏紅花素組分別每日1次腹腔注射給予10、20、40 mg/kg的藏紅花素[10]，尼莫地平組每日1次腹腔注射給予2mg/kg的尼莫地平[11]，假手術(shù)組和模型組均每日1次腹腔注射給予0.9%氯化鈉溶液。末次給藥24 h后，除假手術(shù)組外的各組大鼠均參照楊麗等[12]的報(bào)道，通過線栓阻斷大腦中動脈2 h后恢復(fù)血流再灌注的方法制備腦缺血再灌注大鼠模型；假手術(shù)組行手術(shù)通路，但不插入線栓。

1.4.2 神經(jīng)功能缺失評分 再灌注24 h后，各組隨機(jī)取8只大鼠，按照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分：無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)，得0分；癱瘓側(cè)前肢不能正常伸展，得1分；行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，得2分；向癱瘓側(cè)傾倒，得3分；意識降低、不能主動爬行，得4分；得分越高則說明神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

1.4.3 TTC染色法計(jì)算腦組織梗死率 神經(jīng)功能缺失評分完成后，3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，頸椎脫臼處死、斷頭取腦，去除小腦、腦干，-20℃凍存15 min后冠狀切片（厚度2 mm），置1%的TTC溶液中37℃避光孵育30 min（每5 min將腦切片翻轉(zhuǎn)1次），蒼白色為梗死區(qū)，通過圖像分析軟件計(jì)算腦組織梗死率，梗死率（%）=（梗死區(qū)總面積/切片總面積）×100%。

1.4.4 失質(zhì)量法檢測腦組織含水量 再灌注24 h后，在各組剩余大鼠中分別隨機(jī)取8只大鼠，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，頸椎脫臼處死、斷頭取腦，去除小腦、腦干后稱質(zhì)量為濕質(zhì)量，置于95℃烘箱烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量為干質(zhì)量，含水量（%）=[（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量]×100%。

1.4.5 HE染色法觀察腦組織病理學(xué)改變 再灌注24 h后，在各組剩余大鼠中分別隨機(jī)取8只大鼠，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，頸椎脫臼處死、斷頭取腦，去除小腦、腦干后置4%多聚甲醛溶液4℃固定72 h，石蠟浸潤包埋、4 μm厚度連續(xù)切片，行二甲苯透明和梯度乙醇溶液水化后，按照HE試劑盒操作說明行HE染色，封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理學(xué)改變。

1.4.6 伊文思藍(lán)滲透法檢測BBB通透性 再灌注24 h后，在各組剩余大鼠中分別隨機(jī)取8只大鼠，以4 mL/kg經(jīng)尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)溶液，1.5 h以后3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，暴露心臟，由左心室-右心耳通路灌注400mL的0.9%氯化鈉溶液，斷頭取腦，切取缺血側(cè)腦半球、研磨勻漿后加入3倍量50%的甲酰胺溶液，60℃孵育24 h后3 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min取上清液，然后通過酶標(biāo)儀檢測610 nm波長處吸光度（OD）值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織伊文思藍(lán)含量，腦組織伊文思藍(lán)含量可反映BBB通透性。

1.4.7 腦組織 TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MDA 含量和SOD、CAT活性檢測 再灌注24 h后，取各組剩余的8只大鼠，3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實(shí)施麻醉，頸椎脫臼處死、斷頭取腦，切取缺血側(cè)腦組織100 mg，剪碎后加入4℃裂解液，冰上靜置30 min使其充分裂解，4℃、3500r/min離心（離心半徑10cm）10 min取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒操作說明，通過酶標(biāo)儀檢測TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量；根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行處理后，通過紫外-可見分光光度計(jì)檢測腦組織MDA含量和SOD、CAT活性。

1.4.8 Western blot法檢測腦組織 Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1、胞漿 NF-κB p65、胞核 NF-κB p65 蛋白表達(dá) 取缺血側(cè)腦組織100 mg，按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒操作說明制備胞漿胞核蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后沸水浴10 min，上樣后通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉1 h后滴加 Occludin（1∶800）、ZO-1（1∶800）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）抗體 4 ℃孵育 12 h，洗膜后滴加 IgG 二抗（1∶4 000）室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加DAB顯色，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值做為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量顯著降低（P<0.05）；與尼莫地平組相比，高劑量藏紅花素組神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死率顯著降低（P<0.05），腦含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖 1、表 1。

表1 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量的影響（±s）Tab.1 Effect of crocin on neurological deficit score，cerebral infarction rate，cerebral water content in rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

表1 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量的影響（±s）Tab.1 Effect of crocin on neurological deficit score，cerebral infarction rate，cerebral water content in rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與尼莫地平組相比，△P<0.05。

腦含水量（%）假手術(shù)組 8 0.00±0.00 0.00±0.00 73.05±1.18模型組 8 3.57±0.49* 43.18±3.17* 82.93±2.30*低劑量藏紅花素組 8 3.28±0.56 38.47±3.08 81.25±2.47中劑量藏紅花素組 8 2.53±0.42# 31.06±2.72# 78.51±2.19#高劑量藏紅花素組 8 1.38±0.31#△ 19.35±1.91#△ 76.34±1.75#尼莫地平組 8 1.79±0.37# 28.46±2.38# 77.20±1.89#組別 動物數(shù) 神經(jīng)功能缺失評分（分）腦梗死率（%）

圖1 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦梗體積大的影響Fig.1 Effect of crocin on cerebral infarct volume in rats with cerebral ischemia reperfusion

2.2 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響 假手術(shù)組腦組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)未見異常；模型組可見水腫，神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)不規(guī)則，固縮、空泡變性，胞核深染，炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變；與模型組相比，低、中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組腦組織病變呈不同程度改善，其中藏紅花素各組呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量藏紅花素組改善效果優(yōu)于其它組。見圖2。

圖2 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響（HE，×400）Fig.2 Effect of crocin on the pathological changes of brain tissue in rats with cerebral ischemia and reperfusion（HE，×400）

2.3 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠BBB通透性的影響 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織伊文思藍(lán)含量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組腦組織伊文思藍(lán)含量顯著降低（P<0.05）；與尼莫地平組相比，高劑量藏紅花素組伊文思藍(lán)含量顯著降低（P<0.05）。見表2。

表2 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠BBB通透性的影響（±s）Tab.2 Effect of crocin on BBB permeability of rats with cerebral ischemia and reperfusion（±s） μg/g

表2 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠BBB通透性的影響（±s）Tab.2 Effect of crocin on BBB permeability of rats with cerebral ischemia and reperfusion（±s） μg/g

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與尼莫地平組相比，△P<0.05。

組別 動物數(shù) 伊文思藍(lán)含量假手術(shù)組 8 1.09±0.14模型組 8 11.96±1.48*低劑量藏紅花素組 8 9.85±1.51中劑量藏紅花素組 8 6.81±1.17#高劑量藏紅花素組 8 4.73±0.80#△尼莫地平組 8 6.29±0.93#

2.4 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組 TNF-α、IL-1β、IFN-γ 含量顯著降低（P<0.05）；與尼莫地平組相比，高劑量藏紅花素組TNF-α、IFN-γ 含量顯著降低（P<0.05），IL-1β 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IFN-γ 含量的影響（±s）Tab.3 Effect of crocin on the content of TNF-α，IL-1β，IFN-γ in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

表3 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IFN-γ 含量的影響（±s）Tab.3 Effect of crocin on the content of TNF-α，IL-1β，IFN-γ in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與尼莫地平組相比，△P<0.05。

IFN-γ（pg/g）假手術(shù)組 8 1.39±0.17 35.84±4.31 9.51±1.37模型組 8 2.50±0.34* 67.28±7.95*24.06±3.35*低劑量藏紅花素組 8 2.31±0.37 59.36±7.29 21.72±3.40中劑量藏紅花素組 8 1.96±0.31# 53.04±6.12#16.53±2.81#高劑量藏紅花素組 8 1.64±0.24#△ 44.17±5.63#12.40±2.15#△尼莫地平組 8 1.93±0.28# 47.23±5.98#15.27±2.38#組別 動物數(shù) TNF-α（ng/g）IL-1β（pg/g）

2.5 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT活性的影響 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織MDA含量顯著升高，SOD、CAT活性顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組MDA含量顯著降低，SOD、CAT活性顯著升高（P<0.05）；與尼莫地平組相比，高劑量藏紅花素組MDA含量顯著降低，SOD、CAT活性顯著升高（P<0.05）。見表4。

表4 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT 活性的影響（±s）Tab.4 Effect of crocin on the content of MDA and the activity of SOD，CAT in the brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

表4 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT 活性的影響（±s）Tab.4 Effect of crocin on the content of MDA and the activity of SOD，CAT in the brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與尼莫地平組相比，△P<0.05。

CAT（U/mg）假手術(shù)組 8 0.59±0.10 1.61±0.19 1.02±0.14模型組 8 1.26±0.18* 0.87±0.12* 0.51±0.07*低劑量藏紅花素組 8 1.13±0.16 0.95±0.14 0.56±0.08中劑量藏紅花素組 8 0.98±0.15# 1.14±0.15# 0.73±0.11#高劑量藏紅花素組 8 0.75±0.13#△ 1.38±0.20#△ 0.91±0.15#△尼莫地平組 8 0.97±0.16# 1.09±0.16# 0.74±0.12#組別 動物數(shù) MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）

2.6 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1、胞漿 NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織 Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1 表達(dá)量顯著降低，胞漿 NF-κB p65、胞核 NF-κB p65 表達(dá)量和胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65比值均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中、高劑量藏紅花素組和尼莫地平組 Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1 表達(dá)量顯著升高，胞漿 NF-κB p65、胞核 NF-κB p65 表達(dá)量和胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65比值均顯著降低（P<0.05）；與尼莫地平組相比，高劑量藏紅花素組 Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1 表達(dá)量顯著升高，胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65表達(dá)量和胞核NF-κB p65/胞漿 NF-κB p65 比值均顯著降低（P<0.05）。見圖 3、表 5。

表5 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1、胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)和胞核 NF-κB p65/胞漿 NF-κB p65 比值的影響（±s）Tab.5 Effect of crocin on the expression of Occludin，ZO-1，Nrf2，HO-1，cytoplasm NF-κB p65，nucleus NF-κB p65 protein and the ratio of nucleus NF-κB p65/cytoplasm NF-κB p65 in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

表5 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1、胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)和胞核 NF-κB p65/胞漿 NF-κB p65 比值的影響（±s）Tab.5 Effect of crocin on the expression of Occludin，ZO-1，Nrf2，HO-1，cytoplasm NF-κB p65，nucleus NF-κB p65 protein and the ratio of nucleus NF-κB p65/cytoplasm NF-κB p65 in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與尼莫地平組相比，△P<0.05。

組別 動物數(shù) Nrf2/β-actin假手術(shù)組 8 0.97±0.18模型組 8 0.13±0.04*低劑量藏紅花素組 8 0.46±0.08中劑量藏紅花素組 8 0.70±0.13#高劑量藏紅花素組 8 0.95±0.17#△尼莫地平組 8 0.71±0.11#Occludin/β-actin 0.38±0.08 0.07±0.02*0.09±0.03 0.16±0.03#0.42±0.09#△0.23±0.05#ZO-1/β-actin 0.53±0.11 0.10±0.03*0.19±0.04 0.36±0.07#0.74±0.13#△0.35±0.08#HO-1/β-actin 0.51±0.09 0.09±0.02*0.11±0.03 0.24±0.05#0.48±0.09#△0.36±0.07#胞漿NF-κB p65/β-actin胞核NF-κB p65/胞漿 NF-κB p65 0.12±0.03 0.13±0.04 1.18±0.14 0.28±0.04* 0.41±0.07* 1.46±0.19*0.26±0.05 0.35±0.05 1.34±0.17 0.19±0.03# 0.24±0.05# 1.26±0.15#0.09±0.02#△ 0.10±0.03#△ 1.14±0.13#△0.15±0.04# 0.20±0.04# 1.33±0.14#胞核NF-κB p65/β-actin

圖3 藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠腦組織Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1、胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of crocin on the expression of Occludin，ZO-1，Nrf2，HO-1，cytoplasm NF-κB p65，nucleus NF-κB p65 protein in brain tissue of rats with cerebral ischemia reperfusion

3 討論

BBB是由腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞以及基底膜、細(xì)胞間緊密連接蛋白復(fù)合體（TJPs）等構(gòu)成的一道生理屏障，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注導(dǎo)致BBB受損而引發(fā)的血管源性腦水腫，在缺血性腦損傷疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，其病理機(jī)制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[15]。

藏紅花又名番紅花、西紅花，《本草綱目》記載其性平、味甘，具有活血化瘀、散郁開結(jié)之功效，常用于胸膈痞悶、驚怖恍惚、瘀血腹痛等癥的治療。藏紅花素是藏紅花的主要活性成分，是中國藥典中評價(jià)藏紅花質(zhì)量的指標(biāo)。近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素具有良好的抗炎、抗氧化等多種藥理學(xué)作用[9]。尼莫地平是臨床上常用的一種鈣離子拮抗劑類降壓藥，常用于急性腦血管病的防治，對腦缺血再灌注損傷具有明顯改善作用[16]。伊文思藍(lán)是一種偶氮染料，與血漿白蛋白具有高度親和力，正常狀態(tài)下伊文思藍(lán)不能透過BBB，但BBB受損后則能夠通過BBB進(jìn)入腦組織，因此腦組織伊文思藍(lán)滲透量能夠反映BBB完整性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藏紅花素或尼莫地平干預(yù)能夠明顯改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能，降低腦梗死率和含水量；抑制神經(jīng)元數(shù)量減少、胞核偏移固縮深染、炎性細(xì)胞浸潤等病變，降低腦組織伊文思藍(lán)含量，并且高劑量藏紅花素組對神經(jīng)功能、腦梗死率、腦組織病變及伊文思藍(lán)含量的改善作用均優(yōu)于尼莫地平組，提示藏紅花素對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與保護(hù)BBB有關(guān)。

TJPs是BBB的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，是保證BBB完整性的關(guān)鍵，主要由跨膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、胞質(zhì)附著蛋白等構(gòu)成；Occludin是一種小分子跨膜蛋白，能夠封閉內(nèi)皮細(xì)胞間隙，Ayer RE等[18]研究發(fā)現(xiàn)Occludin缺失將導(dǎo)致TJPs細(xì)胞突起減少和TJPs骨架破壞；ZO-1為TJPs重要組成部分，維持細(xì)胞極性和胞旁屏障，Branca JJV等[19]研究發(fā)現(xiàn)ZO-1缺失將影響TJPs生成，破壞BBB結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致BBB通透性升高。腦缺血再灌注后ROS大量產(chǎn)生，以ROS為底物的SOD、CAT等抗氧化酶被過度消耗，導(dǎo)致ROS不能及時(shí)清除，過剩的ROS將攻擊細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)Occludin蛋白降解，從而破壞TJPs結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致BBB完整性受損、通透性升高[20]。腦缺血再灌注過程將病理性刺激炎性因子 TNF-α、IL-1β、IFN-γ 釋放，其中 TNF-α、IL-1β能夠刺激粒細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性因子而加重炎癥反應(yīng)[21]。陸正齊[22]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)能夠誘導(dǎo)Occludin蛋白降解而破壞TJPs結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)并與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)而增加BBB通透性。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藏紅花素或尼莫地平干預(yù)能夠明顯上調(diào)腦缺血再灌注大鼠腦組織Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)，降低 TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MDA含量并提高SOD、CAT活性，并且高劑量藏紅花素組上述效應(yīng)優(yōu)于尼莫地平組，提示藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠BBB結(jié)構(gòu)和通透性具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種抗氧化因子，正常狀態(tài)下以“Nrf2-Keap1”復(fù)合體形式存在而無活性，ROS能夠破壞復(fù)合體結(jié)構(gòu)并激活Nrf2，活化Nrf2核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)SOD、CAT等抗氧化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激損傷；HO-1為Nrf2靶基因，能夠誘導(dǎo)血紅素以及一氧化氮（NO）等ROS還原而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[23]。生理狀態(tài)下，NF-κB以p50/p65二聚體形式存在并與特異性酶抑制劑結(jié)合而無生理活性；病理狀態(tài)下，p50/p65與酶抑制劑解離而被激活，入核后p65亞基與DNA特異性位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)與釋放，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[24]。此外，HO-1能夠抑制NF-κB表達(dá)與活化，從而間接抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)[25]。此外，HO-1能夠抑制NF-κB表達(dá)與活化，從而間接抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)[26]。近年來，張蕾等[27]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能夠激活Nrf2/HO-1通路、降低氧化應(yīng)激損傷而減輕腸缺血再灌注小鼠腸黏膜損傷。牟俊杰等[28]報(bào)道淫羊藿苷減輕大鼠腎缺血再灌注損傷與其介導(dǎo)Nrf2/HO-1通路活化而抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。蘇凡等[29]發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素抑制腦缺血再灌注損傷與活化Nrf2/HO-1通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激有關(guān)；常江等[30]發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A抑制腦缺血再灌注損傷與激活Nrf2/HO-1通路而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藏紅花素或尼莫地平干預(yù)能夠明顯上調(diào)Nrf2、HO-1表達(dá)并下調(diào)胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65表達(dá)，降低胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65比值，并且高劑量藏紅花素組對 Nrf2、HO-1、胞漿 NF-κB p65、胞核 NF-κB p65 表達(dá)和胞核 NF-κB p65/胞漿 NF-κB p65比值的調(diào)控作用優(yōu)于尼莫地平組，提示藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與激活Nrf2/HO-1通路及抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

綜上所述，藏紅花素對腦缺血再灌注大鼠BBB結(jié)構(gòu)和通透性具有一定的保護(hù)作用，能夠減輕腦組織損傷，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路，抑制NF-κB入核，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果為藏紅花素用于防治腦缺血再灌注損傷提供了理論支持。