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    微生物γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶分子改造合成γ-谷氨?;衔锏难芯窟M展

    2022-08-30 07:48:36楊娟廖劍洪郭晶董浩曾曉房白衛(wèi)東梁景龍
    中國調(diào)味品 2022年9期

    楊娟,廖劍洪,郭晶,董浩,曾曉房,白衛(wèi)東,梁景龍*

    (1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院,廣州 510225;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣州 510225)

    γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT,E.C.2.3.2.2)廣泛存在于動物、植物和微生物中,主要參與谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)的代謝循環(huán),催化谷胱甘肽中的γ-谷氨酰殘基轉(zhuǎn)移至其他受體氨基酸或者肽類物質(zhì)中,同時釋放出半胱氨酸-甘氨酸肽,利于谷胱甘肽的分解代謝[1]。近年來,多種微生物源GGT被報道能夠以谷氨酰胺和一些氨基酸、乙胺為底物,催化γ-谷氨酰肽、茶氨酸等γ-谷氨酰化合物的合成。這些產(chǎn)物中如γ-谷氨酰二肽、γ-谷氨酰含硫化合物等具有良好的鮮味、厚味,已被用于食品添加劑工業(yè)中;谷胱甘肽、茶氨酸和γ-谷氨酰-D-色氨酸等化合物具有一定的藥用價值,可作為藥物或者保健品而廣受關(guān)注[2-3]。隨著γ-谷氨酰肽及其衍生物應(yīng)用研究的深入,越來越多的學(xué)者開始致力于從不同微生物中提取和純化出多種GGT,用于酶法合成γ-谷氨酰化合物。

    目前已有多種微生物的GGT被報道,如大腸桿菌(Escherichiacoli,EcGGT)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis,PmGGT)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,HpGGT)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,BsGGT)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis,BlGGT)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens,BaGGT)等。其中,EcGGT和芽孢桿菌源GGT已經(jīng)被用于多種γ-谷氨?;衔锏暮铣?。但是,野生型GGT存在難以分離純化、酶活力較低等問題,阻礙了GGT的工業(yè)化進程,同時也制約了γ-谷氨酰肽的大規(guī)模生產(chǎn)。因此,研究人員利用現(xiàn)代生物技術(shù)對野生型GGT進行異源表達(dá)和分子改造,以期提高GGT的產(chǎn)率、酶活和催化特性。本文對微生物來源GGT的催化特性、異源表達(dá)和分子改造等進行綜述,以期為推動GGT合成γ-谷氨?;衔锏墓I(yè)化提供理論參考。

    1 GGT的催化特性

    GGT在微生物體內(nèi)以異源二聚體形式發(fā)揮作用,該酶屬于N-末端親核氨基水解酶類。GGT僅對含γ-谷氨酰殘基的化合物(如谷胱甘肽、谷氨酰肽、γ-谷氨酰-對硝基苯胺等)有專一特性,催化過程涉及“Ping-Pong”機制,即GGT與γ-谷氨酰殘基化合物結(jié)合,形成γ-谷氨酰-GGT中間產(chǎn)物,隨后再與γ-谷氨酰受體作用釋放出酶,合成γ-谷氨?;衔颷4-5]。

    由圖1可知,根據(jù)受體的不同,GGT可催化以下3種反應(yīng):①轉(zhuǎn)肽反應(yīng):當(dāng)受體是氨基酸(或二肽)時,形成γ-谷氨酰肽;②水解反應(yīng):當(dāng)γ-谷氨酰受體是水時,形成谷氨酸;③自轉(zhuǎn)肽反應(yīng):當(dāng)中間產(chǎn)物與供體γ-谷氨酰化合物進一步作用時發(fā)生自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。3種反應(yīng)中以催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)為主,對堿性氨基酸和芳香族氨基酸的親和力最高[6];水解反應(yīng)較為少見,通常在一定條件下,反應(yīng)體系中不存在除γ-谷氨酰供體以外的其他底物,GGT可催化底物分子(如谷氨酰胺或者谷胱甘肽)中的γ-谷氨酰供體轉(zhuǎn)移到水中形成谷氨酸;催化自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的過程,要求底物同時含有NH2基團和γ-谷氨?;鶊F,在反應(yīng)過程中底物既作為供體又作為受體[7]。

    圖1 GGT的催化反應(yīng)類型

    已報道的GGT在堿性pH值范圍內(nèi)(pH 8.0~11.0)均具有較高的催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)活力,酸性條件則利于水解反應(yīng)。不同來源GGT的最適溫度存在差異,最適溫度范圍通常在37~60 ℃之間,而多數(shù)GGT對溫度的耐受性較差,如B.subtilisNX-2的GGT在60 ℃時酶活力僅能維持較短時間[8]。此外,金屬離子如Ca2+、Mg2+、K+、Mn2+和Co2+對GGT酶活力也有一定影響。

    2 GGT的微生物來源

    GGT廣泛存在于原核和真核生物中,在不同生物體中,其催化特性相似,但其分布位置存在顯著差異。在真核生物中,GGT一般與糖類物質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白分布于細(xì)胞膜上;在原核生物中,GGT多以游離形式存在于其胞內(nèi)或者胞外,因此微生物的GGT更易于被提取和純化。對于GGT的研究始于日本京都大學(xué)的Suzuki等[9],他們從E.coliK12中分離出了GGT,并對其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、催化特性和催化產(chǎn)物進行了系列研究。大腸桿菌源GGT存在于細(xì)胞間質(zhì),分為兩條亞基,酶活力為1.40 U/mg,耐堿性,可用于合成多種γ-谷氨?;衔?。此后,學(xué)者們開始致力于從不同微生物中分離出GGT。

    由表1可知,目前已經(jīng)在Saccharomycescerevisiae、B.subtilis168、B.subtilisNX-2、B.subtilisSK11.004、B.subtilis(natto)、B.amyloliquefaciensBH072、B.amyloliquefaciensSMB469、B.licheniformis、B.licheniformisER-15、B.pumilus、B.altitudinisIHB B1644、Helicobacterpylori、Geobacillusthermodenitrificans、P.nitroreducensIFO12694、Proteusmirabilis等微生物中分離出了野生型GGT,并對其酶分子量、酶活、最適合反應(yīng)條件進行了測定[10-23]。GGT兩個亞基分子量分別在38~64 kDa和19.7~32 kDa之間;酶活力為1.40~683.4 U/mg,最適pH多為堿性(8.0~10.0),最適溫度為37~60 ℃,且對pH的穩(wěn)定性高于對溫度的穩(wěn)定性。不同微生物來源的GGT酶活力存在顯著差異,其中,大腸桿菌來源的GGT酶活力較低(約為1.40 U/mg),芽孢桿菌來源的GGT酶活力較高(在17.75~683.4 U/mg之間)。不同野生型微生物產(chǎn)GGT的酶活力大小存在著顯著差異,因此,對于產(chǎn)GGT的野生型微生物的挖掘也成為眾多學(xué)者重點突破的工作之一。

    表1 不同微生物來源GGT的酶學(xué)性質(zhì)

    3 GGT的基因改造

    鑒于微生物來源的GGT存在著諸如酶活力低、不利于分離提取等問題,眾多學(xué)者致力于利用生物技術(shù)對野生型GGT進行改造。

    由表2可知,目前針對GGT的改造主要包括克隆表達(dá)、隨機突變和定點突變等方式,以實現(xiàn)高產(chǎn)量、高酶活或/和突出酶學(xué)性質(zhì)的改變。

    表2 GGT的基因改造

    3.1 GGT的克隆表達(dá)

    GGT主要被克隆到E.coli或者B.subtilis中實現(xiàn)大量表達(dá)。如Irene等[24]將B.subtilis168作為表達(dá)宿主,成功地將B.pumilusML413源GGT進行了克隆表達(dá),并利用重組GGT生產(chǎn)茶氨酸;Lee等將B.amyloliquefaciensSMB469中的GGT分別轉(zhuǎn)錄到E.coli和B.subtilis菌中,得到的重組GGT酶活力分別提高了2倍和23倍;Mu等將B.amyloliquefaciensBH072轉(zhuǎn)錄到B.Subtilis168中表達(dá),得到了相對更耐高溫和耐堿性pH值的GGT,并將其用于合成茶氨酸。

    3.2 GGT的隨機突變和定點突變

    多位學(xué)者通過隨機突變和定點突變實驗確定了微生物源GGT催化中心的關(guān)鍵氨基酸殘基位置以及提高了重組GGT的催化特性。如Lyu等[25]將B.licheniformisATCC 1458菌源GGT的Thr399和Thr417進行隨機突變,結(jié)果顯示突變后的重組酶酶活顯著降低,暗示了Thr399和Thr417殘基序列為此酶催化的關(guān)鍵位點;Calvio等[26-27]研究了B.subtilis168和E.coliBL21(DE3)源GGT序列中一個覆蓋谷氨酸結(jié)合位點的短序列(稱為lid loop)對其催化效率的影響,通過定點突變可以降低其GGT的水解活性且提高其底物專一性;Chi等[28-32]通過隨機突變和定點突變實驗確定了B.licheniformis源GGT的氨基酸殘基458PLSSMXP464、Asn450、Glu398、Gly481和Gly482對其酶活力大小具有重要的貢獻,其中用Asp和Gln代替Asn450得到的重組GGT被用于合成茶氨酸,其轉(zhuǎn)化率達(dá)到了94%;Li等[33]將一株來自海洋的耐鹽B.amyloliquefaciensZS5的GGT進行了克隆和基因改造,通過定點突變將Val319和Ser437轉(zhuǎn)變?yōu)锳la319和Gly437,獲得了高酶活重組GGT,并用于合成茶氨酸,其產(chǎn)量從58%提高到83%。

    綜上所述,目前對于GGT的基因改造主要側(cè)重于提高酶活力,而尚未見對GGT催化特性方面的改造應(yīng)用。GGT催化γ-谷氨酰肽合成的最適pH為10.0,屬于中強堿性范圍,可能會導(dǎo)致底物的消旋反應(yīng),同時反應(yīng)后需要大量的酸進行中和,使得產(chǎn)物中通常含有大量的鈉鹽離子,為后續(xù)的分離純化帶來麻煩;此外,多數(shù)GGT對堿性氨基酸和芳香族氨基酸更具有親和力,對于酸性氨基酸和中性氨基酸的親和力較差,因此,在后續(xù)的基因改造中,側(cè)重于改造GGT的最適pH,或者對不同受體氨基酸選擇性方面的改造,將減少反應(yīng)過程中鈉離子的引入,同時拓寬γ-谷氨酰肽化合物的合成范圍。

    4 GGT的生產(chǎn)應(yīng)用

    酶在發(fā)酵食品、調(diào)味品加工工業(yè)中已有廣泛的應(yīng)用[34-38]。盡管GGT可催化3種催化反應(yīng)類型,但是多數(shù)GGT主要催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng),眾多學(xué)者將經(jīng)過分子改造產(chǎn)生的重組GGT用于合成γ-谷氨酰肽。包括各種γ-谷氨酰二肽、γ-谷氨酰肽衍生物、茶氨酸、聚谷氨酸、谷氨酸等。對GGT合成γ-谷氨酰化合物的情況進行了匯總,見表3。

    表3 GGT的催化產(chǎn)物

    4.1 谷氨酸的合成

    谷氨酸是一種鮮味氨基酸[39],賦予食物鮮味[40],是醬油、蠔油等調(diào)味品中的主要呈味物質(zhì)。在醬油等發(fā)酵調(diào)味品的生產(chǎn)中,可部分由谷氨酰胺酶[41]催化谷氨酰胺脫氨生成[42-43]。而此反應(yīng)也可由GGT在一定條件下催化。GGT通常以催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)為主,經(jīng)過基因改造,可以降低轉(zhuǎn)肽活性,提高水解效果。Suzuki等通過定點突變將GGT殘基Asp445用Ala替換,得到具有高水解活性的GGT突變體,并將其用于醬油發(fā)酵過程,其產(chǎn)品中谷氨酸的含量提高了36 mmol/L。此外,經(jīng)過改造的GGT具有高耐鹽性,在鹽含量18%以內(nèi)均具有較高的水解活性,可用于醬油發(fā)酵中谷氨酸的生成。有學(xué)者采用誘變技術(shù)選育高產(chǎn)菌株生產(chǎn)鮮味氨基酸也是一個值得參考的方向[44]。

    4.2 L-茶氨酸的合成

    L-茶氨酸(γ-谷?;阴0?是一種獨特的非蛋白質(zhì)氨基酸,分離于茶葉中,可以賦予茶鮮味。L-茶氨酸還具有多種生理功能,包括抗癌、抗肥胖、神經(jīng)保護、緩解精神壓力、提高學(xué)習(xí)能力和記憶力等。GGT是茶氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶,它可以通過催化谷氨酰胺上的γ-谷氨?;D(zhuǎn)移到乙胺受體上而合成茶氨酸。眾多學(xué)者已經(jīng)從多種微生物中分離GGT,經(jīng)過改造后提高GGT催化茶氨酸的合成效率。如Bindal和Gupta[45]將B.licheniformisER-15的GGT編碼基因轉(zhuǎn)錄到E.coliBL21進行表達(dá),得到了可高產(chǎn)茶氨酸的GGT,產(chǎn)率高達(dá)85%~87%。Li等將B.amyloliquefaciens源GGT轉(zhuǎn)錄到E.coliBL21(DE3)中,得到了耐鹽的重組GGT,同時提高了其催化茶氨酸的產(chǎn)率,使茶氨酸產(chǎn)率從58%提高到83%。Lin等利用定點突變實驗將B.licheniformis源GGT進行改造,將Asn450分別改成Asp450和Gln450,以此提高GGT酶活力,得到的重組GGT催化茶氨酸合成產(chǎn)率高達(dá)94%。

    4.3 含L-氨基酸的γ-谷氨酰肽

    γ-谷氨酰肽是典型的厚味肽,可以作為食品添加劑增強食品的鮮味、濃厚味[46-47],廣泛存在于大蒜、洋蔥、豆類和發(fā)酵食品中。γ-谷氨酰肽也可以通過γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成,多以谷氨酰胺為γ-谷氨酰供體,游離氨基酸為受體,在GGT或者谷氨酰胺酶的催化作用下產(chǎn)生。Suzuki等[48-49]以支鏈氨基酸、堿性氨基酸和芳香鏈氨基酸為受體,通過E.coli源GGT合成了多種γ-谷氨酰肽,其合成的最佳條件通常為pH 10, 37 ℃,產(chǎn)物的最高產(chǎn)率可達(dá)到88%。Li等[50]利用B.amyloliquefaciens源GGT為催化劑,以豬血紅蛋白和肉類蛋白為原料,經(jīng)過蛋白酶水解得到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)的供體和受體游離氨基酸,合成多種γ-谷氨酰肽,此方法解決了目前用于合成γ-谷氨酰肽原料昂貴的壁壘,有利于γ-谷氨酰肽商業(yè)化推廣。

    4.4 γ-D-谷氨?;?L-色氨酸

    γ-D-谷氨?;?L-色氨酸(scv-07)在治療結(jié)核病中可作為一種潛在有效藥物,因此未來其在制藥行業(yè)中的需求將會大大增加。以D-谷氨酰胺為γ-谷氨?;w,L-色氨酸為受體,其可在GGT的催化作用下合成[51-52]。此外,由于GGT催化γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)的過程中,對L-谷氨酰胺(Km=8.3 μmol/L)的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于D-谷氨酰胺(Km=278 μmol/L),因此如果使用D-谷氨酰胺代替L-谷氨酰胺作為γ-谷氨酰基供體合成γ-谷氨?;母碑a(chǎn)物的含量將大幅下降[53]。

    4.5 γ-谷氨酰肽衍生物

    一些功能性的γ-谷氨酰肽衍生物如γ-L-谷氨酰-L-3,4-二羥基苯丙氨酸[54]、γ-Glu-Tau[55]和β-N-(γ-l(+)谷酰基)苯肼[56],由于在C端含有γ-谷氨酰殘基而可以通過GGT被大規(guī)模合成。大蒜中的一些天然的味道增強劑,包括γ-EM, γ-Glu-S-allyl-Cys和γ-Glu-S-methy-Cys也以GSH作為底物通過GGT催化合成[57-58]。

    5 總結(jié)

    目前國內(nèi)外對于GGT的開發(fā)和研究相對較少,已知的微生物來源GGT酶活力較低,GGT的分子改造也尚處于實驗室階段,未能滿足工業(yè)化生產(chǎn)。目前市場對于“kokumi”味γ-谷氨酰肽的認(rèn)可和需求逐年增加,但我國尚沒有自主產(chǎn)權(quán)的酶資源。對于某些特定用途GGT的開發(fā)迫在眉睫,如提高GGT的催化專一性,降低GGT的最適pH值,提高酶催化效率等的研究均尚未見報道。后續(xù)需要大量投入相關(guān)研究,篩選高活性微生物來源的GGT,結(jié)合分子酶改造技術(shù),提高GGT產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率、耐溫、降鹽等特性,同時加強酶的生產(chǎn)工藝,為γ-谷氨酰肽低成本、高產(chǎn)量的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

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