王 勃, 王聰聰, 夏方山, 陳奕霖, 趙 萍, 朱慧森
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 山西 太谷 030801)
硒是對(duì)人類和動(dòng)物身體健康至關(guān)重要的必需微量元素,其含量不足會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫下降和內(nèi)分泌失調(diào)等多種關(guān)聯(lián)疾病的發(fā)生[1]。由于硒在人類和動(dòng)物體內(nèi)無(wú)法自發(fā)合成且易于排泄,因此人類和動(dòng)物必須以食物鏈中的硒作為攝入來(lái)源,以保障其生命機(jī)體的正常代謝活動(dòng)[2]。然而,土壤中硒可利用性低,導(dǎo)致人體硒含量低,這成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。我國(guó)土壤缺硒地區(qū)約占國(guó)土總面積的72%,且嚴(yán)重缺硒地區(qū)約占1/3[4]。因此,解決土壤缺硒問(wèn)題是當(dāng)前我國(guó)乃至全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。通過(guò)合理的生物富硒既能提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì),又能增加人類和動(dòng)物體內(nèi)硒水平,從而成為提高人類硒攝入水平的關(guān)鍵途徑[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),噴施硒肥能夠促進(jìn)玉米(Zeamays)[4]、黑小麥(Triticumaestivum)[6]、水稻(Oryzasativa)[7]等植物生長(zhǎng)發(fā)育,并提高其籽實(shí)產(chǎn)量和硒含量等品質(zhì)。然而,過(guò)量噴施硒肥會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育,并造成其產(chǎn)量下降[8]。因此,合理控制硒濃度是富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。
當(dāng)前,采用土壤施肥和葉面噴施是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物微肥的主要施用方式,而采用種子引發(fā)方式則較少[10]。土壤施肥因微肥需求量少而難以均勻撒施,葉面噴施則無(wú)法快速緩解根系對(duì)微肥缺乏的敏感需求,兩者又均對(duì)人力物力的需要較大,這都降低了微肥施用的經(jīng)濟(jì)效益,種子引發(fā)則可避免這些局限性[11]。種子引發(fā)不僅能提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì),還能增強(qiáng)植物在逆境條件下的抗氧化能力,抑制其脂質(zhì)過(guò)氧化作用的發(fā)生,從而提高其抗逆性[12]。硒引發(fā)同樣既能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育,又能通過(guò)提高其抗氧化能力來(lái)增強(qiáng)其抗逆性能[13-14]。因此,種子引發(fā)被作為一種經(jīng)濟(jì)有效、簡(jiǎn)單可行、備受關(guān)注的生理策略應(yīng)用于富硒植物生產(chǎn)[3,15]。然而,硒引發(fā)對(duì)植物的影響研究仍然較少,致使不同植物種或品種對(duì)其響應(yīng)差異仍不清楚,這嚴(yán)重制約了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。
牧草硒含量水平與草食動(dòng)物機(jī)體健康具有密切關(guān)系,進(jìn)而間接決定著人類身體的健康狀況[16]。紫花苜蓿(Medicagosativa)因適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、再生快、富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等諸多特性被作為優(yōu)質(zhì)牧草在世界各地廣泛種植[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加富硒苜蓿草粉既能夠促進(jìn)家畜增重,又可提高其飼料轉(zhuǎn)化率和肉品質(zhì)[16]。因此,如何更好地生產(chǎn)富硒苜蓿產(chǎn)品也就日益被農(nóng)牧業(yè)領(lǐng)域所關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),適量濃度的硒引發(fā)[14]及基施[19]方式也均會(huì)提高紫花苜蓿的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Aseorbate peroxidase,APX)及過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)活性,并降低了其丙二醛(Maloddialdehyde,MDA)含量,不僅能促進(jìn)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)[20],還能提高其不同生育期的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[21-23]。然而,高濃度硒引發(fā)則相反[20],且不同品種紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)能力均隨硒濃度增加而降低[2],但不同品種紫花苜蓿的抗氧化酶能力如何響應(yīng)硒引發(fā)則尚未見(jiàn)報(bào)道,這對(duì)富硒紫花苜蓿生產(chǎn)中最佳品種的篩選極為不利。因此,本試驗(yàn)以12個(gè)紫花苜蓿品種的種子為材料,分析亞硒酸鈉溶液引發(fā)不同時(shí)間后其抗氧化酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化的變化規(guī)律,以期揭示不同紫花苜蓿品種響應(yīng)硒引發(fā)的抗氧化性能差異,并篩選出適宜進(jìn)行硒引發(fā)的紫花苜蓿品種,從而為高質(zhì)量富硒苜蓿產(chǎn)品的生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。
供試材料是品種為‘偏關(guān)苜?!甒L168HQ’,‘WL298HQ’,‘WL319HQ’,‘WL343HQ’,‘WL440HQ’,‘WL354HQ’,‘WL363HQ’,‘WL366HQ’,‘WL656HQ’,‘WL712’和‘WL903’的紫花苜蓿種子,‘偏關(guān)苜蓿’種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草種實(shí)驗(yàn)室在2018年10月收獲于校內(nèi)基地,其他品種的苜蓿種子由北京正道農(nóng)業(yè)股份有限公司于2019年5月提供,均在2018年8月收獲于美國(guó)愛(ài)達(dá)荷州,所有種子被獲取后均密封保存于種子庫(kù)(-20℃)內(nèi)至2020年11月試驗(yàn)進(jìn)行。
將飽滿一致的各品種種子分別置于濃度為0.5 mmol·L-1(濃度篩選見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14])的亞硒酸鈉溶液,于20℃條件下浸泡0 h(CK),3 h,6 h,9 h和12 h后,快速用蒸餾水沖洗3遍,并迅速用干濾紙吸完其種皮表面水分后于25℃黑暗條件自然風(fēng)干至含水量為10%(鮮重基礎(chǔ))左右。每個(gè)處理重復(fù)4次。
發(fā)芽條件及發(fā)芽率(Germination percentage,GP)的計(jì)算參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)公布的種子檢驗(yàn)規(guī)程(2018)[24],末次計(jì)數(shù)為第10 d,具體操作步驟參照文獻(xiàn)[25]。
粗酶液參照Kibiza等[26]的方法提取,準(zhǔn)確稱取1.0 g種子于室溫條件下用蒸餾水吸脹4 h后冰浴研磨,上清液于4℃條件保存?zhèn)溆?,每個(gè)指標(biāo)的測(cè)定均取用0.5 mL粗酶液加入3 mL反應(yīng)體系內(nèi)。SOD活性測(cè)定參照Rao和Sresty[27]的方法,CAT活性測(cè)定參照Aebi[28]的方法,APX活性測(cè)定參照Nakano和Asada[29]的方法,谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性測(cè)定參照Madamanchi和Alscher[30]的方法,MDA含量測(cè)定參照Bailly等[31]的方法,可溶性蛋白含量采用南京建成科技有限公司所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。
以Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,并用SPSS 22.0軟件對(duì)相同及不同品種紫花苜蓿種子的各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,多重比較(P<0.05)則采用Duncans法進(jìn)行,最終以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤方式表示結(jié)果。
由表1可知,除‘WL712’發(fā)芽率在引發(fā)9 h時(shí)顯著低于引發(fā)3和6 h時(shí)外(P<0.05),其他11個(gè)品種的紫花苜蓿種子發(fā)芽率則隨硒引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)并未發(fā)生顯著變化。相同引發(fā)時(shí)間下,不同品種的紫花苜蓿種子GP存在很大差異。引發(fā)0 h(CK)時(shí),‘WL354HQ’的GP顯著高于‘WL168HQ’,‘WL712’和‘偏關(guān)苜?!?P<0.05);引發(fā)3 h時(shí),‘WL354HQ’和‘WL366HQ’的GP顯著高于‘WL712’,‘WL903HQ’和‘WL440’(P<0.05);引發(fā)6 h時(shí),‘WL343HQ’和‘WL363HQ’的GP顯著高于‘WL712’(P<0.05);引發(fā)9 h時(shí),‘WL366HQ’,‘WL298HQ’和‘WL319HQ’的GP顯著高于‘WL712’和‘偏關(guān)苜?!?P<0.05);引發(fā)12 h時(shí),‘WL354HQ’的GP顯著高于‘WL656HQ’,‘WL712’和‘WL903HQ’(P<0.05)。
表1 硒引發(fā)對(duì)不同品種紫花苜蓿種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of selenium priming on germination percentage of different alfalfa varieties 單位:%
由表2可知,隨硒引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),‘偏關(guān)苜?!N子SOD活性逐漸升高;‘WL168HQ’,‘WL366HQ’和‘WL440’的SOD活性呈先升高后下降的趨勢(shì),均在引發(fā)3 h時(shí)達(dá)到最大值;其余品種的SOD活性則逐漸下降。未引發(fā)(CK)時(shí),‘WL712’,‘WL319HQ’和‘WL903HQ’的SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL168HQ’和‘偏關(guān)苜?!腟OD活性顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)3 h時(shí),‘WL712’,‘WL903HQ’和‘WL440’的SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL343HQ’的SOD活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)6 h時(shí),‘WL712’和‘偏關(guān)苜蓿’的SOD活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL343HQ’的SOD活性仍顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)9 h時(shí),‘偏關(guān)苜蓿’的SOD活性仍顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL343HQ’,‘WL366HQ’和‘WL440’的SOD活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)12 h時(shí),‘偏關(guān)苜?!腟OD活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL363HQ’,‘WL298HQ’和‘WL712’的SOD活性則顯著低于其他品種(P<0.05)。
表2 硒引發(fā)對(duì)不同品種紫花苜蓿種子SOD活性的影響Table 2 Effects of selenium priming on SOD activity of different alfalfa varieties 單位:U·mg-1 protein
由表3可知,隨硒引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),‘偏關(guān)苜?!腃AT活性逐漸升高;‘WL319HQ’,‘WL903HQ’和‘WL354HQ’的CAT活性逐漸下降,其余品種的CAT活性則呈先升高后下降的趨勢(shì),‘WL366HQ’,‘WL656HQ’和‘WL712’在引發(fā)3 h時(shí)達(dá)到最大值,而‘WL343HQ’,‘WL363HQ’,‘WL168HQ’,‘WL298HQ’和‘WL440’則在引發(fā)6 h時(shí)達(dá)到最大值。未引發(fā)(CK)時(shí),‘WL903HQ’的CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘偏關(guān)苜?!汀甒L656HQ’的CAT活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)3 h時(shí),‘WL168HQ’和‘WL366HQ’的CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘偏關(guān)苜?!腃AT活性則仍顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)6 h時(shí),‘WL168HQ’,‘WL298HQ’和‘WL440’的CAT活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘偏關(guān)苜?!腃AT活性仍顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)9 h時(shí),‘WL168HQ’和‘WL298HQ’的CAT活性仍顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL656HQ’和‘偏關(guān)苜蓿’的CAT活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)12 h時(shí),‘WL298HQ’的CAT活性仍顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL656HQ’的CAT活性則仍顯著低于其他品種(P<0.05)。
表3 硒引發(fā)對(duì)不同品種紫花苜蓿種子CAT活性的影響Table 3 Effects of selenium priming on CAT activity of different alfalfa varieties 單位:U·min-1·mg-1 protein
由表4可知,隨硒引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),‘偏關(guān)苜蓿’種子APX活性逐漸升高;‘WL298HQ’,‘WL712’,‘WL440’和‘WL354HQ’的APX活性呈先升高后下降的趨勢(shì),‘WL298HQ’在引發(fā)3 h時(shí)達(dá)到最大值,‘WL712’和‘WL440’在引發(fā)9 h時(shí)達(dá)到最大值,而‘WL354HQ’則在引發(fā)6 h時(shí)達(dá)到最大值;其余品種的APX活性則逐漸下降。未引發(fā)(CK)和3 h時(shí),‘WL319HQ’的APX活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘偏關(guān)苜?!腁PX活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)6 h時(shí),‘WL440’的APX活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL343HQ’,‘WL363HQ’,‘WL168HQ’,‘WL366HQ’和‘偏關(guān)苜?!腁PX活性均顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)9 h時(shí),‘WL440’的APX活性仍顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL366HQ’的APX活性也仍顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)12 h時(shí),‘WL440’的APX活性仍顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL168HQ’和‘WL366HQ’的APX活性則顯著低于其他品種(P<0.05)。
表4 硒引發(fā)對(duì)不同品種紫花苜蓿種子APX活性的影響Table 4 Effects of selenium priming on APX activity of different alfalfa varieties 單位:μmol·min-1·mg-1 protein
由表5可知,隨硒引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),‘WL343HQ’,‘WL363HQ’和‘WL656HQ’的GR活性逐漸下降,其余品種的GR活性則呈先升高后下降的趨勢(shì),‘WL168HQ’,‘WL712’,‘WL319HQ’,‘WL903HQ’,‘WL440’和‘WL354HQ’在引發(fā)3 h時(shí)達(dá)到最大值,而‘WL366HQ’,‘WL298HQ’,‘WL903HQ’和‘偏關(guān)苜?!瘎t在引發(fā)6 h時(shí)達(dá)到最大值。未引發(fā)(CK)時(shí),‘WL319HQ’的GR活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL168HQ’,‘WL712’,‘WL298HQ’和‘偏關(guān)苜?!腉R活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)3 h時(shí),‘WL440’的GR活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL343HQ’和‘WL363HQ’的GR活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)6 h時(shí),‘WL366HQ’的GR活性顯著高于‘WL319HQ’和‘WL903HQ’以外的品種(P<0.05),而‘WL343HQ’的GR活性仍顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)9 h時(shí),‘WL354HQ’的GR活性顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL343HQ’和‘WL363HQ’的GR活性則顯著低于其他品種(P<0.05);引發(fā)12 h時(shí),‘WL354HQ’的GR活性仍顯著高于其他品種(P<0.05),而‘WL712’的GR活性顯著低于‘WL343HQ’,‘WL168HQ’,‘WL656HQ’和‘WL903HQ’以外的品種(P<0.05)。
表5 硒引發(fā)對(duì)不同品種紫花苜蓿種子GR活性的影響Table 5 Effects of selenium priming on GR activity of different alfalfa varieties 單位:U·min-1·mg-1 protein
由表6可知,隨硒引發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),‘偏關(guān)苜?!N子的MDA含量呈先升高后下降的趨勢(shì),其余11個(gè)品種的MDA含量均呈升高的趨勢(shì)。‘偏關(guān)苜?!腗DA含量在引發(fā)3 h時(shí)達(dá)到最大值,‘WL168HQ’外的其余品種則在引發(fā)12 h時(shí)達(dá)到最大值。引發(fā)0(CK)~12 h時(shí),‘偏關(guān)苜?!腗DA含量均顯著低于其他品種(P<0.05);未引發(fā)(CK)時(shí),‘WL903HQ’,‘WL168HQ’和‘WL366HQ’的MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05);引發(fā)3 h時(shí),‘WL903HQ’的MDA含量均顯著高于其他品種(P<0.05);引發(fā)6 h時(shí),‘WL903HQ’的MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05);引發(fā)9 h時(shí),‘WL903HQ’和‘WL354HQ’的MDA含量仍顯著高于其他品種(P<0.05);引發(fā)12 h時(shí),‘WL354HQ’的MDA含量顯著高于其他品種(P<0.05)。
表6 硒引發(fā)對(duì)不同品種紫花苜蓿種子MDA含量的影響Table 6 Effect of selenium priming on MDA content of different alfalfa varieties 單位:μmol·mg-1 protein
適宜的硒處理能夠促進(jìn)植物種子的萌發(fā)及其幼苗生長(zhǎng)[3,20]。張士敏等[32]研究不同硒源及濃度對(duì)‘偏關(guān)苜?!N子萌發(fā)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。然而,本試驗(yàn)中,硒引發(fā)下12個(gè)品種的紫花苜蓿種子GP與CK相比并未發(fā)生顯著變化,這與彭琪等[33]的研究結(jié)果相似,可能是因?yàn)槲l(fā)促進(jìn)了種子內(nèi)蛋白質(zhì)、多糖及核糖等大分子貯藏物質(zhì)的分解,為其萌發(fā)過(guò)程的細(xì)胞快速分裂提供了充足的能量基礎(chǔ)和物質(zhì)保障[34]。因此,利用硒引發(fā)進(jìn)行富硒苜蓿草產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí),本試驗(yàn)中12個(gè)品種的紫花苜蓿沒(méi)有發(fā)生因田間出苗率下降而造成減產(chǎn)的現(xiàn)象。
硒被認(rèn)為是直接參與動(dòng)植物體內(nèi)抗氧化等多種代謝反應(yīng)的重要微量元素[35],適宜的硒處理能提高紫花苜蓿[14]、黑小麥[34]、遏藍(lán)菜(Thlaspiarvense)[36]及生菜(Lactucasativa)[37]等植物的抗氧化性能。本試驗(yàn)中,12個(gè)品種紫花苜蓿種子的SOD,CAT,APX及GR活性在引發(fā)3~6 h時(shí)仍保持較高活性,這可能是短時(shí)間(3~6 h)的硒引發(fā)下其SOD活性仍保持較高水平,產(chǎn)生并積累了大量的H2O2,從而誘導(dǎo)了其CAT,APX和GR活性升高[38],因而其MDA含量也增加幅度相對(duì)較小,這與低濃度的硒引發(fā)對(duì)水稻[3]、紫花苜蓿[14,19]和生菜[37]等植物抗氧化性能的影響相似。然而,植物適應(yīng)硒的生理活性范圍往往相對(duì)較窄,過(guò)量或缺乏均會(huì)對(duì)植物的生理代謝產(chǎn)生負(fù)面影響[35,38]。本試驗(yàn)中,除‘偏關(guān)苜?!?,其余11個(gè)品種的CAT,SOD,APX和GR活性在硒引發(fā)12 h時(shí)均已下降,這可能是H2O2的過(guò)量積累[3,38]以及硒非特異性地結(jié)合了蛋白質(zhì)[39],從而造成了其細(xì)胞膜系統(tǒng)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,表現(xiàn)為MDA含量均顯著高于CK(P<0.05),‘WL343HQ’,‘WL363HQ’,‘WL656HQ’,‘WL319HQ’和‘WL903HQ’尤為突出,這與水稻[3]、紫花苜蓿[14]和生菜[37]等植物的研究發(fā)現(xiàn)相似。盡管引發(fā)12 h時(shí),12個(gè)品種紫花苜蓿種子的GP均無(wú)顯著變化,但僅有‘偏關(guān)苜?!员3州^高的抗氧化能力,這可能是硒處理對(duì)紫花苜蓿種子GP無(wú)影響,卻會(huì)抑制其幼苗生長(zhǎng)的原因[33],因而說(shuō)明不同品種紫花苜蓿種子的耐硒能力存在很大差異[2],除‘偏關(guān)苜?!獾淖匣ㄜ俎F贩N已不適宜繼續(xù)進(jìn)行硒引發(fā)。代惠萍等[40]也發(fā)現(xiàn),不同品種紫花苜蓿葉片SOD,CAT,APX和POD活性存在顯著差異,‘大葉苜?!目寡趸芰ψ罡?,而‘維多利亞’最差,這與本試驗(yàn)現(xiàn)象類似。因此,不同品種紫花苜蓿的抗氧化能力對(duì)硒引發(fā)的響應(yīng)存在差異,在其富硒生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)謹(jǐn)慎選擇品種,本試驗(yàn)研究對(duì)象中以‘偏關(guān)苜?!贩N最適宜用于富硒苜蓿產(chǎn)品的生產(chǎn)。
外源硒引發(fā)對(duì)12個(gè)品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽率基本無(wú)顯著影響,但對(duì)其抗氧化能力的影響存在明顯差異。短時(shí)間(3~6 h)硒引發(fā)時(shí),大多數(shù)紫花苜蓿種子保持較高的抗氧化能力,而除‘偏關(guān)苜?!?,其余11個(gè)品種的抗氧化能力均在長(zhǎng)時(shí)間(12 h)硒引發(fā)時(shí)顯著降低(P<0.05),因而‘偏關(guān)苜蓿’最適宜采用引發(fā)技術(shù)進(jìn)行富硒草產(chǎn)品生產(chǎn),而‘WL343HQ’,‘WL363HQ’,‘WL656HQ’,‘WL319HQ’和‘WL903HQ’則最不適宜。