方麗,王李平,張方圓,李雪瑩,潘云山,張麗,黃嘉穎
(廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心),廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心,廣州 510070)
紅糖(brown sugar)指帶蜜的甘蔗成品糖,以甘蔗為原料,經(jīng)提取糖汁、清凈處理后,直接煮煉,不經(jīng)分蜜煉制而成[1]。整個(gè)加工過(guò)程中不加入除石灰外任何化學(xué)試劑及食品添加劑,完全保留甘蔗原有風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。紅糖與白砂糖、赤砂糖等精制糖不同,是一種非分蜜糖,即未經(jīng)過(guò)分蜜處理制成的糖。在未大規(guī)模生產(chǎn)精制糖時(shí)期,甘蔗糖的主要消費(fèi)形式即非分蜜糖。在全球范圍內(nèi)有不同的名稱(chēng)和形態(tài),廣為人知的是日本沖繩黑糖(Kokuto)、拉丁美洲紅糖(Panela)和南亞、非洲粗糖(Jaggery)等,本質(zhì)上來(lái)說(shuō)它們都是甘蔗汁的濃縮產(chǎn)物[2]。
紅糖主要成分為蔗糖、果糖、葡萄糖等,另外還含有被認(rèn)為是益生元的低聚果糖,含量高達(dá)500 mg/g[3]。作為甘蔗的全汁濃縮物,紅糖保留了甘蔗中的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),含有具有抗氧化作用的甘蔗多酚,如奎尼酸、原兒茶酸、阿魏酸等多種酚酸[4]。還含有微量的參與人體代謝和細(xì)胞調(diào)節(jié)的維生素,包括維生素A、維生素E、維生素D、煙酸、泛酸等[5]。陳其釗等[6]的研究表明,紅糖中的植物甾醇含量明顯高于赤砂糖,而植物甾醇對(duì)于預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)傷口愈合等方面具有積極作用。紅糖中包含鐵、鋅、錳、銅、硒等多種微量元素[7],這些微量元素是人體代謝必需的活性因子。紅糖與其他功能性藥食同源植物合理配伍,能夠增強(qiáng)其保健功效,因此出現(xiàn)了生姜紅糖、益母紅糖等功能性紅糖。除了上述保健作用外,紅糖還具有調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用,其中含有幾十種香氣物質(zhì)[8]。Tian等[9]研究表明紅糖對(duì)雞肉調(diào)味品的風(fēng)味品質(zhì)具有積極影響。Chen Erbao等[10]通過(guò)GC-O-MS對(duì)紅糖的氣味進(jìn)行了分析,檢測(cè)到豐富的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(如吡嗪類(lèi)和呋喃酮類(lèi)物質(zhì))。
丙烯酰胺是一種具有親電基團(tuán)的有機(jī)小分子,對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)都有一定的毒性[11],世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)將其列為2A類(lèi)致癌物,即“人類(lèi)可能致癌物”。天冬酰胺參與的美拉德反應(yīng)是食品中丙烯酰胺的主要來(lái)源[12],發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺主要存在于薯?xiàng)l、面包、咖啡等油炸、焙烤食品中,而紅糖中存在丙烯酰胺鮮有報(bào)道。丙烯酰胺的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,以及新型的檢測(cè)技術(shù)如基于褐變的快速測(cè)定、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、生物傳感器法及熒光傳感法[13]。本文以紅糖作為研究對(duì)象,優(yōu)化并建立其中丙烯酰胺含量的檢測(cè)方法。
1.1.1 樣品
紅糖樣品選取云南、廣西、廣東、江蘇4個(gè)國(guó)內(nèi)主要的紅糖生產(chǎn)地區(qū)所生產(chǎn)的紅糖,以及從兩個(gè)國(guó)家進(jìn)口的紅糖。樣品購(gòu)買(mǎi)后密封于冰箱中冷藏貯存。
1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
丙烯酰胺(Acrylamide,簡(jiǎn)稱(chēng)AM,CAS:79-06-1):1000 μg/mL,介質(zhì)甲醇,提供商為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)(13C3-Acrylamide,簡(jiǎn)稱(chēng)13C3-AM,CAS:287399-26-2):1000 μg/mL,介質(zhì)甲醇,提供商為First Standard。
1.1.3 試劑
乙酸乙酯(色譜純,Honeywell)、甲醇(色譜純,Honeywell)、溴化鉀(分析純,廣試)、溴酸鉀(分析純,廣試)、無(wú)水硫酸鈉(分析純,廣試,在650 ℃下灼燒4 h,貯存于干燥器中,冷卻備用)、硫代硫酸鈉(分析純,麥克林)、實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.1.4 基質(zhì)分散材料
乙二胺-N-丙基硅烷PSA(150 mg MgSO4+50 mg PSA/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18/2 mL)、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB(150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB/2 mL)。
1.2.1 AM標(biāo)準(zhǔn)溶液
取0.25 mL AM標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成10 μg/mL的AM標(biāo)準(zhǔn)溶液,在-18 ℃下保存。
1.2.213C3-AM內(nèi)標(biāo)溶液
取0.25 mL13C3-AM標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于25 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液,在-18 ℃下保存。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線
分別取0.01,0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0 mL的10 μg/mL AM標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.5 mL的10 μg/mL13C3-AM內(nèi)標(biāo)溶液于10 mL容量瓶中用超純水定容至10 mL,得10,50,100,200,500,800,1000 ng/mL內(nèi)標(biāo)濃度為500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線,臨用時(shí)配制。
Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊源) 美國(guó)安捷倫科技公司;E320食品料理機(jī) 美國(guó)Vitamix公司;多位試管渦旋振蕩器 德國(guó)Heidolph公司;N-EVAP 112氮吹儀 美國(guó)Organomation;移液器 美國(guó)Gilson公司;電子天平 德國(guó)Sartorius公司;CF 16RXⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司;MPR-210冰箱 日本松下電器(中國(guó))有限公司;50 mL三角瓶、250 mL分液漏斗 博美(北京)玻璃有限公司;比色管(10 mL和100 mL) 天津天玻科技發(fā)展有限公司。
將紅糖樣品放入食品料理機(jī)內(nèi),打碎混勻后,收集在密封袋中做好標(biāo)示,備用。稱(chēng)取5 g(精確至0.001 g)制備樣于50 mL離心管中,加入20 mL超純水,渦旋10 min后放入冰箱中冷藏待反應(yīng)。稱(chēng)取5 g溴化鉀于100 mL比色管中,加入10 mL超純水,渦旋溶解后,依次加入6 mL 10%濃硫酸溶液、冷藏的樣品溶液和20 mL 0.4 mol/L溴酸鉀溶液,避光置于4 ℃冰箱中反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后,加入40 mL飽和的硫代硫酸鈉溶液,轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中,用50 mL乙酸乙酯分3次萃取,收集乙酸乙酯層,加入無(wú)水硫酸鈉脫水后,氮吹至近干,用乙酸乙酯定容至1 mL。將定容后溶液移入PSA+C18的凈化管內(nèi),渦旋1 min,4000 r/min離心3 min后,取上清液,進(jìn)行GC-MS分析,測(cè)試樣品。
1.5.1 色譜條件
色譜柱:DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣量2 μL,進(jìn)樣口溫度250 ℃;進(jìn)樣模式:脈沖不分流;載氣:高純He,純度99.999%;流速:1.2 mL/min;升溫程序:65 ℃保持1 min,以15 ℃/min升至200 ℃,再以40 ℃/min升至260 ℃,保持3 min。
1.5.2 質(zhì)譜條件
離子源:電子轟擊式離子源(EI,70 eV);離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,傳輸線溫度240 ℃;溶劑延遲5 min;采集模式:選擇離子檢測(cè)(SIM),AM(151,133,135,106);13C3-AM(154,152,136,110),其中帶下劃線的質(zhì)荷比(m/z)為定量離子,其余3個(gè)為定性離子。
丙烯酰胺溶于水,且紅糖在水中易于溶解,因此直接將紅糖樣品經(jīng)渦旋溶解于超純水后,用于溴化衍生。由于衍生產(chǎn)物2,3-二溴丙酰胺微溶于水,易溶于乙酸乙酯,且有機(jī)化合物在兩種溶劑中的分配系數(shù)介于0.1~100之間,用一定量的溶劑分批多次萃取的效率要比一次萃取效率高,因此衍生結(jié)束后,加入飽和的硫代硫酸鈉消除多余的溴單質(zhì),采用50 mL乙酸乙酯分3次對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行萃取,收集乙酸乙酯層,脫水、濃縮、凈化后,用GC-MS進(jìn)行分析。
由于丙烯酰胺在熔點(diǎn)溫度時(shí)很容易聚合,氣相色譜無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)其低濃度含量的分析。且其相對(duì)分子量?jī)H為71,離子化碎片主要為71,55,44,27,碎片m/z小,進(jìn)行GC-MS分析時(shí),干擾較大。因此,采用溴化加成,使丙烯酰胺轉(zhuǎn)換為2,3-二溴丙酰胺,增加了丙烯酰胺的熱穩(wěn)定性以及對(duì)檢測(cè)器的靈敏度和選擇性,再用GC-MS進(jìn)行分析。
溴單質(zhì)的獲取途徑為溴化鉀-溴酸鉀與濃硫酸混合反應(yīng)。利用在極性溶劑中,溴容易發(fā)生異裂,生成溴離子,與丙烯酰胺中的烯鍵發(fā)生加成反應(yīng),生成2,3-二溴丙酰胺,反應(yīng)結(jié)束后,用硫代硫酸鈉溶液除去多余的溴單質(zhì),反應(yīng)方程式如下:
5KBr+KBrO3+3H2SO4=3Br2+3H2O+3K2SO4。
CH2=CHCONH2+Br2=CH2BrCHBrCONH2。
Na2S2O3+4Br2+5H2O=Na2SO4+H2SO4+8KBr。
由于加入的溴化鉀和溴酸鉀過(guò)量,能夠滿(mǎn)足衍生反應(yīng)要求,反應(yīng)過(guò)程所涉及的關(guān)鍵因素為濃硫酸溶液的加入量、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間。
2.1.1 影響溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的單因素實(shí)驗(yàn)考察
先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行五水平實(shí)驗(yàn)考察。首先對(duì)最主要的因素——濃硫酸加入量進(jìn)行考察,分別選取10%濃硫酸加入量為2,4,6,8,10 mL這5個(gè)水平,反應(yīng)溫度4 ℃,反應(yīng)時(shí)間30 min,以不同水平實(shí)驗(yàn)作為橫坐標(biāo)、相對(duì)響應(yīng)值作為縱坐標(biāo),繪制濃硫酸溶液加入量對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響的單因素實(shí)驗(yàn)曲線,見(jiàn)圖1。
圖1 濃硫酸溶液的加入量對(duì)結(jié)果的影響
由圖1可知,隨著10%濃硫酸加入量的逐漸增大,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì),當(dāng)加入量超過(guò)8 mL時(shí),繼續(xù)增加加入量,相對(duì)響應(yīng)值無(wú)明顯變化,故選擇10%濃硫酸的加入量為8 mL。
考察不同溫度下溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。丙烯酰胺極易升華和聚合,在室溫條件下穩(wěn)定。用于反應(yīng)的溴單質(zhì)在常溫、常壓下是具有揮發(fā)性的紅黑色液體,且溴蒸氣具有腐蝕性、有毒。因此,根據(jù)丙烯酰胺和溴單質(zhì)的理化性質(zhì),考察溫度時(shí)分別選取0,4,8,12,16 ℃這5個(gè)水平,加入8 mL的10%濃硫酸,反應(yīng)時(shí)間30 min,以不同水平實(shí)驗(yàn)作為橫坐標(biāo)、相對(duì)響應(yīng)值作為縱坐標(biāo),繪制溫度對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響的單因素實(shí)驗(yàn)曲線,見(jiàn)圖2。
圖2 反應(yīng)溫度對(duì)結(jié)果的影響
由圖2可知,當(dāng)溫度為4 ℃時(shí),相對(duì)響應(yīng)值最大,隨著反應(yīng)溫度的上升,相對(duì)響應(yīng)值反而下降,可能與丙烯酰胺的穩(wěn)定性有關(guān)。
考察不同時(shí)間下溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率??疾旆磻?yīng)時(shí)間時(shí)分別選取10,20,30,40,50 min這5個(gè)水平,加入8 mL的10%濃硫酸,反應(yīng)溫度為4 ℃,以不同水平實(shí)驗(yàn)作為橫坐標(biāo)、相對(duì)響應(yīng)值作為縱坐標(biāo),繪制時(shí)間對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響的單因素實(shí)驗(yàn)曲線,見(jiàn)圖3。
圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響
由圖3可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,相對(duì)響應(yīng)值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),當(dāng)時(shí)間為40 min時(shí),相對(duì)響應(yīng)值達(dá)到峰值,因此選擇反應(yīng)時(shí)間為40 min。
單因素實(shí)驗(yàn)存在各因素之間沒(méi)有交互作用這個(gè)假定,而在實(shí)際問(wèn)題中,各因素相互獨(dú)立的情況極少。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上,同時(shí)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn),對(duì)衍生條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。
2.1.2 影響溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面優(yōu)化
根據(jù)Box-Behnken Design的中心組合設(shè)計(jì)原理,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),因素和水平選擇見(jiàn)表1。
表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平
以10%濃硫酸加入量(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時(shí)間(C)為自變量,以反應(yīng)后產(chǎn)物2,3-二溴丙酰胺的響應(yīng)值比率為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)Design-Expert軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)分析,建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:Y=11.21A+3.92B-0.18C-8.09AB+1.29AC+3.8BC-9.37A2-15.28B2-9.81C2,對(duì)其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與方差分析,見(jiàn)表3。
表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析
由表3可知,回歸模型的P值<0.001,表明該模型回歸效果顯著,可反映實(shí)際結(jié)果的R2=0.9929,表明模型的擬合結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相關(guān)度高,失擬項(xiàng)的P值為0.2673>0.05,表明該回歸方程擬合度較高,誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。在所有作用因素中,一次項(xiàng)A、交互相AB以及二次項(xiàng) A2、B2、C2對(duì)目標(biāo)化合物的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響極顯著(P<0.001)。由表3中F值可知,各因素對(duì)溴化加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響大小順序?yàn)椋?0%濃硫酸加入量(A)>反應(yīng)溫度(B)>反應(yīng)時(shí)間(C)。
利用Design Expert軟件,通過(guò)多元回歸方程做出響應(yīng)面圖,見(jiàn)圖4。因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可由等高線圖的形狀來(lái)分析。等高線圖越接近于橢圓,表明因素之間的交互作用越強(qiáng)烈[14]。
圖4 兩因素交互影響反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面
由圖4可知,10%濃硫酸加入量和反應(yīng)溫度(AB)的交互作用最為顯著,其次是10%濃硫酸加入量和反應(yīng)時(shí)間(AC),影響最小的為反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間(BC)。最終確定溴化加成反應(yīng)的條件為10%濃硫酸加入量為8 mL,反應(yīng)溫度為4 ℃,反應(yīng)時(shí)間為40 min,并以2,3-二溴丙酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CAS:15102-42-8)作為基準(zhǔn),確定反應(yīng)產(chǎn)物濃度,得到上述條件下的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為98.7%,完全滿(mǎn)足方法要求。
由于紅糖所包含的成分較多,在衍生化反應(yīng)過(guò)程中,亦會(huì)引入部分雜質(zhì),在GC-MS分析時(shí)體現(xiàn)為雜峰多、基線上升,從而影響定量、定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。該實(shí)驗(yàn)凈化利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理,采用吸附劑與碳水化合物等干擾物結(jié)合,通過(guò)離心方式去除,從而達(dá)到凈化的目的。比較了3種不同的混合型基質(zhì)分散凈化物,乙二胺-N-丙基硅烷PSA、乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18、乙二胺-N-丙基硅烷和石墨化炭黑PSA+GCB。3種基質(zhì)分散凈化物均能有效去除干擾,降低基線,減少雜峰數(shù)目,明顯改善AM、13C3-AM峰高,其中PSA+C18的改善效果最為明顯,凈化前后對(duì)比見(jiàn)圖5。
圖5 紅糖樣品凈化前后對(duì)比
丙烯酰胺溴化加成的產(chǎn)物2,3-二溴丙酰胺作為有機(jī)鹵化物,屬于極性分子,根據(jù)相似相溶原理,選取具有強(qiáng)偶極力的聚乙二醇(PEG)作為固定相,2,3-二溴丙酰胺具有較高的沸點(diǎn),且在WAX色譜柱上240 ℃左右出峰,而Heavywax屬于耐高溫的WAX色譜柱,溫度上限為恒溫280 ℃,高于一般的WAX色譜柱,能夠有效地縮短運(yùn)行時(shí)間,且在高溫段的后段運(yùn)行烘烤色譜柱,有助于將氣化進(jìn)入色譜柱的高沸點(diǎn)物質(zhì)趕出,有助于減少樣品的基質(zhì)效應(yīng),降低交叉污染以及出現(xiàn)鬼峰的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于典型的需要低載氣流速的GC-MS系統(tǒng),選擇0.25 mm內(nèi)徑較小的色譜柱,因此選擇DB-Heavywax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱。柱溫是影響分析時(shí)間和分離度的重要因素,采用程序升溫模式能夠有效地使目標(biāo)物和干擾物分離,獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,由于對(duì)單一物質(zhì)進(jìn)行分析,階段升溫設(shè)置相對(duì)簡(jiǎn)單:65 ℃保持1 min,以15 ℃/min升至200 ℃,再以40 ℃/min升至260 ℃,保持3 min。獲得的溴化反應(yīng)后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺總離子流圖見(jiàn)圖6。
圖6 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺總離子流圖
溴化反應(yīng)后的丙烯酰胺及13C3-丙烯酰胺在70 eV的能量轟擊下,相應(yīng)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7,獲得的碎片離子見(jiàn)表4。
表4 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺分子式及質(zhì)譜參數(shù)
圖7 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物質(zhì)譜圖
由于溴有2種穩(wěn)定同位素:Br-79(50.69%)和Br-79(49.31%),占比相似,特征性很強(qiáng)。因此,在同一碎片離子間存在m/z為2的差距,且該碎片具有近乎一致的相對(duì)豐度值。其中149作為鄰苯二甲酸酯的特性離子,鄰苯二甲酸酯存在廣譜污染性,經(jīng)常存在于實(shí)驗(yàn)室溶劑中;108作為丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺溴化物共有的碎片離子,且作為碳13標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與目標(biāo)物出峰時(shí)間相同;136作為柱流失的特征離子,會(huì)造成高溫段的基線升高,影響靈敏度,因此在選擇離子時(shí)應(yīng)盡量避開(kāi)這3個(gè)碎片離子。
2.5.1 線性范圍、檢出限及定量限
以AM濃度作為橫坐標(biāo)、AM與13C3-AM峰面積的比值作為縱坐標(biāo),采用最小二乘法進(jìn)行回歸分析,得到濃度在0.0100~1.00 μg/mL丙烯酰胺的線性擬合方程Y=8.3466X+0.0762(Y為丙烯酰胺峰面積與內(nèi)標(biāo)13C3-丙烯酰胺的比值,X為丙烯酰胺的質(zhì)量濃度),相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。以3倍信噪比確定方法檢出限(LOD)為0.4 μg/kg,以10倍信噪比確定方法定量限(LOQ)為1.3 μg/kg。
2.5.2 精密度和回收率
選取2種不同丙烯酰胺含量的紅糖進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)。對(duì)低濃度丙烯酰胺含量的紅糖樣品,分別選取25,50,100 μg/kg低、中、高3個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn);對(duì)高濃度丙烯酰胺含量的紅糖樣品,分別選取200,400,800 μg/kg低中高3個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),得到相應(yīng)的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表5。
表5 不同紅糖樣品中AM添加測(cè)定
分別對(duì)云南、廣西、廣東、江蘇4個(gè)國(guó)內(nèi)主要的紅糖生產(chǎn)地區(qū)在售的3種不同紅糖,以及從2個(gè)國(guó)家進(jìn)口的紅糖,共14批次樣品進(jìn)行丙烯酰胺含量檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。顯然,紅糖中丙烯酰胺的含量跨度較大,從25~960 μg/kg不等,多分布在500 μg/kg附近,其中2個(gè)有機(jī)紅糖丙烯酰胺含量較低,分別為25.4 μg/kg和30.2 μg/kg。
圖8 紅糖樣品中丙烯酰胺含量
本文通過(guò)DB-Heavywax毛細(xì)管柱分離,建立了使用單四極桿質(zhì)譜儀選擇離子監(jiān)控模式檢測(cè)紅糖中丙烯酰胺含量的方法。采用單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定溴化反應(yīng)的最佳條件為10%濃硫酸加入量為8 mL,反應(yīng)溫度為4 ℃,反應(yīng)時(shí)間為40 min,并選擇以乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅膠PSA+C18作為吸附劑填料對(duì)溴化反應(yīng)后樣品進(jìn)行凈化。該方法操作簡(jiǎn)單,具有較高的回收率和較好的重復(fù)性,能夠滿(mǎn)足紅糖中丙烯酰胺含量的測(cè)定要求,符合日常監(jiān)督和檢測(cè)要求,為紅糖類(lèi)食品的質(zhì)量監(jiān)管提供了技術(shù)支持。