日本對(duì)蝦Bcl-2基因的cDNA克隆與抗寒功能研究

邵慧鑫 任憲云, 于振興 李 健, 劉 萍,

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266237)

日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)俗稱車蝦、斑節(jié)蝦、花蝦, 隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、對(duì)蝦科(Penaeidae)、囊對(duì)蝦屬(Marsupenaeus), 在中國(guó)沿海地區(qū)廣泛分布[1], 其中, 福建、臺(tái)灣和廣東沿海地區(qū)資源豐富[2]。日本對(duì)蝦屬亞熱帶物種, 適宜生存溫度為25—29℃, 水溫高于32℃時(shí)生長(zhǎng)受到限制,8—10℃時(shí)攝食減少, 5℃以下開始死亡[3]。北方池塘一般一年兩季養(yǎng)殖日本對(duì)蝦, 第 1 季4月底投放蝦苗, 在 7 月中下旬收獲; 第 2 季在6月底投放蝦苗, 在 11 月初收獲, 養(yǎng)殖周期為6個(gè)月, 低溫成為影響日本對(duì)蝦養(yǎng)殖周期的重要因素。

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡(Intrinsic apoptotic) 又被稱為細(xì)胞凋亡的線粒體途徑, 通常由細(xì)胞毒性刺激物或環(huán)境脅迫因子等刺激激活[4]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi),Bcl-2 家族 (B-cell lymphoma 2 family) 在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮著重要的作用, 其調(diào)控線粒體外膜通透性 (Mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP) 的上升, 導(dǎo)致一系列的線粒體蛋白(例如細(xì)胞色素 C、Endo G、SMAC/Diablo 和 AIF等) 向細(xì)胞質(zhì)中釋放[5,6], 細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素 C 在ATP的幫助下和凋亡酶激活因子 1 (Apoptotic proease activating factor 1, Apaf-1) 結(jié)合, 形成多聚體, 該多聚體與 Caspase-9 前體結(jié)合形成凋亡復(fù)合體 (Apoptosome), 進(jìn)而激活 Caspase-9[7], 被激活的 Caspase-9 通過自我剪切活化過程, 在 dATP和ATP 的幫助下成功激活 Caspase-3, 從而導(dǎo)致內(nèi)源性凋亡通路被激活[8]。

Bcl-2 家族由凋亡調(diào)節(jié)因子 Bcl-X 及其同系物組成[9], 目前已發(fā)現(xiàn)25 個(gè)成員[10]。Bcl-2 家族的顯著特征是具有BCL同源結(jié)構(gòu)域[11]。Bcl-2 家族基因根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為兩類: 一類為抑凋亡基因(例如Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-W), 另一類為促凋亡基因(例如Bax、Bok、Bad和Bid)[12]。Bcl-2 家族抑凋亡基因和促凋亡基因的表達(dá)平衡是細(xì)胞發(fā)生正常凋亡現(xiàn)象最重要的原因[13]。Guo等[14]發(fā)現(xiàn)刺參(Apostichopus japonicus)Bcl-2基因通過阻止體腔細(xì)胞中細(xì)胞色素C的釋放來抑制細(xì)胞凋亡, 從而介導(dǎo)海參中的病菌感染。Cao等[15]研究表明慢性氟暴露下, Bcl-2 家族基因參與鯉(Cyprinus carpio) 肝臟的免疫應(yīng)答過程。Xue等[16]研究稱氨脅迫下鯉肝胰腺的凋亡可能是由氧化應(yīng)激通過p53-Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路介導(dǎo)的。大量研究表明, Bcl-2 家族基因?qū)S持水生動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。而在甲殼動(dòng)物中, 對(duì)于Bcl-2 家族基因的研究較少。因此, 探究日本對(duì)蝦凋亡通路相關(guān)基因很有必要。

本實(shí)驗(yàn)以線粒體凋亡通路中的Bcl-2基因作為研究對(duì)象, 通過探究凋亡通路上的相關(guān)基因在低溫脅迫環(huán)境條件下的表達(dá)規(guī)律及其產(chǎn)物間的相互作用, 進(jìn)而闡述其主要功能, 為培育日本對(duì)蝦耐低溫新品種, 推動(dòng)產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用健康日本對(duì)蝦[體重: (14.24±1.12 g)]取自山東省昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。對(duì)蝦在200 L的PVC桶中經(jīng)7d適應(yīng)性暫養(yǎng), 暫養(yǎng)水溫28℃、鹽度28、pH 8.0。暫養(yǎng)期間持續(xù)充氧, 每天早晚定時(shí)投喂2次并更換1/3的海水, 以保持水質(zhì)良好。

1.2 日本對(duì)蝦Bcl-2基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

從日本對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)里查找、篩選得到Bcl-2基因的序列, 使用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物(表 1)。利用巢氏PCR擴(kuò)增法對(duì)Bcl-2基因進(jìn)行克隆。將獲得的 PCR 產(chǎn)物切膠回收、載體連接并轉(zhuǎn)化、菌落 PCR鑒定、送樣測(cè)序。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.3 日本對(duì)蝦Bcl-2基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)日本對(duì)蝦Bcl-2基因進(jìn)行序列分析(表 2)。

表2 生物信息學(xué)所用網(wǎng)址及軟件Tab. 2 URLs and software for bioinformatics analysis

1.4 低溫脅迫

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)溫度梯度: 10℃、16℃、22℃和28℃。降溫實(shí)驗(yàn)在200 mm×300 mm×170 mm的水族缸中進(jìn)行, 水體體積為9 L。使用冷凝機(jī)(GRTEHXB10N, 格瑞特節(jié)能設(shè)備有限公司)調(diào)節(jié)水溫, 各個(gè)溫度組經(jīng)過12h, 由28℃同時(shí)降至所設(shè)置的溫度,每組3個(gè)平行, 每個(gè)平行20尾蝦。在低溫脅迫前(0)和低溫脅迫 3h、24h和72h后取日本對(duì)蝦的鰓和肝胰腺置于液氮中速凍, 用于基因的表達(dá)分析。

1.5 siRNA干擾

本實(shí)驗(yàn)所用到的siRNA均由上海生工用化學(xué)方法進(jìn)行合成, 為確保合成siRNA具有較好的干擾效果, 用Bcl-2基因設(shè)計(jì)合成3對(duì)siRNA, 設(shè)計(jì)的雙鏈siRNA有以下特征: 正向鏈 21堿基是在19個(gè)堿基的靶序列加上3′端2懸頭TT的堿基; 反向鏈21堿基是19個(gè)與正向鏈互補(bǔ)的堿基, 3′端加2個(gè)堿基的懸頭TT。合成的RNA oligo劑型為凍干粉。

本研究在siRNA干擾后在10℃ 和28℃兩個(gè)溫度梯度中進(jìn)行溫度實(shí)驗(yàn), 每個(gè)溫度梯度分為兩組,分別為RNAi組和NC處理組。將日本對(duì)蝦按量均勻分組, 在對(duì)蝦的第四尾節(jié)處按照1 μg/g蝦的量進(jìn)行siRNA的注射, 對(duì)照組注射NC陰性對(duì)照(無意義的雙鏈) , 分別在脅迫后的3h、12h和48h(取48h時(shí)要在24h再注射一次) 取9尾日本對(duì)蝦鰓組織并編號(hào)保存于液氮中用于RNA提取。

1.6 日本對(duì)蝦Bcl-2基因的表達(dá)分析

參照TransZolUp Plus RNA Kit試劑盒(全式金公司)說明書提取總RNA, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用Evo M-MLVRT Mix Kit (艾科瑞公司)進(jìn)行模板制備, 具體步驟參照說明書, 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于日本對(duì)蝦Bcl-2基因的表達(dá)特征分析。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Bcl-2基因進(jìn)行組織表達(dá)分析, 檢測(cè)不同溫度、不同時(shí)間下的日本對(duì)蝦鰓和肝胰腺中Bcl-2基因的表達(dá)量, 實(shí)驗(yàn)所用引物見表 1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過使用Applied BiosystemsTM7500 Real Time PCR instrumen定量?jī)x完成。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照SYBR?GreenPro TaqHS 預(yù)混型qPCR試劑盒Ⅱ(艾科瑞公司)。反應(yīng)完成后, 采用 Excel[17]進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 并用2???Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量, 使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著。

1.7 TUNEL檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)所用TUNEL試劑盒購(gòu)自羅氏公司, 具體方法參照試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)步驟如圖 1所示。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2基因的cDNA全長(zhǎng)及序列同源性分析

實(shí)驗(yàn)獲得的日本對(duì)蝦Bcl-2基因(GenBank登錄號(hào)MW000345) cDNA全長(zhǎng)為2432 bp, 其中ORF為726 bp, 共編碼241個(gè)氨基酸, 5′UTR長(zhǎng)度為269 bp,3′UTR長(zhǎng)度為1437 bp, 并且含有典型的加尾信號(hào)aataaa。3′UTR包含一個(gè)30 bp的polyA序列。預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)為5.90, 分子量為26.80 kD, 且不穩(wěn)定系數(shù)為63.87, 推測(cè)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。SMART和Signal4.1 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,MjBcl-2基因具有Bcl-2基因家族的典型特征, 即存在BCL 結(jié)構(gòu)域, 并且在 C 端有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。Blast在線軟件比對(duì)結(jié)果顯示, 日本對(duì)蝦Bcl-2氨基酸序列與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei) 的同源性最高為76%。使用MEGA 6.0 軟件對(duì)日本對(duì)蝦Bcl-2基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖 1), 與凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦 (Penaeus monodon) 聚為一支, 親緣關(guān)系較近, 而與其他脊椎動(dòng)物等進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 2)。

圖1 TUNEL檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟Fig. 1 TUNEL test steps

圖2 日本對(duì)蝦Bcl-2氨基酸序列 NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 NJ Phylogenetic tree of Bcl-2 amino acid sequence of M. japonicus

2.2 日本對(duì)蝦Bcl-2基因的組織表達(dá)分析

對(duì)日本對(duì)蝦眼柄、鰓、肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸和血細(xì)胞組織, 進(jìn)行Bcl-2基因的熒光定量檢測(cè), 結(jié)果表明,Bcl-2基因在所檢測(cè)8個(gè)組織中均有不同水平的表達(dá), 其中在肌肉中表達(dá)量最高, 然后依次是鰓、眼柄、肝胰腺、腸、胃、血細(xì)胞和心臟中表達(dá)量最低。

2.3 日本對(duì)蝦Bcl-2基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析

日本對(duì)蝦在低溫脅迫后Bcl-2基因表達(dá)情況如圖 3所示, 不同溫度脅迫后,Bcl-2基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化。在10℃和16℃脅迫下, 鰓和肝胰腺中的Bcl-2基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì), 72h時(shí)到達(dá)峰值, 在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05); 22℃脅迫下Bcl-2基因表達(dá)水平與對(duì)照組比無顯著差異。

圖3 日本對(duì)蝦Bcl-2基因在各組織中的表達(dá)Fig. 3 Distribution of Bcl-2 gene expression in different tissues of M. japonicus

2.4 siRNA干擾后的低溫脅迫實(shí)驗(yàn)

對(duì)Bcl-2基因進(jìn)行干擾, 在低溫脅迫后,Bcl-2基因和Caspase-3基因的表達(dá)在鰓組織中均發(fā)生了明顯變化(圖 4)。在Bcl-2基因被干擾后下調(diào)表達(dá)時(shí),Caspase-3基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05; 圖 5)。由此推測(cè),Bcl-2基因?qū)aspase-3基因有調(diào)控作用,為負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。

圖4 日本對(duì)蝦鰓和肝胰腺Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量隨低溫脅迫時(shí)間的變化Fig. 4 Relative expression of Bcl-2 gene in gill and hepatopancreas of M. japonicus under low temperature stress

圖5 RNA干擾后MjBcl-2在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression of MjBcl-2 in gill tissue after RNA interference

2.5 TUNEL檢測(cè)結(jié)果

TUNEL結(jié)果顯示, 在28℃處理組中只有少量凋亡細(xì)胞, RNAi組和NC組隨著溫度的降低, 凋亡細(xì)胞數(shù)量不斷增加。28℃ RNAi組與NC組凋亡細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯的數(shù)量變化, 而在10℃低溫處理組中, 可以看到, RNAi組凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯高于NC處理組(圖 6A)。圖 6B為鰓細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果, 在12h后, 28℃ NC組、28℃ RNAi組、10℃ NC組和10℃ RNAi組細(xì)胞凋亡率分別為1.73%、2.35%、21.59%和33.70%(圖 7)。

圖6 RNA干擾后MjCaspase-3在鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expression of MjCaspase-3 in gill tissue after RNA interference

圖7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Cell apoptosis detection result

3 討論

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要通路, 在維持機(jī)體正常生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用, 哺乳動(dòng)物的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答[18,19]。本研究通過RACE技術(shù)成功克隆得到了日本對(duì)蝦MjBcl-2cDNA序列全長(zhǎng)2432 bp, 其中, ORF為726 bp, 共編碼241個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)結(jié)果表明,MjBcl-2具有與其他無脊椎動(dòng)物高度相似的保守的 Bcl 結(jié)構(gòu)域。MjBcl-2氨基酸序列與凡納濱對(duì)蝦的同源性最高為76%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示, 日本對(duì)蝦MjBcl-2基因與凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦聚為一支, 與擬穴青蟹 (Scylla paramamosain)聚為一類, 說明日本對(duì)蝦MjBcl-2基因在進(jìn)化上是一個(gè)高度保守的基因, 與王磊等[20]對(duì)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Bcl-2基因研究的結(jié)果一致。

研究某基因功能的基本手段之一是了解該基因在不同組織器官中的表達(dá)模式[21]。熒光定量PCR結(jié)果顯示,MjBcl-2基因在日本對(duì)蝦各個(gè)組織中均有表達(dá), 肌肉中表達(dá)量最高, 其次為鰓, 心臟中表達(dá)量最低。在甲殼動(dòng)物中, 鰓作為重要的免疫器官,在非特異性免疫過程中發(fā)揮著重要的作用[22]。MjBcl-2在鰓組織中高表達(dá), 表明其參與了日本對(duì)蝦的免疫調(diào)控過程。為驗(yàn)證MjBcl-2是否參與了日本對(duì)蝦溫度脅迫過程, 進(jìn)行了低溫脅迫實(shí)驗(yàn), 并檢測(cè)了日本對(duì)蝦在低溫脅迫后不同時(shí)間點(diǎn)在鰓和肝胰腺組織中mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 低溫脅迫后,Bcl-2基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化。在10℃和16℃脅迫下, 鰓和肝胰腺中的Bcl-2基因的表達(dá)水平逐漸上升, 在72h到達(dá)峰值, 在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05); 22℃脅迫下Bcl-2基因表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著差異。因此, 推斷MjBcl-2基因參與了日本對(duì)蝦溫度脅迫過程。該結(jié)果與細(xì)菌感染后, 暗紋東方鲀 (Takifugu obscurus) 肝臟中Bcl-2mRNA呈先上升后下降趨勢(shì)[23]; 草魚 (Ctenopharyngodon idella)Bcl-2基因在應(yīng)對(duì)鎘脅迫的過程中表達(dá)量顯著上調(diào) (P<0.05)[24]的結(jié)果相似。凡納濱對(duì)蝦在低溫應(yīng)激1.5h后, 抗凋亡基因LvBcl-2上調(diào)(0.69倍,P<0.01)[25], 與MjBcl-2在受到低溫脅迫后的結(jié)果較相似。因?yàn)槠渑c日本對(duì)蝦在進(jìn)化關(guān)系上聚為一支, 推測(cè)在甲殼動(dòng)物中Bcl-2基因在受到相同刺激后的表達(dá)模式具有相似性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證日本對(duì)蝦MjBcl-2基因的功能機(jī)制, 利用 RNA 干擾技術(shù)對(duì)MjBcl-2基因進(jìn)行沉默,在低溫脅迫后, 分別檢測(cè)了日本對(duì)蝦Bcl-2和caspase-3基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn), 當(dāng)對(duì)Bcl-2基因進(jìn)行干擾時(shí), 日本對(duì)蝦鰓組織中的Bcl-2基因呈下調(diào)表達(dá),而caspase-3基因呈上調(diào)表達(dá), 與張?jiān)茷I等[12]在三疣梭子蟹中的干擾Bcl-2基因, 進(jìn)而影響凋亡通路相關(guān)基因的結(jié)果一致。有研究表明, 在氨脅迫下鯉肝胰腺的凋亡可能是由氧化應(yīng)激通過p53-Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路介導(dǎo)的[16]。推測(cè)日本對(duì)蝦Bcl-2基因也可能調(diào)控caspase-3基因, 但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

利用TUNEL技術(shù), 檢測(cè)了MjBcl-2基因被干擾后, 日本對(duì)蝦鰓組織中細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示,在日本對(duì)蝦MjBcl-2基因被干擾后, 鰓組織中細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯增加, 與刺參Bcl-2基因在被敲除后體腔細(xì)胞凋亡率顯著增加[14]的結(jié)果相同。這說明,日本對(duì)蝦MjBcl-2基因參與了細(xì)胞凋亡過程。在本研究中, 與正常溫度相比, 低溫脅迫下的干擾組凋亡細(xì)胞要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組, 猜測(cè)MjBcl-2基因被干擾后, 鰓組織中的識(shí)別機(jī)制遭到破壞, 凋亡細(xì)胞無法及時(shí)清除, 在鰓組織內(nèi)逐漸積累。

4 結(jié)論

細(xì)胞凋亡是由一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控所控制的自主死亡過程, 其在機(jī)體免疫和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著非常重要的作用[26—28]。Bcl-2 家族基因是影響線粒體凋亡途徑的重要因素之一, 其中Bcl-2基因極其重要, 作用主要是抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[29]。Caspase 蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用, 它們是細(xì)胞凋亡過程中的具體執(zhí)行者, 通過接受外界信號(hào),以此來完成對(duì)特定蛋白底物的水解, 從而使細(xì)胞凋亡[30]。本實(shí)驗(yàn)表明日本對(duì)蝦MjBcl-2基因可能參與了溫度脅迫下的細(xì)胞凋亡過程, 至于具體的調(diào)控過程, 目前尚不完全清楚。推測(cè)當(dāng)日本對(duì)蝦受到溫度脅迫時(shí), 其體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)通過傳導(dǎo)信號(hào), 引起相關(guān)信號(hào)通路的變化,對(duì)外界刺激進(jìn)行應(yīng)對(duì)。在今后的工作當(dāng)中, 通過對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的研究, 探究日本對(duì)蝦Bcl-2具體功能, 為培育日本對(duì)蝦耐低溫新品種提供理論基礎(chǔ)。