青綠苔草(Care breviculmis)愈傷組織誘導(dǎo)與再生體系的建立

位明君, 王 萌, 范希峰, 滕文軍, 滕 珂, 溫海峰, 武菊英, 劉艷芬, 岳躍森*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京， 100097；2.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院， 邯鄲， 056000； 3.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京， 102206)

青綠苔草(C.breviculmis)為莎草科(Cyperaceae)苔草屬(CarexL.)多年生草本，緊湊叢生，株高10～30 cm，葉片為淺綠色線形[1]。因其具有耐陰、生長季長、形態(tài)優(yōu)美和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于地表種植和園林綠化，以起到覆蓋地表、保持水土的作用。

苔草屬植物具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，對恢復(fù)與改善生態(tài)環(huán)境具有重要作用[2-3]。劉凌云等[4-5]在綜述中針對苔草屬植物遺傳多樣性在物種起源及親緣關(guān)系、遺傳圖譜構(gòu)建、品種選育和鑒定等方面詳細(xì)歸納，為苔草的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。梁芳等[6-8]發(fā)現(xiàn)苔草種子存在不同程度的休眠現(xiàn)象，其中麻根苔草(C.arnellii)、異鱗苔草(C.heterolepis)、溪水苔草(C.forficula)發(fā)芽極其困難[6]。李慧等[9]針對青綠苔草的休眠問題，分別采用滲調(diào)引發(fā)、激素引發(fā)、水引發(fā)和混合處理的方法對其種子進(jìn)行處理，處理后種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)得到提高，發(fā)芽時(shí)間縮短，發(fā)芽率提高4%。

組織培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)[10]、園藝學(xué)[11-12]等研究領(lǐng)域中，解決了種子發(fā)芽困難、實(shí)生苗弱以及分株繁殖受季節(jié)限制的問題[13]。呂秀立等[14-15]分別以靠近根系部分的生長點(diǎn)為外植體，通過添加植物激素誘導(dǎo)不定芽的方法，建立金葉苔草(C.oshimensis'Evergold')快繁體系，但同時(shí)也提出了外植體消毒困難的問題；亓杰等[16-17]均以種子為外植體，分別通過誘導(dǎo)種子萌發(fā)后進(jìn)行芽增殖，和誘導(dǎo)愈傷的方法建立了異麟苔草和青藏苔草(C.moorcroftii)的再生體系；然而，有關(guān)青綠苔草再生體系的研究尚未見報(bào)道。由于種子容易儲存、且不受季節(jié)限制，因此本研究以青綠苔草種子為試驗(yàn)材料，通過誘導(dǎo)愈傷組織的方式建立青綠苔草再生體系，為研究青綠苔草的遺傳轉(zhuǎn)化及應(yīng)用生物技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為國審品種‘四季’青綠苔草(C.breviculmis‘siji’)種子，來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的消毒 挑選飽滿的種子，用無菌水清洗1遍，在超凈工作臺中用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗干凈后，用0.1%的氯化汞浸泡消毒20 min，無菌水沖洗3～5次后放到無菌紙上，吸干水分后接種到培養(yǎng)基中。

1.2.2愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 在Murashige and Skoog培養(yǎng)基(以下簡稱MS)的基礎(chǔ)上添加不同濃度的NAA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)、6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)和2,4-D(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用9種組合作為愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基中接種20粒種子，5個(gè)重復(fù)，(25±1)℃黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷。

表1 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)表Table 1 L9(33) Orthogonal experiment table

1.2.3不定芽分化培養(yǎng)基的篩選 在MS培養(yǎng)基上添加不同配比的NAA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)、6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)做完全隨機(jī)試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)9種培養(yǎng)基。在保證愈傷長勢一致，大小均等的情況下，每種培養(yǎng)基接種9塊愈傷，做4個(gè)重復(fù)，在溫度24±1℃、光照16 h、黑暗8 h條件下培養(yǎng)，4 w后統(tǒng)計(jì)分化情況。

1.2.4生根培養(yǎng)基的篩選 在1/2 MS培養(yǎng)基上添加不同濃度IBA(0.05，0.10，0.20 mg·L-1)、NAA(0.10，0.20 mg·L-1)，促進(jìn)其生根，將長勢一致的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，每瓶接種4個(gè)，做4個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)條件同不定芽分化培養(yǎng)，3 w后統(tǒng)計(jì)其生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 25.0與Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素對青綠苔草愈傷誘導(dǎo)的影響

將種子種在培養(yǎng)基中10 d左右時(shí)，種子的發(fā)芽數(shù)量超過50%；20 d時(shí)，已發(fā)芽和未發(fā)芽的種子均開始出現(xiàn)愈傷。結(jié)果表明，各處理下均成功誘導(dǎo)出愈傷組織，但不同植物激素對青綠苔草愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著差異。其中7號培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率最高，為68.3%，是1號培養(yǎng)基誘導(dǎo)率的近6倍，愈傷表現(xiàn)為黃色顆粒狀；其次為5號、9號培養(yǎng)基，愈傷的誘導(dǎo)率都達(dá)到50%以上，其中1號、8號培養(yǎng)基效果最差，誘導(dǎo)率分別為11.7%和15.0%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)與分析，誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)不同植物激素間的主次關(guān)系為2,4-D>6-BA>NAA，水平優(yōu)選后得出理論最佳激素組合為MS+1.5 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D。

表2 不同植物激素對愈傷誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different plant hormones on callus induction

2.2 不同植物激素對愈傷分化的影響

誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)進(jìn)行增殖，然后轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，愈傷開始增大并出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)；繼續(xù)培養(yǎng)至20 d時(shí)，芽點(diǎn)生長為不定芽，并有部分不定芽開始伸長；繼續(xù)分化至第4 w時(shí)，愈傷基本分化完全。不同配比的植物激素對愈傷分化具有顯著差異性(表3)，5號培養(yǎng)基分化率為93.8%，分化出不定芽數(shù)量最高為40個(gè)，不定芽數(shù)量是9號培養(yǎng)基的近兩倍，不定芽顏色濃綠，長勢良好。其次是處理8、處理2，愈傷分化率都在90%以上，但分化出的不定芽數(shù)量顯著低于處理5。因此確定在基本培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA為最佳分化培養(yǎng)基。

表3 不同植物激素對愈傷分化的影響Table 3 Effects of different plant hormones on callus differentiation

2.3 不同植物激素對不定芽生根的影響

在誘導(dǎo)青綠苔草不定芽生根的過程中，NAA對青綠苔草不定芽生根的影響無顯著差異。隨著培養(yǎng)基中IBA濃度的增加，處理5、6的生根狀況明顯差于處理4。當(dāng)IBA濃度為0.05 mg·L-1時(shí)，生根數(shù)量和株高與CK培養(yǎng)基無顯著差異，但根長只有2.2 cm；當(dāng)IBA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，生根效果較差，根長均不超過1 cm。因此在不添加任何激素的對照(1/2 MS)培養(yǎng)基中，生根效果最好，根長5.17 cm、株高可達(dá)到5.20 cm，生根4.33條，顯著高于其他處理(表4)。

表4 不同植物激素對不定芽生根的影響Table 4 Effects of different plant hormones on rooting of adventitious shoots

2.4 煉苗移栽

將再生苗瓶口的封口膜打開，煉苗3 d后，將完整的再生植株取出，將根系上的培養(yǎng)基清理干凈后移栽到穴盤中，穴盤中的基質(zhì)澆透水，每天噴一次水，10 d后統(tǒng)計(jì)成活率。移栽后的再生苗顏色翠綠，長勢良好，成活率可以達(dá)到90%(圖1)。

圖1 青綠苔草再生體系的建立Fig.1 Establishment of C.breviculmis regeneration system注：A愈傷組織的誘導(dǎo)(MS+1.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2,4-D，3w)；B愈傷繼代增殖(MS+1.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2,4-D，3w)；C愈傷分化不定芽(MS+ 1.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 6-BA，2w)；D生根培養(yǎng)(1/2MS，2w)Note：A:Induction of callus;B:Callus proliferation;C:Callus differentiation;D:Rooting culture

3 討論

獲得再生植株是遺傳學(xué)和育種工作的重要基礎(chǔ)。由于植物細(xì)胞的全能性，試驗(yàn)材料的選擇范圍也較為廣泛，植物的種子、莖段、葉片、花瓣等均可作為外植體。趙嬌陽等[18]以偏關(guān)苜蓿的種子培養(yǎng)至發(fā)芽后，切取子葉及下胚軸誘導(dǎo)愈傷，發(fā)現(xiàn)下胚軸誘導(dǎo)愈傷的效果優(yōu)于子葉；康紅霞等[19]發(fā)現(xiàn)選擇無菌苗的上、下胚軸、真葉均可以誘導(dǎo)愈傷，李孟悅等[20]以毛報(bào)春的腋芽為外植體，通過誘導(dǎo)愈傷組織的方法建立了高效的再生體系；徐春波等[21-22]則以冰草幼穗和菊花花瓣為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織；狼尾草[23]、金葉苔草[14-15]可選擇具有生長點(diǎn)的腋芽和莖尖，通過誘導(dǎo)芽增殖的方法建立植物的快繁體系；花藥培養(yǎng)[24]和小孢子培養(yǎng)[25-26]技術(shù)在水稻、小麥和蔬菜等植物上也已經(jīng)較為成熟。在外植體的選擇上，葉片、幼穗和花瓣等材料均需要在植物的不同生長時(shí)期采取，而種子具有采收后耐儲存，消毒方便的特點(diǎn)，本研究以青綠苔草的種子為外植體，建立了其完整的再生體系，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的優(yōu)質(zhì)再生植株，為青綠苔草的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

在建立青綠苔草再生體系過程中，能否得到高質(zhì)量的胚性愈傷是至關(guān)重要的一步，而植物激素的選擇顯得尤為重要，不同激素對于不同植物愈傷誘導(dǎo)率具有顯著影響。在MS基本培養(yǎng)基中添加2,4-D的效果優(yōu)于NAA，合適配比的6-BA可以提高愈傷的質(zhì)量[27-28]；Songstao[29]發(fā)現(xiàn)2,4-D和6-BA兩種植物激素搭配對于愈傷組織誘導(dǎo)具有很好的效果。王曉璐等[30]以谷子(Setaritalica)種子為外植體，在MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)92.9%；柴乖強(qiáng)等[31]提出，6-BA對柳枝稷(Phalarisarundinacea)幼穗誘導(dǎo)愈傷具有明顯的促進(jìn)作用，在濃度為3.0 mg·L-1時(shí)到達(dá)高峰，隨著6-BA濃度的逐漸升高，愈傷誘導(dǎo)率呈減弱趨勢。本研究在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-16-BA和2.0 mg·L-12,4-D時(shí)，青綠苔草種子的愈傷誘導(dǎo)率最高。

除外植體和植物激素的選擇外，基本培養(yǎng)基的選擇也較為重要。劉蓉等[32]發(fā)現(xiàn)，WPM基本培養(yǎng)基比MS更適于牡丹(Paeoniaostii)幼胚再生，在誘導(dǎo)麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)愈傷組織的研究中，則是以M8為基本培養(yǎng)基[33]；Jakubeková等[27]利用玉米(Zeamays)胚乳，以N6為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織；同樣誘導(dǎo)玉米愈傷的研究中，廖長見等[34]則以幼胚為外植體，在N6培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.0 mg·L-12,4-D、500 mg·L-1酸水解酪蛋白和38 g·L-1L-脯氨酸，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到71%。而各類基本培養(yǎng)基之間主要是大量、微量元素，鐵鹽和肌醇等物質(zhì)含量不同，因此，基本培養(yǎng)基的選擇對誘導(dǎo)愈傷組織也較為重要。

4 結(jié)論

本研究通過添加不同配比的植物激素，以種子為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)再生植株，表明青綠苔草種子誘導(dǎo)愈傷的最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D，最佳不定芽分化培養(yǎng)基為MS+ 1.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA，在1/2 MS培養(yǎng)基中生根效果最好，生根培養(yǎng)3 w后將再生苗進(jìn)行煉苗后移栽至穴盤中，成活率可達(dá)90%以上。