氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定紅糖中的丙烯酰胺

方麗，王李平，張方圓，李雪瑩，潘云山，張麗，黃嘉穎

(廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心)，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心，廣州 510070)

紅糖(brown sugar)指帶蜜的甘蔗成品糖，以甘蔗為原料，經(jīng)提取糖汁、清凈處理后，直接煮煉，不經(jīng)分蜜煉制而成[1]。整個(gè)加工過(guò)程中不加入除石灰外任何化學(xué)試劑及食品添加劑，完全保留甘蔗原有風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。紅糖與白砂糖、赤砂糖等精制糖不同，是一種非分蜜糖，即未經(jīng)過(guò)分蜜處理制成的糖。在未大規(guī)模生產(chǎn)精制糖時(shí)期，甘蔗糖的主要消費(fèi)形式即非分蜜糖。在全球范圍內(nèi)有不同的名稱(chēng)和形態(tài)，廣為人知的是日本沖繩黑糖(Kokuto)、拉丁美洲紅糖(Panela)和南亞、非洲粗糖(Jaggery)等，本質(zhì)上來(lái)說(shuō)它們都是甘蔗汁的濃縮產(chǎn)物[2]。

紅糖主要成分為蔗糖、果糖、葡萄糖等，另外還含有被認(rèn)為是益生元的低聚果糖，含量高達(dá)500 mg/g[3]。作為甘蔗的全汁濃縮物，紅糖保留了甘蔗中的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含有具有抗氧化作用的甘蔗多酚，如奎尼酸、原兒茶酸、阿魏酸等多種酚酸[4]。還含有微量的參與人體代謝和細(xì)胞調(diào)節(jié)的維生素，包括維生素A、維生素E、維生素D、煙酸、泛酸等[5]。陳其釗等[6]的研究表明，紅糖中的植物甾醇含量明顯高于赤砂糖，而植物甾醇對(duì)于預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)傷口愈合等方面具有積極作用。紅糖中包含鐵、鋅、錳、銅、硒等多種微量元素[7]，這些微量元素是人體代謝必需的活性因子。紅糖與其他功能性藥食同源植物合理配伍，能夠增強(qiáng)其保健功效，因此出現(xiàn)了生姜紅糖、益母紅糖等功能性紅糖。除了上述保健作用外，紅糖還具有調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用，其中含有幾十種香氣物質(zhì)[8]。Tian等[9]研究表明紅糖對(duì)雞肉調(diào)味品的風(fēng)味品質(zhì)具有積極影響。Chen Erbao等[10]通過(guò)GC-O-MS對(duì)紅糖的氣味進(jìn)行了分析，檢測(cè)到豐富的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(如吡嗪類(lèi)和呋喃酮類(lèi)物質(zhì))。

丙烯酰胺是一種具有親電基團(tuán)的有機(jī)小分子，對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)都有一定的毒性[11]，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)將其列為2A類(lèi)致癌物，即“人類(lèi)可能致癌物”。天冬酰胺參與的美拉德反應(yīng)是食品中丙烯酰胺的主要來(lái)源[12]，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺主要存在于薯?xiàng)l、面包、咖啡等油炸、焙烤食品中，而紅糖中存在丙烯酰胺鮮有報(bào)道。丙烯酰胺的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以及新型的檢測(cè)技術(shù)如基于褐變的快速測(cè)定、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、生物傳感器法及熒光傳感法[13]。本文以紅糖作為研究對(duì)象，優(yōu)化并建立其中丙烯酰胺含量的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑材料

1.1.1 樣品

紅糖樣品選取云南、廣西、廣東、江蘇4個(gè)國(guó)內(nèi)主要的紅糖生產(chǎn)地區(qū)所生產(chǎn)的紅糖，以及從兩個(gè)國(guó)家進(jìn)口的紅糖。樣品購(gòu)買(mǎi)后密封于冰箱中冷藏貯存。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

丙烯酰胺(Acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)AM，CAS：79-06-1)：1000 μg/mL，介質(zhì)甲醇，提供商為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)(13C3-Acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)13C3-AM，CAS:287399-26-2)：1000 μg/mL，介質(zhì)甲醇，提供商為First Standard。

1.1.3 試劑

乙酸乙酯(色譜純，Honeywell)、甲醇(色譜純，Honeywell)、溴化鉀(分析純，廣試)、溴酸鉀(分析純，廣試)、無(wú)水硫酸鈉(分析純，廣試，在650 ℃下灼燒4 h，貯存于干燥器中，冷卻備用)、硫代硫酸鈉(分析純，麥克林)、實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.4 基質(zhì)分散材料

乙二胺-N-丙基硅烷PSA(150 mg MgSO4+50 mg PSA/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB/2 mL)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 AM標(biāo)準(zhǔn)溶液

取0.25 mL AM標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的AM標(biāo)準(zhǔn)溶液，在-18 ℃下保存。

1.2.213C3-AM內(nèi)標(biāo)溶液

取0.25 mL13C3-AM標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，在-18 ℃下保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線

分別取0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0 mL的10 μg/mL AM標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.5 mL的10 μg/mL13C3-AM內(nèi)標(biāo)溶液于10 mL容量瓶中用超純水定容至10 mL，得10，50，100，200，500，800，1000 ng/mL內(nèi)標(biāo)濃度為500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線，臨用時(shí)配制。

1.3 儀器設(shè)備

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊源) 美國(guó)安捷倫科技公司；E320食品料理機(jī) 美國(guó)Vitamix公司；多位試管渦旋振蕩器 德國(guó)Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國(guó)Organomation；移液器 美國(guó)Gilson公司；電子天平 德國(guó)Sartorius公司；CF 16RXⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；MPR-210冰箱 日本松下電器(中國(guó))有限公司；50 mL三角瓶、250 mL分液漏斗 博美(北京)玻璃有限公司；比色管(10 mL和100 mL) 天津天玻科技發(fā)展有限公司。

1.4 樣品前處理

將紅糖樣品放入食品料理機(jī)內(nèi)，打碎混勻后，收集在密封袋中做好標(biāo)示，備用。稱(chēng)取5 g(精確至0.001 g)制備樣于50 mL離心管中，加入20 mL超純水，渦旋10 min后放入冰箱中冷藏待反應(yīng)。稱(chēng)取5 g溴化鉀于100 mL比色管中，加入10 mL超純水，渦旋溶解后，依次加入6 mL 10%濃硫酸溶液、冷藏的樣品溶液和20 mL 0.4 mol/L溴酸鉀溶液，避光置于4 ℃冰箱中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入40 mL飽和的硫代硫酸鈉溶液，轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，用50 mL乙酸乙酯分3次萃取，收集乙酸乙酯層，加入無(wú)水硫酸鈉脫水后，氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL。將定容后溶液移入PSA+C18的凈化管內(nèi)，渦旋1 min，4000 r/min離心3 min后，取上清液，進(jìn)行GC-MS分析，測(cè)試樣品。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣模式：脈沖不分流；載氣：高純He，純度99.999%；流速：1.2 mL/min；升溫程序：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，再以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊式離子源(EI，70 eV)；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度240 ℃；溶劑延遲5 min；采集模式：選擇離子檢測(cè)(SIM)，AM(151,133,135,106)；13C3-AM(154,152,136,110)，其中帶下劃線的質(zhì)荷比(m/z)為定量離子，其余3個(gè)為定性離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

丙烯酰胺溶于水，且紅糖在水中易于溶解，因此直接將紅糖樣品經(jīng)渦旋溶解于超純水后，用于溴化衍生。由于衍生產(chǎn)物2,3-二溴丙酰胺微溶于水，易溶于乙酸乙酯，且有機(jī)化合物在兩種溶劑中的分配系數(shù)介于0.1～100之間，用一定量的溶劑分批多次萃取的效率要比一次萃取效率高，因此衍生結(jié)束后，加入飽和的硫代硫酸鈉消除多余的溴單質(zhì)，采用50 mL乙酸乙酯分3次對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行萃取，收集乙酸乙酯層，脫水、濃縮、凈化后，用GC-MS進(jìn)行分析。

由于丙烯酰胺在熔點(diǎn)溫度時(shí)很容易聚合，氣相色譜無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)其低濃度含量的分析。且其相對(duì)分子量?jī)H為71，離子化碎片主要為71，55，44，27，碎片m/z小，進(jìn)行GC-MS分析時(shí)，干擾較大。因此，采用溴化加成，使丙烯酰胺轉(zhuǎn)換為2,3-二溴丙酰胺，增加了丙烯酰胺的熱穩(wěn)定性以及對(duì)檢測(cè)器的靈敏度和選擇性，再用GC-MS進(jìn)行分析。

溴單質(zhì)的獲取途徑為溴化鉀-溴酸鉀與濃硫酸混合反應(yīng)。利用在極性溶劑中，溴容易發(fā)生異裂，生成溴離子，與丙烯酰胺中的烯鍵發(fā)生加成反應(yīng)，生成2,3-二溴丙酰胺，反應(yīng)結(jié)束后，用硫代硫酸鈉溶液除去多余的溴單質(zhì)，反應(yīng)方程式如下：

5KBr+KBrO3+3H2SO4=3Br2+3H2O+3K2SO4。

CH2=CHCONH2+Br2=CH2BrCHBrCONH2。

Na2S2O3+4Br2+5H2O=Na2SO4+H2SO4+8KBr。

由于加入的溴化鉀和溴酸鉀過(guò)量，能夠滿(mǎn)足衍生反應(yīng)要求，反應(yīng)過(guò)程所涉及的關(guān)鍵因素為濃硫酸溶液的加入量、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間。

2.1.1 影響溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的單因素實(shí)驗(yàn)考察

先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行五水平實(shí)驗(yàn)考察。首先對(duì)最主要的因素——濃硫酸加入量進(jìn)行考察，分別選取10%濃硫酸加入量為2，4，6，8，10 mL這5個(gè)水平，反應(yīng)溫度4 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，以不同水平實(shí)驗(yàn)作為橫坐標(biāo)、相對(duì)響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)，繪制濃硫酸溶液加入量對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響的單因素實(shí)驗(yàn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 濃硫酸溶液的加入量對(duì)結(jié)果的影響

由圖1可知，隨著10%濃硫酸加入量的逐漸增大，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)加入量超過(guò)8 mL時(shí)，繼續(xù)增加加入量，相對(duì)響應(yīng)值無(wú)明顯變化，故選擇10%濃硫酸的加入量為8 mL。

考察不同溫度下溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。丙烯酰胺極易升華和聚合，在室溫條件下穩(wěn)定。用于反應(yīng)的溴單質(zhì)在常溫、常壓下是具有揮發(fā)性的紅黑色液體，且溴蒸氣具有腐蝕性、有毒。因此，根據(jù)丙烯酰胺和溴單質(zhì)的理化性質(zhì)，考察溫度時(shí)分別選取0，4，8，12，16 ℃這5個(gè)水平，加入8 mL的10%濃硫酸，反應(yīng)時(shí)間30 min，以不同水平實(shí)驗(yàn)作為橫坐標(biāo)、相對(duì)響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)，繪制溫度對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響的單因素實(shí)驗(yàn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)結(jié)果的影響

由圖2可知，當(dāng)溫度為4 ℃時(shí)，相對(duì)響應(yīng)值最大，隨著反應(yīng)溫度的上升，相對(duì)響應(yīng)值反而下降，可能與丙烯酰胺的穩(wěn)定性有關(guān)。

考察不同時(shí)間下溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率?？疾旆磻?yīng)時(shí)間時(shí)分別選取10，20，30，40，50 min這5個(gè)水平，加入8 mL的10%濃硫酸，反應(yīng)溫度為4 ℃，以不同水平實(shí)驗(yàn)作為橫坐標(biāo)、相對(duì)響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)，繪制時(shí)間對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響的單因素實(shí)驗(yàn)曲線，見(jiàn)圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，相對(duì)響應(yīng)值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間為40 min時(shí)，相對(duì)響應(yīng)值達(dá)到峰值，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為40 min。

單因素實(shí)驗(yàn)存在各因素之間沒(méi)有交互作用這個(gè)假定，而在實(shí)際問(wèn)題中，各因素相互獨(dú)立的情況極少。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上，同時(shí)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)，對(duì)衍生條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.2 影響溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken Design的中心組合設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素和水平選擇見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

以10%濃硫酸加入量(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時(shí)間(C)為自變量，以反應(yīng)后產(chǎn)物2,3-二溴丙酰胺的響應(yīng)值比率為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Design-Expert軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=11.21A+3.92B-0.18C-8.09AB+1.29AC+3.8BC-9.37A2-15.28B2-9.81C2，對(duì)其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與方差分析，見(jiàn)表3。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

由表3可知，回歸模型的P值<0.001，表明該模型回歸效果顯著，可反映實(shí)際結(jié)果的R2=0.9929，表明模型的擬合結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相關(guān)度高，失擬項(xiàng)的P值為0.2673>0.05，表明該回歸方程擬合度較高，誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。在所有作用因素中，一次項(xiàng)A、交互相AB以及二次項(xiàng) A2、B2、C2對(duì)目標(biāo)化合物的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響極顯著(P<0.001)。由表3中F值可知，各因素對(duì)溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響大小順序?yàn)椋?0%濃硫酸加入量(A)>反應(yīng)溫度(B)>反應(yīng)時(shí)間(C)。

利用Design Expert軟件，通過(guò)多元回歸方程做出響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖4。因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可由等高線圖的形狀來(lái)分析。等高線圖越接近于橢圓，表明因素之間的交互作用越強(qiáng)烈[14]。

圖4 兩因素交互影響反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面

由圖4可知，10%濃硫酸加入量和反應(yīng)溫度(AB)的交互作用最為顯著，其次是10%濃硫酸加入量和反應(yīng)時(shí)間(AC)，影響最小的為反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間(BC)。最終確定溴化加成反應(yīng)的條件為10%濃硫酸加入量為8 mL，反應(yīng)溫度為4 ℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min，并以2,3-二溴丙酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CAS:15102-42-8)作為基準(zhǔn)，確定反應(yīng)產(chǎn)物濃度，得到上述條件下的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為98.7%，完全滿(mǎn)足方法要求。

2.2 凈化條件的確定

由于紅糖所包含的成分較多，在衍生化反應(yīng)過(guò)程中，亦會(huì)引入部分雜質(zhì)，在GC-MS分析時(shí)體現(xiàn)為雜峰多、基線上升，從而影響定量、定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。該實(shí)驗(yàn)凈化利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理，采用吸附劑與碳水化合物等干擾物結(jié)合，通過(guò)離心方式去除，從而達(dá)到凈化的目的。比較了3種不同的混合型基質(zhì)分散凈化物，乙二胺-N-丙基硅烷PSA、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB。3種基質(zhì)分散凈化物均能有效去除干擾，降低基線，減少雜峰數(shù)目，明顯改善AM、13C3-AM峰高，其中PSA+C18的改善效果最為明顯，凈化前后對(duì)比見(jiàn)圖5。

圖5 紅糖樣品凈化前后對(duì)比

2.3 色譜條件優(yōu)化

丙烯酰胺溴化加成的產(chǎn)物2,3-二溴丙酰胺作為有機(jī)鹵化物，屬于極性分子，根據(jù)相似相溶原理，選取具有強(qiáng)偶極力的聚乙二醇(PEG)作為固定相，2,3-二溴丙酰胺具有較高的沸點(diǎn)，且在WAX色譜柱上240 ℃左右出峰，而Heavywax屬于耐高溫的WAX色譜柱，溫度上限為恒溫280 ℃，高于一般的WAX色譜柱，能夠有效地縮短運(yùn)行時(shí)間，且在高溫段的后段運(yùn)行烘烤色譜柱，有助于將氣化進(jìn)入色譜柱的高沸點(diǎn)物質(zhì)趕出，有助于減少樣品的基質(zhì)效應(yīng)，降低交叉污染以及出現(xiàn)鬼峰的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于典型的需要低載氣流速的GC-MS系統(tǒng)，選擇0.25 mm內(nèi)徑較小的色譜柱，因此選擇DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱。柱溫是影響分析時(shí)間和分離度的重要因素，采用程序升溫模式能夠有效地使目標(biāo)物和干擾物分離，獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，由于對(duì)單一物質(zhì)進(jìn)行分析，階段升溫設(shè)置相對(duì)簡(jiǎn)單：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，再以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。獲得的溴化反應(yīng)后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺總離子流圖見(jiàn)圖6。

圖6 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺總離子流圖

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

溴化反應(yīng)后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺在70 eV的能量轟擊下，相應(yīng)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7，獲得的碎片離子見(jiàn)表4。

表4 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺分子式及質(zhì)譜參數(shù)

圖7 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物質(zhì)譜圖

由于溴有2種穩(wěn)定同位素：Br-79(50.69%)和Br-79(49.31%)，占比相似，特征性很強(qiáng)。因此，在同一碎片離子間存在m/z為2的差距，且該碎片具有近乎一致的相對(duì)豐度值。其中149作為鄰苯二甲酸酯的特性離子，鄰苯二甲酸酯存在廣譜污染性，經(jīng)常存在于實(shí)驗(yàn)室溶劑中；108作為丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物共有的碎片離子，且作為碳13標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與目標(biāo)物出峰時(shí)間相同；136作為柱流失的特征離子，會(huì)造成高溫段的基線升高，影響靈敏度，因此在選擇離子時(shí)應(yīng)盡量避開(kāi)這3個(gè)碎片離子。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 線性范圍、檢出限及定量限

以AM濃度作為橫坐標(biāo)、AM與13C3-AM峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，得到濃度在0.0100～1.00 μg/mL丙烯酰胺的線性擬合方程Y=8.3466X+0.0762(Y為丙烯酰胺峰面積與內(nèi)標(biāo)13C3-丙烯酰胺的比值，X為丙烯酰胺的質(zhì)量濃度)，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。以3倍信噪比確定方法檢出限(LOD)為0.4 μg/kg，以10倍信噪比確定方法定量限(LOQ)為1.3 μg/kg。

2.5.2 精密度和回收率

選取2種不同丙烯酰胺含量的紅糖進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)。對(duì)低濃度丙烯酰胺含量的紅糖樣品，分別選取25，50，100 μg/kg低、中、高3個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)；對(duì)高濃度丙烯酰胺含量的紅糖樣品，分別選取200，400，800 μg/kg低中高3個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表5。

表5 不同紅糖樣品中AM添加測(cè)定

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

分別對(duì)云南、廣西、廣東、江蘇4個(gè)國(guó)內(nèi)主要的紅糖生產(chǎn)地區(qū)在售的3種不同紅糖，以及從2個(gè)國(guó)家進(jìn)口的紅糖，共14批次樣品進(jìn)行丙烯酰胺含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。顯然，紅糖中丙烯酰胺的含量跨度較大，從25～960 μg/kg不等，多分布在500 μg/kg附近，其中2個(gè)有機(jī)紅糖丙烯酰胺含量較低，分別為25.4 μg/kg和30.2 μg/kg。

圖8 紅糖樣品中丙烯酰胺含量

3 結(jié)論

本文通過(guò)DB-Heavywax毛細(xì)管柱分離，建立了使用單四極桿質(zhì)譜儀選擇離子監(jiān)控模式檢測(cè)紅糖中丙烯酰胺含量的方法。采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定溴化反應(yīng)的最佳條件為10%濃硫酸加入量為8 mL，反應(yīng)溫度為4 ℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min，并選擇以乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18作為吸附劑填料對(duì)溴化反應(yīng)后樣品進(jìn)行凈化。該方法操作簡(jiǎn)單，具有較高的回收率和較好的重復(fù)性，能夠滿(mǎn)足紅糖中丙烯酰胺含量的測(cè)定要求，符合日常監(jiān)督和檢測(cè)要求，為紅糖類(lèi)食品的質(zhì)量監(jiān)管提供了技術(shù)支持。