李長(zhǎng)濱,王釗,劉文靜,吳圣江
(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450046;2.河南華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司,鄭州 453100)
亞硫酸鹽是食品工業(yè)中廣泛使用的一種食品添加劑,可作為食品漂白劑、防腐劑和抗菌劑,也可抑制非酶褐變和酶促褐變,常用于食品的護(hù)色、防腐、漂白、抗氧化以及延長(zhǎng)食品貨架期等方面[1]。亞硫酸鹽可以與食品中的水生成亞硫酸、硫酸、二氧化硫等物質(zhì),其中二氧化硫可以參與人體血液循環(huán),破壞細(xì)胞酶活力,引起體內(nèi)碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝異常,人體在二氧化硫中毒后,機(jī)體的免疫功能嚴(yán)重受損。二氧化硫還會(huì)刺激呼吸道平滑肌發(fā)生收縮,從而引起一系列呼吸道疾病[2-3]。
蜜餞是以果蔬為原料,經(jīng)糖、蜂蜜或食鹽腌制而成的傳統(tǒng)食品,其制作過程大都添加亞硫酸鹽類物質(zhì)以防止蜜餞發(fā)生褐變,保持產(chǎn)品色澤鮮艷,延長(zhǎng)其貨架期[4]。蜜餞類休閑食品,諸如芒果干、草莓干、楊梅干、藍(lán)莓干、半梅等其配料表中均明確標(biāo)注了焦亞硫酸鈉,因此蜜餞類食品中二氧化硫殘留量的檢測(cè)是保障其安全的重要手段。國(guó)標(biāo)GB 5009.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測(cè)定》中規(guī)定了二氧化硫的測(cè)定方法為滴定法[5],該方法存在滴定終點(diǎn)不靈敏、重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性較差的劣勢(shì),而且樣品處理需要蒸餾,操作過程較為繁瑣,不適合批量樣品的檢測(cè)。另有研究報(bào)道,高效液相色譜法、氣相色譜法、蒸餾碘量法等用于二氧化硫殘留的量測(cè)定[6],色譜法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),但是存在儀器昂貴、檢測(cè)費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。顧娉婷[7]使用全自動(dòng)蛋白測(cè)定儀對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行改進(jìn),簡(jiǎn)化了蒸餾過程,但是試驗(yàn)結(jié)果表明使用改進(jìn)后的方法與國(guó)標(biāo)法并沒有顯著差別。此外,還有利用比色法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、電化學(xué)法、熒光探針法以及試劑盒等快檢法對(duì)二氧化硫進(jìn)行測(cè)定和分析[8-14]。比色法準(zhǔn)確度低、容易受周圍環(huán)境影響且試驗(yàn)過程需使用有毒試劑,拉曼光譜法和電化學(xué)法具有重復(fù)性差的缺點(diǎn),熒光探針法使用范圍受限,試劑盒等快檢方法具有準(zhǔn)確度低的劣勢(shì)[15]。尋求一種簡(jiǎn)單、快捷且同時(shí)適合大批量樣品測(cè)定的方法意義重大。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定樣品使用量少等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于微量元素、重金屬元素、特異性熒光化合物等的定性及定量分析[16-17],通過熒光分光光度法試驗(yàn)條件的優(yōu)化,建立一種蜜餞食品中二氧化硫殘留量的檢測(cè)方法,為蜜餞類產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及產(chǎn)品檢測(cè)提供了更多選擇。
蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干:鄭州市丹尼斯超市;亞硫酸鈉(分析純):天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛(分析純):上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;乙酸銨(分析純):廣東光華化學(xué)廠有限公司;十二水合磷酸氫二鈉(分析純):西隴化工股份有限公司;磷酸二氫鉀(分析純):天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;無水乙醇(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)用水為去離子水。
F380熒光分光光度計(jì) 天津港東科技股份有限公司;FA1004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HH-6恒溫水浴鍋 上海高致精密儀器有限公司;ZL22-500A超聲波振蕩儀 上海左樂儀器有限公司;JJ-2BS破壁機(jī) 美的科技有限公司。
1.3.1 樣品前處理
分別將蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干用破壁機(jī)粉碎成小塊,再準(zhǔn)確稱量5.0000 g,加入0.5%的氫氧化鈉溶液100 mL,超聲提取 30 min后以8000 r/min 離心5 min,取上清液1.0 mL 用水稀釋至10 mL,待用。
1.3.2 最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的確定
吸取已配制好的相當(dāng)于10 μg/mL二氧化硫的亞硫酸鈉標(biāo)液1.0 mL置于50 mL容量瓶中,依次加入pH為6.6的緩沖溶液、1.0 mmol/L鄰苯二甲醛溶液、5.0 mmol/L乙酸銨溶液各2.0 mL,定容混勻,置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱反應(yīng)10 min后取出,放入冷水中終止反應(yīng),靜置30 min后取出,使用熒光分光光度計(jì)掃描吸收光譜和發(fā)射光譜,由此得出最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。
1.3.3 亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
將濃度為100 μg/mL的亞硫酸鈉標(biāo)品稀釋成濃度為1 μg/mL的亞硫酸鈉儲(chǔ)備液,使用時(shí)移取0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL亞硫酸鈉儲(chǔ)備液分別置于50 mL容量瓶中,依次加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液、1.0 mmol/L鄰苯二甲醛溶液和5.0 mmol/L乙酸銨溶液各2.0 mL,定容混勻,再將其置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min后立即取出,放入冷水中終止反應(yīng),靜置30 min后在激發(fā)波長(zhǎng)為324 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為390 nm的條件下,以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、二氧化硫的濃度為橫坐標(biāo),繪制亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.4 試驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果的影響
1.3.4.1 單因素試驗(yàn)
分別探究緩沖液pH值(6.2,6.4,6.6,6.8,7.0)、緩沖液添加量(1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 mL)、鄰苯二甲醛溶液用量(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL)、乙酸銨用量(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。
1.3.4.2 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,探究緩沖液pH、鄰苯二甲醛溶液用量、乙酸銨溶液用量之間交互作用對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的影響,根據(jù)單因素試驗(yàn)所得最優(yōu)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn),尋找優(yōu)化方案并進(jìn)行極差、方差分析。
1.3.5 二氧化硫殘留量計(jì)算
式中:X為二氧化硫含量,mg/kg;C為標(biāo)曲計(jì)算得出的二氧化硫濃度,μg/mL;V提取為樣品提取時(shí)使用超純水體積,mL;V定容為反應(yīng)定容體積,mL;V吸取為吸取樣品提取液體積,mL;M稱量為樣品稱量質(zhì)量,g。
設(shè)定儀器發(fā)射波長(zhǎng)為386 nm,掃描激發(fā)波長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)在324 nm處出現(xiàn)最大激發(fā)光譜峰,設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為324 nm,掃描發(fā)射波長(zhǎng),在390 nm處出現(xiàn)最大發(fā)射光譜峰,見圖1。
圖1 激發(fā)發(fā)射掃描光譜圖
根據(jù)掃描結(jié)果,設(shè)定熒光分光光度計(jì)參數(shù):激發(fā)波長(zhǎng)為324 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為390 nm,激發(fā)波長(zhǎng)狹縫為5.0 nm,發(fā)射波長(zhǎng)狹縫為5.0 nm,PMT電壓為400 V,增益指數(shù)為2,曝光時(shí)間為0.1 s,延遲0 s。
2.2.1 緩沖液pH值及用量的影響
緩沖液pH值的大小及添加量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖2。
圖2 緩沖液pH值及添加量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響
由圖2可知,pH范圍在6.0~6.2之間時(shí),熒光強(qiáng)度增加幅度并不明顯,pH在6.2~6.4之間時(shí),熒光強(qiáng)度呈指數(shù)性增加,緩沖溶液的pH為6.4時(shí),體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值322,pH在6.4~6.6之間時(shí),熒光強(qiáng)度緩慢減小,pH再增加時(shí),該數(shù)值加劇減小。方差分析結(jié)果顯示,緩沖液pH值為6.6與pH值為6.4和6.8對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度大小有顯著性差異(P<0.05),緩沖溶液的pH為6.4較適宜。
在緩沖溶液添加量范圍在1.0~3.5 mL之間時(shí),隨著緩沖溶液添加量的增加,熒光強(qiáng)度先增大后減小,當(dāng)緩沖溶液的添加量為2.0 mL時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值,隨后和pH值呈負(fù)相關(guān)。原因可能是在特定pH值條件下分子有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)像,pH值變大和變小均會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[18]。方差分析結(jié)果顯示,緩沖溶液添加量為2.0 mL與添加量為1.5,2.5 mL對(duì)熒光強(qiáng)度有顯著差異(P<0.05),因此選擇緩沖溶液添加量為2.0 mL。
2.2.2 鄰苯二甲醛用量的影響
鄰苯二甲醛用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖3。
圖3 鄰苯二甲醛添加量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響
由圖3可知,隨著鄰苯二甲醛添加量的增加,體系熒光強(qiáng)度先增加后降低,鄰苯二甲醛添加量在0.5~2.0 mL之間時(shí),其熒光強(qiáng)度基本呈線性增加,為鄰苯二甲醛添加量為2.0 mL時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)最大值420.54。而鄰苯二甲醛添加量超過2.0 mL之后,熒光強(qiáng)度的數(shù)值迅速減小,原因可能是鄰苯二甲醛添加量過大,熒光物質(zhì)分子易與溶劑分子相互作用發(fā)生熒光猝滅效應(yīng),或熒光物質(zhì)在樣品池中分布不均勻發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng),從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度變低[19]。方差分析結(jié)果顯示,鄰苯二甲醛添加量為2.0 mL和添加量為1.5,2.5 mL有顯著性差異(P<0.05),因此,鄰苯二甲醛加入量為2.0 mL較適宜。
2.2.3 乙酸銨用量的影響
乙酸銨用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖4。
圖4 乙酸銨添加量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響
由圖4可知,體系熒光強(qiáng)度隨著乙酸銨用量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)乙酸銨加入量為1.5 mL時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)最大值268.494。乙酸銨用量在0.5~1.5 mL時(shí),體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大,乙酸銨用量超過1.5 mL之后,熒光強(qiáng)度的數(shù)值呈減小趨勢(shì)。原因可能是乙酸銨屬于強(qiáng)電解質(zhì),易水解,添加量過大吸電子基團(tuán)COO-會(huì)削弱電子共軛性,熒光強(qiáng)度減弱[20]。方差分析結(jié)果顯示,乙酸銨用量為1.5 mL和用量為1.0,2.0 mL有顯著性差異(P<0.05),因此,乙酸銨加入量為1.5 mL較適宜。
2.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)條件
2.2.4.1 正交試驗(yàn)及結(jié)果
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,為探究磷酸鹽緩沖溶液pH值、鄰苯二甲醛加入量、乙酸銨加入量之間的交互作用對(duì)生成熒光強(qiáng)度的影響,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交條件(見表1),試驗(yàn)結(jié)果見表2。
表1 三因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表
表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果
由表2可知,在熒光化合物生成過程中,緩沖溶液pH(A)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響最大,其次是乙酸銨加入量(C),影響較小的是鄰苯二甲醛加入量(B);從均值結(jié)果可以看出,最佳條件組合是A3B3C3,即緩沖液pH值為6.6,鄰苯二甲醛加入量為2.0 mL,乙酸銨加入量為2.0 mL時(shí),熒光強(qiáng)度的效果最佳。
2.2.4.2 正交試驗(yàn)方差分析
對(duì)反應(yīng)條件三因素四水平正交試驗(yàn)的結(jié)果使用SPSS進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表3,利用多因素方差分析研究緩沖液pH、鄰苯二甲醛用量、乙酸銨用量對(duì)熒光強(qiáng)度的差異影響,由顯著性分析可知緩沖液pH值會(huì)對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生顯著性差異影響(P<0.05),而鄰苯二甲醛用量(P=0.859)、乙酸銨用量(P=0.361)并不會(huì)對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生差異影響。
表3 方差分析結(jié)果
對(duì)1.3.3中配制的溶液在激發(fā)波長(zhǎng)324 nm、發(fā)射波長(zhǎng)390 nm的條件下測(cè)定每個(gè)溶液的熒光強(qiáng)度,以亞硫酸鹽的濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖5。
圖5 亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖5可知,亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=290.92x+89.163,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993,其擬合程度高,可以用于二氧化硫含量的計(jì)算。
按1.3.1步驟處理樣品,然后按照1.3.3添加相應(yīng)的衍生化試劑后測(cè)定蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干中二氧化硫殘留量。每個(gè)樣品平行測(cè)定5次,結(jié)果見表4。
表4 5種樣品中二氧化硫殘留量測(cè)定結(jié)果
由表4可知,在優(yōu)化后的條件下測(cè)定蜜棗二氧化硫平均殘留量為35.731 mg/kg,藍(lán)莓干二氧化硫平均殘留量為13.087 mg/kg,話梅二氧化硫平均殘留量為300.542 mg/kg,葡萄干二氧化硫平均殘留量為127.092 mg/kg,芒果干二氧化硫平均殘留量為189.961 mg/kg,5種蜜餞樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD介于0.83%~4.59%之間,結(jié)果表明該方法的精密度較好。根據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算可知,熒光分光光度法測(cè)定二氧化硫檢出限為0.644 mg/kg。
2.5.1 回收率試驗(yàn)
取各類樣品各3份,分別加入100 μg/mL亞硫酸鈉使用液1.0 mL,測(cè)定熒光強(qiáng)度,計(jì)算加標(biāo)回收率以及平均回收率,結(jié)果見表5。
表5 加標(biāo)回收結(jié)果
由表5可知,5組樣品的加標(biāo)回收率在93.35%~106.50%之間,平均回收率在97.68%~102.71%之間,說明該檢測(cè)方法有良好的準(zhǔn)確性。
2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別取蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干樣本待測(cè)液,按照測(cè)定二氧化硫的方法測(cè)定其在0,0.5,1,1.5,2,2.5,3 h的熒光強(qiáng)度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5 h以內(nèi)5種樣本的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性好,RSD范圍在1.76%~2.64%之間,表明5種樣本的避光保存穩(wěn)定時(shí)間為2.5 h。
2.5.3 國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法比對(duì)
國(guó)標(biāo)GB 5009.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測(cè)定》規(guī)定方法為滴定法,為了進(jìn)一步驗(yàn)證熒光光度法的準(zhǔn)確性和適用性,同時(shí)將5個(gè)樣品用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定5次,并將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和差異分析,結(jié)果見表6。
表6 熒光分光光度法與國(guó)標(biāo)方法比較
由表6可知,熒光分光光度法和國(guó)標(biāo)法測(cè)定二氧化硫的結(jié)果無顯著差異(P>0.05),且熒光分光光度法建立的測(cè)定二氧化硫的分析方法精密度更好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適合蜜餞類食品中二氧化硫殘留量的測(cè)定。
本研究使用熒光分光光度計(jì)建立一套測(cè)定蜜餞食品中二氧化硫殘留量的新方法,通過掃描光譜發(fā)現(xiàn)最佳激發(fā)波長(zhǎng)為324 nm,最佳發(fā)射波長(zhǎng)為390 nm。對(duì)熒光化合物生成過程中緩沖液pH和添加量、鄰苯二甲醛加入量、乙酸銨加入量4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。最終確定最佳因素條件為緩沖液pH為6.6,鄰苯二甲醛用量、乙酸銨用量均為2.0 mL。根據(jù)優(yōu)化條件繪制亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為y=290.92x+89.163,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。對(duì)蜜棗、藍(lán)莓干、話梅、葡萄干、芒果干5個(gè)樣品進(jìn)行二氧化硫殘留量檢測(cè),二氧化硫殘留量均值分別為35.731,13.087,300.542,127.092,189.961 mg/kg,均未超過國(guó)標(biāo)要求的350 mg/kg。5種樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD介于0.83%~4.59%之間,加標(biāo)回收率均值在97.68%~102.71%之間,說明該方法有較好的準(zhǔn)確性和精密性。通過和國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果比對(duì),結(jié)果證明熒光分光光度法的精密度更好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于測(cè)定蜜餞食品中二氧化硫殘留量的分析。