基于紅外測溫的火針“溫通”效應改善脊髓損傷作用靶點研究*

趙志恒 ，張胤弢 ，李璨 ，李蕾 ，徐家淳

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腦病針灸中心，天津 300250；2.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 301617）

脊髓損傷（SCI）是由墜落、交通事故及暴力損傷等因素導致一種破壞性的中樞神經系統(tǒng)疾病。SCI具有高致死率和高致殘率的特點，可造成脊髓功能暫時或永久性的缺損，表現為損傷平面以下運動、感覺或自主功能的喪失[1-2]。盡管已有大量對于SCI的基礎研究和臨床治療研究，但西醫(yī)對此缺乏有效的治療措施。

SCI屬于中醫(yī)“痿證”“痹證”“體惰”的范疇，臨床研究已證實傳統(tǒng)針刺療法治療該病獲效顯著[3-4]。而火針療法屬于針刺療法的一種，具有獨特的“溫通”效應，可有效治療痹證、痿證。研究表明，火針療法可改善SCI后相關癥狀[5]，但火針“溫通”作用的起效靶點及作用機制仍待挖掘。

熱休克蛋白(HSP)是在高溫、機械損傷、炎癥等各種應激性刺激下產生的具有多種生物學保護作用的內源性應激蛋白，這可能與火針“溫通”效應的作用靶點有關。HSP可通過抑制神經元凋亡，在SCI后繼發(fā)性損傷中起著重要的保護作用。因此，本研究擬在紅外測溫的基礎上，觀察火針療法對HSP60的影響，探索火針療法是否具有減輕SCI后神經元凋亡的作用，為明確火針療法“溫通”效應改善脊髓損傷的作用靶點提供部分實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠120只，體質量240～260 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0010；大鼠均飼養(yǎng)于南開醫(yī)院實驗動物中心（12 h光照-黑暗交替，室溫22℃，相對濕度50%）。采用隨機數字表法將只大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、毫針組、艾灸組、火針組，每組分為1、3、7、14 d共4個時點（參考Lee等的研究[6]），每組每個時點6只大鼠。造模前適應性喂養(yǎng)1周，食水自由。

本研究動物實驗方案經過天津市南開醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核（NKYY-DWL-2020-166），符合動物保護、動物福利和倫理原則，死亡動物釆取隨機原則補齊數量。

1.2 主要試劑與儀器 電動顱腦脊髓損傷撞擊儀（安徽耀坤 ZL-008），小動物麻醉機（R540IP），InfiRay紅外測溫手機熱像儀T2L，科研實驗用異氟烷（R510-22-16），Anti-HSP60，4%多聚甲醛（天津易生源），賀氏細火針（0.3 mm），艾絨，免疫組化檢測試劑盒（SP-0023，北京博奧森）。

2 方法

2.1 動物造模 采用小動物麻醉機異氟烷氣體麻醉大鼠后，采用改良的Allen’s法制備SCI模型[7]，以大鼠尾巴痙攣性擺動、雙下肢及身體回縮抽動、呈弛緩性癱瘓為造模成功。模型組、毫針組、艾灸組、火針組均進行造模處理，假手術組只做胸（T）9～10椎板切除術。造模成功后每天擠壓排尿3次，直至反射性膀胱排空建立。

2.2 干預方法 造模成功后，對各組大鼠進行相應干預。選穴：T7、T8、T11和 T12棘突下及 T9、T10棘突下左右旁開0.5 cm處夾脊穴，共8穴。

毫針組：選用杏林牌一次性針（0.3 mm×25 mm），采用常規(guī)針刺法施于穴位，進針深度為3～5 mm，常規(guī)留針30 min，每24 h針刺1次。

艾灸組：將大鼠固定后，在相應穴位用麥粒灸（約5 mg艾絨/壯）灸5壯，每24 h施灸一次。

火針組：選用細火針（0.3 mm×25 mm），75%醫(yī)用酒精棉球充分消毒針具和針刺部位，術者手持賀氏細火針，在酒精燈外焰處沿針體—針尖的順序燒紅，然后快速點刺腧穴，進針深度為3～5 mm，每24 h針刺1次。

假手術組和模型組大鼠不進行治療性干預，在相同時間給予相同強度的抓取、固定，相應時點檢測。

2.3 檢測指標

2.3.1 行為學評分 采用Basso Beattie Bresnahan（BBB）行為功能評分[8]，觀察火針對脊髓損傷模型大鼠神經功能缺損恢復程度的影響。

2.3.2 紅外測溫成像 采用InfiRay紅外測溫手機熱像儀T2L對各組大鼠基礎體溫、干預即刻及干預后不同時點進行紅外測溫，測溫環(huán)境：溫度22℃，濕度50%。其中，假手術組和模型組因體溫波動不明顯，僅觀察30 min，而毫針組、艾灸組和火針組大鼠均延長測溫時點，測溫至90 min。

2.3.3 免疫組化檢測HSP60表達 各組大鼠（每組12 只）在相應時點（1、3、7、14 d）斷頭處死后，提取損傷節(jié)段脊髓組織，參照免疫組化檢測試劑盒（SP-0023，北京博奧森）說明書進行免疫組化染色，鏡下觀察陽性細胞數，比較各組脊髓損傷部位HSP60的表達。

2.3.4 TUNEL染色檢測神經元凋亡 各組大鼠（每組 12只）在相應時點（1、3、7和 14 d）斷頭處死后，提取損傷節(jié)段脊髓組織，參照試劑盒進行TUNEL染色，光鏡下觀察神經元凋亡情況。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，根據正態(tài)性和方差齊性檢驗結果，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 行為學結果 在相應時間點對各組大鼠進行神經功能評分，結果顯示假手術組大鼠在各個時間點均無神經功能缺損癥狀；模型組大鼠在各個時間點神經功能評分均明顯低于假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組相應時點相比，毫針組在7 d、艾灸組在7、14 d，火針組在3、7和14 d評分均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與毫針組相比，火針組14 d時評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與艾灸組相比，火針組在7 d和14 d評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分（±s）Tab.1 BBB scores of rats in each group at different time points（±s） 分

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與毫針組相比，△P<0.05；與艾灸組相比，▲P<0.05。

組別 動物數 時間節(jié)點1 d 3 d 7 d 14 d假手術組 6 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00模型組 6 0.67±0.82* 1.67±1.03* 3.67±1.96* 7.50±1.38*毫針組 6 1.50±1.22 2.33±0.82 6.67±2.25# 8.67±1.37艾灸組 6 1.17±0.41 2.67±1.03 5.50±2.07# 9.83±2.48#火針組 6 1.00±0.89 3.83±1.72# 7.16±0.98#▲ 13.00±3.58#△▲

3.2 紅外測溫結果 紅外測溫結果顯示，各組大鼠基礎體溫較一致，在39℃左右。各組大鼠基礎體溫較高，考慮與固定時大鼠掙扎活動有關。假手術組與模型組大鼠在測溫過程中溫度波動較小，因此測溫至固定后30 min。見表2、圖1。

圖1 紅外測溫成像下各組大鼠基礎體溫和0～30 min脊髓損傷局部溫度變化Fig.1 Infrared thermometry changes in local temperature of SCI rats in each group at basal body temperature and 0～30 min

毫針組與火針組大鼠在針刺即刻體溫出現明顯降低，考慮與針刺后應激有關，艾灸組在艾灸即刻溫度上升，考慮與艾灸輻射的熱量有關。艾灸5min至30 min大鼠脊髓損傷局部體溫波動不明顯，艾灸停止后，即40min時，艾灸組大鼠溫度明顯降低，50min時恢復至基礎體溫左右，此后溫度波動不明顯。

毫針組與火針組體溫波動呈現相似的趨勢，針刺即刻時體溫降低，5 min時溫度回升。毫針組在針刺干預期間（30 min）體溫一直低于基礎體溫，考慮與針刺應激相關，40 min時，停止干預后毫針組體溫呈現上升趨勢，波動在基礎體溫上下，維持到90min。火針組在火針干預5 min后溫度呈緩慢上升趨勢，升高0.5℃左右，且升溫過程持續(xù)至90 min，見表2、3，圖 2、3。

圖2 紅外測溫成像下各組大鼠40～90 min脊髓損傷局部溫度變化Fig.2 Infrared thermometry changes in local temperature of SCI rats of 3 groups at 40～90 min

圖3 各組干預后不同時間點損傷部位溫度Fig.3 Temperature of the injury siteafter intervention in each group at different time points

表2 各組大鼠基礎體溫和0～30 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.2 Changes in local temperature of SCI rats in each group at basal body temperature and 0～30 min（±s） ℃

表2 各組大鼠基礎體溫和0～30 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.2 Changes in local temperature of SCI rats in each group at basal body temperature and 0～30 min（±s） ℃

組別 動物數 0 min 5 min 10 min 20 min 30 min假手術組 12 39.14±0.89 39.47±0.82 39.45±0.60 39.38±0.93 39.63±1.35 39.08±0.90模型組 11 38.93±0.64 38.98±0.88 38.69±0.69 39.16±0.87 39.10±0.50 38.95±0.41毫針組 13 38.81±0.95 37.59±1.62 38.24±1.93 38.22±2.19 37.84±2.20 37.96±2.22艾灸組 13 39.18±0.62 39.58±1.22 39.14±1.36 39.15±0.68 38.91±0.65 38.71±0.85火針組 12 39.19±0.92 38.53±1.09 38.35±1.27 38.52±1.41 38.73±1.29 38.53±1.21基礎體溫 時間節(jié)點

表3 3組大鼠40～90 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.3 Changes in local temperature of SCI rats of 3 groups at 40～90 min（±s） ℃

表3 3組大鼠40～90 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.3 Changes in local temperature of SCI rats of 3 groups at 40～90 min（±s） ℃

時間節(jié)點40 min 50 min 60 min 70 min 80 min 90 min毫針組 13 39.08±1.57 38.83±1.32 38.96±1.83 39.23±0.85 38.04±2.98 39.70±0.81艾灸組 13 36.84±8.28 38.69±0.99 38.80±1.17 38.91±1.41 39.39±0.79 38.72±1.39火針組 12 38.58±1.24 39.03±1.78 38.54±1.50 38.96±1.03 39.08±1.44 39.40±0.66組別 動物數

3.3 HSP60免疫組化結果 免疫組化染色結果顯示，假手術組在各個時點HSP60的陽性表達相對穩(wěn)定；而模型組在1 d時HSP60的陽性表達低于假手術組；與模型組各個時點相比，毫針組、艾灸組的HSP60陽性表達均增高；與毫針組和艾灸組相比，火針組HSP60陽性表達升高，且在7 d和14 d時升高最明顯，見圖4。

圖4 各組HSP60免疫組化染色結果Fig.4 Immunohistochemical staining results of HSP60 in each group

3.4 神經元凋亡情況 TUNEL染色顯示假手術組在各個時點均無或存在少量神經細胞凋亡情況；模型組在1 d時凋亡細胞明顯增多，3、7和14 d時有所減輕；1 d時，與模型組相比，毫針組、艾灸組和火針組神經細胞凋亡情況與模型組相同，可見大量褐色細胞；3 d時毫針組、艾灸組和火針組神經細胞凋亡情況少于模型組，持續(xù)至7和14 d，其中火針組在14 d時僅可見少量神經細胞凋亡，見圖5。表明毫針、艾灸和火針療法均可有效減輕脊髓損傷后神經細胞凋亡情況，其中火針療法作用較為明顯。

圖5 各組大鼠不同時點神經細胞凋亡情況（TUNEL染色）Fig.5 Apoptosis of nerve cells points in rats in each groupat different times（TUNEL staining）

4 討論

《黃帝內經》云：“若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰”，故SCI多歸屬于中醫(yī)“痿證”“體惰”范疇。SCI的損傷部位及程度的不同可導致不同程度的神經功能缺損，表現為部分感覺或運動功能喪失、甚至受傷部位下方的完全癱瘓。不僅給患者帶來巨大痛苦，而且給社會帶來了沉重的負擔。SCI的病理生理學進展被分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷：原發(fā)性損傷通常由初始機械變化引起，并在損傷后立即發(fā)生，這是不可逆的；而繼發(fā)性損傷是可逆的，被認為對SCI后的神經功能恢復有更顯著的影響。

本病病位在督脈，督脈為“陽脈之?！?，陽氣者“精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋”，督脈受損則不能濡養(yǎng)四肢肌肉而表現為肢體癱瘓、痿弱失用，治當以溫通助陽?；疳槸煼ㄊ菍⑻刂频尼樉呓浖訜釤t后刺入人體腧穴以治療疾病的方法，具有溫通陽氣之功效，首屆國醫(yī)大師賀普仁教授倡導火針療法的使用，認為其具有“溫通”的效應兼有“溫熱”和“針刺”的雙重功效，火針的治病機制在溫熱。廣泛應用于骨科、神經科等常見病種，且具有其優(yōu)勢病種，脊髓損傷即是其中之一[9]。

本課題組圍繞火針治療SCI的機制進行了一系列研究，發(fā)現火針療法可促進SCI后神經元再生，有效改善模型大鼠神經功能缺損癥狀[10]，但其起效靶點仍待進一步深入挖掘。課題組認為，火針針刺后強烈的針感和持續(xù)的熱刺激對于機體來說可作為一種應激原，可能會在一定程度上激活熱休克蛋白（HSP）家族相關蛋白，提高機體抵抗疾病能力。

HSP是生物細胞在各種應激性刺激（如高溫、炎癥、缺血缺氧、DNA損傷等）作用下產生的一組具有多種生物學保護作用的內源性應激蛋白，可增強機體對多種應激原的耐受能力，是應激反應中機體在分子水平上的保護機制[11]。已有研究發(fā)現，無論是針刺的機械刺激[12]還是艾灸的溫熱刺激[13-14]均可在一定程度上誘導HSP家族的合成，提高機體抵抗疾病能力。HSP在SCI后繼發(fā)性損傷中起著重要的保護作用，已被證實是脊髓損傷后產生的一種重要的內源性保護因子[15-16]，可通過不同途徑發(fā)揮抗神經細胞凋亡、抑制神經炎癥、減少自由基毒性的作用，有助于減輕SCI后繼發(fā)性損傷[17-18]。

本研究發(fā)現，艾灸組在艾灸即刻溫度上升，考慮與艾灸輻射的熱量有關。艾灸5 min至30 min大鼠脊髓損傷局部體溫波動不明顯，艾灸停止后40min時，艾灸組大鼠溫度明顯降低，50 min時恢復至基礎體溫左右，此后溫度波動不明顯。而火針療法針刺后，脊髓損傷局部溫度首先呈現下降的趨勢，毫針組亦呈現出相同的趨勢，即針刺即刻時體溫降低，5min時溫度回升。這可能與針刺的“機械”刺激引起機體的應激反應相關?；疳樀牟僮鞣椒椤八俅碳渤觥?，但在干預5min后，脊髓損傷局部溫度呈緩慢上升趨勢，升高0.5℃左右且升溫過程持續(xù)至干預90 min，與艾灸組表現不同，這可能是火針的“溫通”效應的獨特表現。

同時本研究發(fā)現火針療法干預SCI大鼠后，在7 d和14 d時BBB評分明顯升高，且HSP60的陽性表達明顯升高，這種升高趨勢在7 d和14 d時最明顯。而TUNEL染色結果顯示持續(xù)至7 d和14 d時神經細胞凋亡情況明顯少于模型組，其中火針組在14 d時僅可見少量神經細胞凋亡，這表明毫針、艾灸和火針療法均可有效減輕脊髓損傷后神經細胞凋亡情況，其中火針療法作用較為明顯。上述結果表明火針療法的“溫通”效應可能以HSP60為起效靶點，減輕神經元凋亡，發(fā)揮改善SCI后神經功能缺損的作用。