趙新杰,高麗偉,趙祥忠
(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院,濟(jì)南 250353)
巖藻黃素(fucoxanthin,F(xiàn)x)又被稱為褐藻黃素,是一種脂溶性的天然類胡蘿卜素,廣泛存在于褐藻和硅藻中[1]。巖藻黃素分子結(jié)構(gòu)(見圖1)中含有的丙二烯鍵和羥基發(fā)色團(tuán)尾端使其具有重要的生物活性[2]?,F(xiàn)已有研究證明巖藻黃素具有抗腫瘤[3]、抗炎[4]、清除自由基[5]、減肥[6]、抗糖尿病[7]等生物學(xué)功效。三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)屬硅藻門中的單細(xì)胞海洋微藻,因其細(xì)胞色素組成中巖藻黃素含量較高,被認(rèn)為是巖藻黃素的最佳來源。Kim等[8]通過液相色譜分析確定了三角褐指藻中巖藻黃素的含量在15.71~16.51 mg/g(干重)之間,是大型海藻的10倍以上。
圖1 巖藻黃素結(jié)構(gòu)式
三角褐指藻中的巖藻黃素一般使用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取,使用有機(jī)溶劑不但污染環(huán)境,而且有機(jī)溶劑的殘留會危害人體健康,目前已有多種其他提取方法,如微波法[9]、酶解法[10]、超臨界流體萃取法[11]、加壓輔助d-檸檬烯提取法等[12]。食用油被視為“綠色”溶劑,一些論文報(bào)道了利用植物油從蝦廢料[13]和雨生紅球藻[14]中提取類胡蘿卜素的研究。用食用油提取類胡蘿卜素的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、環(huán)保,甚至無需任何純化就可以直接將提取物用作食品原料。甘油酯在食品加工中常被用作食品添加劑,本研究篩選6種不同鏈長的脂肪酸甘油酯進(jìn)行巖藻黃素的提取研究,旨在獲得三角褐指藻中巖藻黃素“綠色提取”的最佳工藝及參數(shù)。
三角褐指藻:榮成市尋山集團(tuán)有限公司。
三乙酸甘油酯(分析純):無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司;三丁酸甘油酯、三辛酸甘油酯(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;辛癸酸甘油酯(分析純):今品化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;花生油:嘉里糧油(青島)有限公司;芝麻油:瑞福油脂股份有限公司。
UV-5100型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;LG-0.2型真空冷凍干燥機(jī) 新陽速凍設(shè)備制造有限公司;TG16-WS型臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;JA5003型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XW-80A型旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
1.4.1 樣品前處理
將濃縮后的三角褐指藻藻液于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h,然后粉碎成粉末(150 μm以下)于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 提取方法
準(zhǔn)確稱取0.2 g三角褐指藻藻粉,加入5 mL甘油酯于10 mL離心管中旋渦混勻1 min,置于恒溫水浴鍋中以設(shè)定的溫度浸提一定時(shí)間,期間每隔30 min取出旋渦混勻一次。浸提結(jié)束后取出以6000 r/min離心15 min取上清液,稀釋一定倍數(shù)后在449 nm波長處測定樣品的吸光值。整個(gè)過程中對樣品進(jìn)行遮光處理。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn),最終結(jié)果取3次試驗(yàn)的平均值。
1.4.3 巖藻黃素含量的計(jì)算
根據(jù)Lambert-Beer定律[15]計(jì)算提取液中Fx的含量:
公式(1)
1.4.4 不同鏈長脂肪酸甘油酯的單因素試驗(yàn)
根據(jù)1.4.2中的提取方法,選取兩種短鏈脂肪酸甘油酯:三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,兩種中鏈脂肪酸甘油酯:三辛酸甘油酯和辛癸酸甘油酯,以及兩種長鏈脂肪酸甘油酯:花生油和芝麻油,分別以提取溫度、提取時(shí)間、超聲時(shí)間以及蔗糖脂肪酸酯的添加比例為單一變量進(jìn)行單因素試驗(yàn),以巖藻黃素的提取率為指標(biāo),研究這4個(gè)變量對脂肪酸甘油酯提取巖藻黃素的影響,以確定較好的試驗(yàn)參數(shù)范圍。
1.4.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取提取效果最好的脂肪酸甘油酯,以提取溫度、提取時(shí)間、超聲時(shí)間、蔗糖脂肪酸酯添加比例進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化脂肪酸甘油酯對巖藻黃素的提取條件,正交試驗(yàn)因素水平表見表1。
表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表
2.1.1 不同鏈長脂肪酸甘油酯對巖藻黃素的提取結(jié)果
首先將選取的6種不同鏈長的脂肪酸甘油酯在45 ℃條件下浸提三角褐指藻藻粉2 h作為對照,并通過公式(1)計(jì)算Fx的含量,結(jié)果見圖2。
圖2 不同鏈長脂肪酸甘油酯中巖藻黃素的提取含量
由圖2可知,三乙酸甘油酯和辛癸酸甘油酯有相對較高的Fx提取含量,其Fx提取含量分別為3.028 mg/g和3.197 mg/g,而花生油和芝麻油對Fx的提取量較低,僅有2.034 mg/g和2.494 mg/g?;ㄉ秃椭ヂ橛褪呛卸喾N不飽和脂肪酸的混合物,其中花生油中含有41.2%的油酸和37.65%的亞油酸,芝麻油的主要組成成分為油酸、亞麻酸和棕櫚酸[16]。花生油和芝麻油的Fx提取含量低于短鏈和中鏈脂肪酸甘油酯,這可能和它們的復(fù)雜組成有關(guān)。從流動性來看,花生油和芝麻油的流動性也明顯低于短鏈和中鏈脂肪酸甘油酯,這也可能是導(dǎo)致它們提取率低的原因之一。
2.1.2 溫度對巖藻黃素提取的影響
溫度能夠影響物質(zhì)內(nèi)部的分子運(yùn)動,有利于活性物質(zhì)的擴(kuò)散。因此,將藻粉分別在35,45,55,65,75 ℃ 5個(gè)不同的溫度條件下提取2 h,探究溫度對不同脂肪酸甘油酯提取Fx的影響,并確定它們的最適提取溫度,結(jié)果見圖3。
圖3 溫度對巖藻黃素提取的影響
由圖3可知,溫度對Fx的提取有十分顯著的影響,特別是對短鏈、中鏈脂肪酸甘油酯的浸提效果。隨著溫度的升高,短鏈、中鏈脂肪酸甘油酯中Fx的含量有明顯的升高,三乙酸甘油酯和辛癸酸甘油酯在65 ℃時(shí)有最大的提取率,提取含量分別為4.325 mg/g和3.873 mg/g,比對照組的Fx含量分別提高了42.83%和21.14%。三丁酸甘油酯和三辛酸甘油酯在55 ℃時(shí)達(dá)到最大,分別是2.925 mg/g和3.011 mg/g,比對照組分別提高了15.48%和8.31%。隨著提取溫度的升高,短鏈、中鏈脂肪酸甘油酯中Fx含量呈現(xiàn)出不同程度的下降,這是由于溫度升高,體系內(nèi)的分子運(yùn)動加劇,有助于Fx的提取,但是達(dá)到一定溫度后,F(xiàn)x由于受熱很不穩(wěn)定,會隨著溫度的升高而分解,導(dǎo)致提取率下降[17]。因此,巖藻黃素的提取溫度在55~65 ℃之間較為理想,與Zhang等[18]關(guān)于巖藻黃素在40~70 ℃之間穩(wěn)定性較高的研究結(jié)果一致。
此外,食用油對類胡蘿卜素的降解起屏障作用[19]。但是,食用油的高黏度可能導(dǎo)致低擴(kuò)散率,因此即使在高溫下提取率也較低。這可能是花生油和芝麻油在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)Fx提取量一直升高但提取率卻很低的原因。
2.1.3 時(shí)間對巖藻黃素提取的影響
在45 ℃的恒溫條件下,分別用6種不同鏈長的脂肪酸甘油酯浸提三角褐指藻藻粉60,120,180,240,300 min,F(xiàn)x含量見圖4。
圖4 時(shí)間對巖藻黃素提取的影響
由圖4可知,在180 min時(shí),短鏈和中鏈脂肪酸甘油酯中Fx的含量基本上達(dá)到飽和,隨著提取時(shí)間的延長,F(xiàn)x含量僅有少量的增加。與此不同的是,長鏈脂肪酸甘油酯中的芝麻油在整個(gè)提取過程中Fx的含量一直在提高,花生油也表現(xiàn)出相同的增長趨勢。芝麻油的提取效果甚至超過了三丁酸甘油酯和三辛酸甘油酯的提取量,在浸提300 min時(shí)達(dá)到了3.271 mg/g的Fx含量。浸提時(shí)間的延長有利于巖藻黃素的溶出,但過長的時(shí)間會導(dǎo)致巖藻黃素氧化分解的加劇,因此結(jié)合圖4中的試驗(yàn)結(jié)果,短鏈、中鏈脂肪酸甘油酯提取時(shí)間在180~240 min之間為宜,長鏈脂肪酸甘油酯提取時(shí)間在240~300 min之間較好。
2.1.4 超聲波處理對巖藻黃素提取的影響
超聲處理主要是利用超聲波的功率特性,借助熱效應(yīng)、機(jī)械作用和空化作用,改變或者加速改變物質(zhì)的某些物理、化學(xué)、生物特性或狀態(tài),短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破裂,提高活性成分的提取效率[20]。在45 ℃浸提2 h的過程中,利用超聲波清洗器以100 W的功率對樣品進(jìn)行10,15,20,25,30 min的超聲處理,以考察超聲時(shí)間對甘油酯提取Fx的影響,提取結(jié)果見圖5。
圖5 超聲時(shí)間對巖藻黃素提取的影響
由圖5可知,短鏈脂肪酸甘油酯的最佳超聲處理時(shí)間為20 min,在此條件下三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯提取的Fx含量分別為4.296 mg/g和2.958 mg/g,比未經(jīng)過超聲處理的對照組分別提高了41.88%和16.78%。超聲處理對中鏈脂肪酸甘油酯的影響比短鏈脂肪酸甘油酯顯著,在超聲時(shí)間為25 min時(shí),三辛酸甘油酯和辛癸酸甘油酯的Fx提取含量分別為3.647 mg/g和4.113 mg/g,比對照組分別提高了31.19%和28.65%。在短時(shí)間內(nèi),超聲作用促進(jìn)了三角褐指藻細(xì)胞的破裂,F(xiàn)x分子不斷擴(kuò)散與提取溶劑發(fā)生作用,提取效果顯著提高,但是超過一定時(shí)間后,一些如熱效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)的反應(yīng)會對Fx產(chǎn)生破壞,繼續(xù)超聲處理可能會破壞Fx,使提取率下降[21]。
長鏈脂肪酸甘油酯中的花生油和芝麻油在超聲輔助下Fx的浸出含量一直上升,在超聲處理30 min后,芝麻油中Fx的含量為3.459 mg/g,比對照組提高了38.42%,考慮到長時(shí)間超聲處理對巖藻黃素結(jié)構(gòu)的破壞,因此花生油和芝麻油的最佳超聲時(shí)間為30 min。
2.1.5 不同比例的蔗糖脂肪酸酯對甘油酯浸提的影響
乳化劑是一種表面活性物質(zhì),分子中同時(shí)具有親水基和親油基,能夠改善體系的穩(wěn)定性。食品乳化劑是一類多功能的高效食品添加劑,除了具有典型的表面活性之外,在食品中還具有穩(wěn)定、潤滑、助溶等作用[22]。
蔗糖脂肪酸酯是一種非離子表面活性劑,由蔗糖和脂肪酸經(jīng)酯化反應(yīng)生成。在Fx的提取過程中,加入不同比例的蔗糖脂肪酸酯作為乳化劑,可以提高甘油酯的流動性,有助于Fx的溶出。不同比例蔗糖脂肪酸酯的添加對不同鏈長脂肪酸甘油酯提取Fx的影響見圖6。
圖6 蔗糖脂肪酸酯添加比例對巖藻黃素提取的影響
由圖6可知,隨著蔗糖脂肪酸酯添加比例的不斷增加,短鏈脂肪酸甘油酯的提取率在不斷下降。中鏈脂肪酸甘油酯在添加比例1.5%以下時(shí),有利于Fx的提取,繼續(xù)增加蔗糖脂肪酸酯的量將會阻礙Fx的溶出。然而,蔗糖脂肪酸酯的加入?yún)s很有利于長鏈脂肪酸甘油酯對Fx的提取。在短鏈脂肪酸甘油酯中,三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯的最適蔗糖脂肪酸酯添加比例為0.5%,此時(shí)Fx的含量分別為3.429 mg/g和2.648 mg/g,僅比對照組分別提高了13.24%和4.54%。辛癸酸甘油酯在蔗糖脂肪酸酯添加比例為1.0%時(shí),F(xiàn)x有最大提取含量3.415 mg/g,比對照組含量提高了6.79%。三辛酸甘油酯在蔗糖脂肪酸酯添加比例為1.5%時(shí)有最大提取量3.184 mg/g,相對于對照組Fx含量提高了14.53%。
蔗糖脂肪酸酯對花生油和芝麻油的影響大于對短鏈和中鏈脂肪酸甘油酯的影響。芝麻油和花生油在蔗糖脂肪酸酯比例為1.5%和2.0%時(shí),F(xiàn)x最大提取含量分別為3.014 mg/g和2.918 mg/g,比對照組分別提高了20.85%和43.46%。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取提取效果較好的三乙酸甘油酯進(jìn)行正交優(yōu)化,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。
表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
由表2可知,各因素的極差R值大小為A>C>D>B,表明4個(gè)因素對Fx提取率的影響程度由高到低為提取溫度>超聲時(shí)間>蔗糖脂肪酸酯添加比例>提取時(shí)間。綜合分析各因素的k值,確定三乙酸甘油酯提取Fx的最優(yōu)條件組合為A2B3C3D2,即提取溫度65 ℃、提取時(shí)間4 h、超聲時(shí)間25 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%。
在最佳提取條件下進(jìn)行3次平行提取試驗(yàn),經(jīng)計(jì)算得出三乙酸甘油酯對三角褐指藻中Fx的最大提取率為5.129 mg/g,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.54%,表明優(yōu)化條件合理可行。
本試驗(yàn)以可食用的脂肪酸甘油酯作為提取溶劑,浸提三角褐指藻中的巖藻黃素,通過對6種不同鏈長的脂肪酸甘油酯進(jìn)行單因素試驗(yàn),探究了提取溫度、提取時(shí)間、超聲處理以及蔗糖脂肪酸酯對巖藻黃素提取的影響。結(jié)果表明,提取溫度和提取時(shí)間對短鏈、中鏈脂肪酸甘油酯的影響較大,而超聲處理和蔗糖脂肪酸酯對長鏈脂肪酸甘油酯的影響較大??偟膩碚f,短鏈和中鏈脂肪酸甘油酯的提取效果好于長鏈脂肪酸甘油酯,其中提取效果較好的有三乙酸甘油酯、辛癸酸甘油酯和芝麻油,三乙酸甘油酯和辛癸酸甘油酯的最適提取條件為:三乙酸甘油酯在提取溫度65 ℃、超聲處理20 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%的條件下提取180 min;辛癸酸甘油酯在提取溫度65 ℃、超聲處理25 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%的條件下提取180 min。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取提取效果較好的三乙酸甘油酯進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn),確定了三乙酸甘油酯提取Fx的最優(yōu)條件為提取溫度65 ℃、提取時(shí)間4 h、超聲時(shí)間25 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%。在此最佳提取條件下Fx的最大提取含量為5.129 mg/g。