基于網絡藥理學探索當歸治療抑郁癥的作用機制*

李 碩，閆馨芝，李 響，俱 蓉，靳子明，王智勇，竇 霞△

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730000；4.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；6.甘肅省中藥現(xiàn)代制藥工程研究院有限公司，甘肅 蘭州 730000）

隨著生活節(jié)奏的加快，抑郁患者逐年增加，2015年抑郁障礙被估計為全世界第三大致殘原因[1]，據不完全統(tǒng)計，2019年全球已有超過3.4億的抑郁癥患者，預計2020年中國的抑郁癥發(fā)病率將增至7.35%[2]。抑郁癥具有患病率高、治療率低及復發(fā)率高的特點，但目前對抑郁癥的生理、病理研究不完全明確，古代文獻有“郁”“癲證”“臟躁”“郁證”“不寐”“百合病”“奔豚”等記載[3]，認為抑郁癥是腎陽不足、肝郁導致耗血使神失所養(yǎng)、肺氣失調引起[4-6]。中醫(yī)認為抑郁癥應定位于膽，可分為多型[7-8]，臨床醫(yī)學有去甲腎上腺素受體、5-HT受體、多巴胺受體、乙酰膽堿受體、小丘腦-垂體-腎上腺素軸等學說。目前臨床常用5-羥色胺再攝取制劑（SSRI）等，主要通過興奮神經系統(tǒng)發(fā)揮抗抑郁作用，但研究發(fā)現(xiàn)SSRI對患者的代謝功能、凝血功能等都有明顯的損害[9]，療效不佳、副作用大。近年來臨床試驗表明，利用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結合治療抑郁癥取得了明顯的效果，降低西藥的不良反應，提高患者的治愈率和生活質量[10]。治療抑郁癥常用的方劑有無憂湯緩解患者膽氣怯弱、夜不能寐的癥狀；逍遙散調和肝脾、疏肝解郁、養(yǎng)血健脾；當歸芍藥散養(yǎng)血調肝、健脾利濕[11-13]。中醫(yī)藥副作用小、不易產生依賴性，在抑郁癥等精神疾病的干預治療方面具有較大的潛力。

當歸作為十大隴藥之一，為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diel的干燥根，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功效[14]?，F(xiàn)代研究表明，當歸提取物具有舒張兔離體的十二指腸平滑肌、促進造血細胞的增殖分化、抑制前列腺增生、上調神經生長因子和腦源性神經營養(yǎng)因子、抑制鈣離子內流、阻斷Cyt C釋放、抑制人肺腺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2。且在中樞神經系統(tǒng)的藥理作用明顯，目前集中于抗阿爾茲海默癥和腦中風上的研究[15]，但對于抗抑郁癥的研究目前未得到重視。根據郭棟[16]的統(tǒng)計顯示，在治療抑郁癥方面當歸的應用僅次于茯苓、甘草，出現(xiàn)的頻率為35.91%。現(xiàn)代藥理學研究表明當歸在治療抑郁癥時能促進海馬組織再生、調節(jié)單胺類神經遞質系統(tǒng)、清除氧自由基、保護神經細胞、調節(jié)細胞因子含量、減輕細胞因子的炎癥癥狀[17]。

網絡藥理學不同于一般的藥理學研究，其研究不僅局限于單基因單靶點的研究，更側重于多基因多靶點的研究[18]。網絡藥理學的研究符合中藥的整體觀，強調多靶點調節(jié)信號通路，提高藥物治愈率，降低毒副作用[19]。Pei等[20]利用TCMSP數(shù)據庫發(fā)現(xiàn)驅白巴布期片治療白癜風的機制；陳建麗等[21]利用TCMSP研究復方柴歸湯對抑郁癥的機制；Chen等[22]利用PharmMapper研究丹參酮IIA的作用機制。目前關于網絡藥理學常用的數(shù)據庫和軟件有TCMSP、TCMID、GEO、Uniprot、Gene Cards等數(shù)據庫；DAVID生物信息平臺、STRING在線軟件、Ctyoscape軟件等。

本研究利用網絡藥理學的方法及技術手段，探索當歸治療抑郁癥的作用機制，有利于提高新藥臨床試驗的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費用，為當歸的臨床應用提供參考依據。

1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、Uniprot數(shù)據庫（https://www.uniprot.org/）、Gene Cards 數(shù)據庫（https://www.genecards.org/）、Rx64 3.6.3軟件、Cytoscape_v 3.7.2軟件、String在線數(shù)據庫（https://string-db.org/）。

2 方法

2.1 當歸活性成分的收集、篩選

在TCMSP中檢索當歸的活性成分，以生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.05為條件進一步篩選活性成分。

2.2 靶點的挖掘及基因名查找

在TCMSP中檢索當歸活性成分的靶點。利用Uniprot數(shù)據庫查找當歸活性成分作用靶點的基因名并刪除Uniprot數(shù)據庫中不存在的基因信息。利用Gene Cards:The Human Gene Database數(shù)據庫挖掘抑郁癥的靶點信息。

2.3 交集靶點和可視化處理

利用R x64 3.6.3軟件中的Venn Diagram將當歸作用的靶點和抑郁癥相關基因取交集，得到當歸抗抑郁的潛在靶點，繪制當歸—抑郁癥靶點的venn圖；將當歸的活性成分及交集靶點信息輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建包含當歸活性成分及交集靶點的網絡，節(jié)點代表活性成分、靶點基因及蛋白質等；節(jié)點與節(jié)點之間的連接代表相互作用。

2.4 蛋白互作網絡（PPI網絡）的構建

利用String在線數(shù)據庫中交集靶點基因的相關蛋白構建蛋白互作網絡，物種設定為“人”，其余參數(shù)保持默認值，得到PPI網絡圖并根據網絡中連線查找核心基因。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用Rx64 3.6.3軟件對交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，保存結果。設定閾值P＜0.05，篩選排名前20的生物過程和通路，得到富集分析的柱狀圖、氣泡圖及通路圖。

3 結果

3.1 當歸活性成分

通過TCMSP數(shù)據庫以OB≥30%、DL≥0.05篩選檢索得到當歸的27個活性成分，結果見表1。

表1 當歸的活性成分及靶點信息

續(xù)表1

3.2 當歸活性成分作用靶點及相應基因名稱

在TCMSP數(shù)據庫中搜索當歸，并獲得當歸的靶點，利用Uniprot數(shù)據庫查找當歸活性成分作用靶點的注釋，結果見表2。

表2 當歸的作用靶點及靶點注釋

3.3 抑郁癥靶點的挖掘

利用Gene Cards得到抑郁癥的靶點共11 478個。

3.4 當歸治療抑郁癥的網絡藥理學分析

3.4.1 當歸活性成分-抑郁癥靶點的交集

利用R軟件共得到47個當歸和抑郁癥的共同靶點。包括GABRA1、CHRM3、CHRM2、PTGS2、SLC6A2、MAOB、NCOA2、PTGS1等，交集基因的venn圖，見圖1。

圖1 當歸和抑郁癥的交集基因

3.4.2 當歸-抑郁癥調控網絡的構建

構建當歸活性成分—靶點的調控網絡含337個節(jié)點，47個交集靶點節(jié)點，26個化合物節(jié)點，264條相互作用節(jié)點。調控網絡圖見圖2。

圖2 當歸活性成分—靶點網絡圖

3.4.3 蛋白互作網絡（PPI網絡）的構建

根據蛋白質之間相互作用關系，構建PPI網絡。通過網絡中基因蛋白之間的連線可得出蛋白之間的相互作用關系及作用大小，基因蛋白用點表示，蛋白之間存在互作關系、蛋白之間存在共表達、蛋白之間存在同源性、基因融合、基因臨界。根據網絡中基因臨接的數(shù)目可以判斷出處于核心地位的基因蛋白，并得到基因蛋白的臨接順序，見表3，圖3—圖4。

圖3 PPI網絡視圖

圖4 PPI網絡核心基因

表3 PPI網絡中基因排名

根據蛋白互作網絡核心基因包括ACHE、ADRA2A、MAOA、SLC6A4等，其中ACHE的度值較大，與19個基因存在相互作用關系。

3.4.4 GO功能富集分析

以P=0.05、q=0.05為統(tǒng)計學的篩選條件進行GO功能富集分析，根據校正的P值列出前20條GO途徑。得到富集分析后的柱狀圖和氣泡圖，圖中顏色越深代表校正后的P值越??；氣泡圖中圓圈的大小代表富集在基因中的數(shù)目。

根據GO富集分析的結果顯示當歸主要影響：G蛋白偶聯(lián)的胺受體、陽離子同向轉運體、激素受體、核激素受體及死亡受體等83個受體活性，達到治療抑郁癥的目的，見表4，圖5。

圖5 GO功能分析氣泡圖

表4 GO功能富集分析結果

3.4.5 KEGG通路富集分析

以P=0.05、q=0.05為統(tǒng)計學的篩選條件進行KEGG通路富集分析，根據校正的P值列出前20條KEGG通路?？梢缘玫礁患治龊蟮闹鶢顖D、氣泡圖和通路圖，通路圖中每個節(jié)點代表蛋白或基因或與基因相關的酶，箭頭代表上下游的關系，顏色的節(jié)點代表在調控網絡中出現(xiàn)的蛋白。根據KEGG通路富集分析的結果顯示影響間隙連接、細胞凋亡及內分泌抵抗力等19個信號通路，達到治療抑郁癥的目的，見表5，圖6—圖7。

圖6 KEGG功能分析氣泡圖

圖7 KEGG通路圖

表5 KEGG通路富集分析結果

4 討論

當歸屬中醫(yī)補血藥，具有補血活血、潤腸通便等功效，其復方用于治療抑郁癥和預防抑郁癥，具有良好的臨床療效。本研究基于疾病-基因-靶點-藥物的研究思路，應用網絡藥理學的技術，從分子的角度對當歸抗抑郁的作用機制進行闡述，為當歸抗抑郁作用機制的進一步研究提供參考。

本研究篩選得到當歸的27個活性成分，其中26個成分具有潛在的抗抑郁作用。研究表明阿魏酸可為海馬組織再生提供條件，具有明顯的抗抑郁效果。PPI網絡分析顯示當歸中側柏烯度值最大為19，豆固醇度值為16，洋川芎內酯C、D、E度值也較大，表明這18個活性成分可能是當歸治療抑郁癥的核心物質，分析結果見表6。

表6 活性成分及其度值

當歸化合物-靶點網絡顯示當歸抗抑郁具有多成分、多靶點及多途徑的特點，本研究顯示26種當歸活性成分具有抗抑郁的效果，其中部分成分的作用機制已逐漸明晰，如阿魏酸可促進兒茶酚胺（腎上腺素、多巴胺、去甲腎上腺素）結合[23]，增加了小鼠大腦海馬和額葉皮層中的單胺類神經遞質水平，在較高劑量的阿魏酸處理后，在下丘腦中也發(fā)現(xiàn)5-羥色胺和去甲腎上腺素增加[24]，Chen等研究也表明阿魏酸增加了小鼠大腦海馬和額葉皮層中的單胺類神經遞質水平，在較高劑量的阿魏酸處理后，在下丘腦中也發(fā)現(xiàn)5-羥色胺和去甲腎上腺素增加。阿魏酸治療后小鼠海馬和額葉皮質中5-HIAA/5-HT比值降低，這阿魏酸使說明神經遞質代謝減慢，減輕抑郁癥的發(fā)生；藁本內酯和樟腦酸均可促進陰離子跨膜轉運，增加血液中陰離子濃度，興奮副交感神經，可改善無力、易怒、抑郁及焦慮等[25]；吳倩等[26]研究表明藁本內酯對谷氨酸損傷的PC12細胞有顯著的保護作用，該保護作用與抑制細胞內鈣離子內流有關，證明了當歸抗抑郁的作用與鈣離子通路有關；2,6-二（苯基）噻喃-4-硫酮可促進雌激素受體的結合，提高雌激素水平，促進多巴胺的釋放，調節(jié)單胺類神經系統(tǒng)，進而調節(jié)情緒相關環(huán)路的穩(wěn)態(tài)，在劉亞敏等[27]的研究中，發(fā)現(xiàn)當歸水提液可顯著增加小鼠海馬組織5-HT和NE、DA、BDNF的含量的含量，側面證明當歸抗抑郁的機制與其提高海馬組織中單胺類神經遞質的含量有關；2-戊?；郊姿峥纱龠M鈣信號通路，抑制鈣離子內流，增強血液中的鈣離子濃度，降低精神緊張，同樣證明了當歸抗抑郁機制與鈣離子通道密切相關；洋川芎內酯、藁本內酯及豆固醇作用于神經活性配體-受體相互作用通路，可與γ-氨基丁酸受體結合，促進神經活性配體-受體相互作用，為海馬組織再生提供條件，Z-藁本內酯的主要代謝物質為洋川芎內酯Ⅰ，Z-藁本內酯及洋川芎內酯Ⅰ可對于過氧化氫所致的PC12細胞損傷有顯著的保護作用[28-29]；菖蒲二烯促進血管平滑肌收縮，升高血壓，引起神經末梢釋放去甲腎上腺素；7,10-十五碳二炔酸可促進花生四烯酸的代謝，降低花生四烯酸的含量，降低大腦超負荷[30-32]。

富集分析結果顯示當歸與激素受體、核激素受體及死亡受體等83個受體活性有關；影響間隙連接、細胞凋亡及內分泌抵抗力等19個信號通路。表明當歸治療抑郁癥可能促進兒茶酚胺（腎上腺素、多巴胺、去甲腎上腺素）釋放、升高激素水平以及增加陰離子濃度；抑制鈣離子內流、血壓升高、花生四烯酸的含量降低以及增強神經活性配體-受體相互作用等。

本研究僅從網絡藥理學的角度對當歸抗抑郁的活性成分和可能的作用機制進行初步的推測，在抗抑郁的作用機制方面部分與其他實驗研究一致。但是沒有將當歸活性成分的靶點與抑郁癥的靶點進行系統(tǒng)地網絡藥理學分析，對以后的研究有一定的局限性，部分結論未進行藥理學實驗驗證，應結合具體疾病進一步進行試驗分析，以確保其準確性和科學性，為抑郁癥的治療提供最佳方案。