熒光分光光度法測定蜜餞食品中二氧化硫殘留量研究

李長濱，王釗，劉文靜，吳圣江

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046；2.河南華測檢測技術(shù)有限公司，鄭州 453100)

亞硫酸鹽是食品工業(yè)中廣泛使用的一種食品添加劑，可作為食品漂白劑、防腐劑和抗菌劑，也可抑制非酶褐變和酶促褐變，常用于食品的護(hù)色、防腐、漂白、抗氧化以及延長食品貨架期等方面[1]。亞硫酸鹽可以與食品中的水生成亞硫酸、硫酸、二氧化硫等物質(zhì)，其中二氧化硫可以參與人體血液循環(huán)，破壞細(xì)胞酶活力，引起體內(nèi)碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝異常，人體在二氧化硫中毒后，機(jī)體的免疫功能嚴(yán)重受損。二氧化硫還會(huì)刺激呼吸道平滑肌發(fā)生收縮，從而引起一系列呼吸道疾病[2-3]。

蜜餞是以果蔬為原料，經(jīng)糖、蜂蜜或食鹽腌制而成的傳統(tǒng)食品，其制作過程大都添加亞硫酸鹽類物質(zhì)以防止蜜餞發(fā)生褐變，保持產(chǎn)品色澤鮮艷，延長其貨架期[4]。蜜餞類休閑食品，諸如芒果干、草莓干、楊梅干、藍(lán)莓干、半梅等其配料表中均明確標(biāo)注了焦亞硫酸鈉，因此蜜餞類食品中二氧化硫殘留量的檢測是保障其安全的重要手段。國標(biāo)GB 5009.34—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測定》中規(guī)定了二氧化硫的測定方法為滴定法[5]，該方法存在滴定終點(diǎn)不靈敏、重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性較差的劣勢，而且樣品處理需要蒸餾，操作過程較為繁瑣，不適合批量樣品的檢測。另有研究報(bào)道，高效液相色譜法、氣相色譜法、蒸餾碘量法等用于二氧化硫殘留的量測定[6]，色譜法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但是存在儀器昂貴、檢測費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。顧娉婷[7]使用全自動(dòng)蛋白測定儀對(duì)國標(biāo)法進(jìn)行改進(jìn)，簡化了蒸餾過程，但是試驗(yàn)結(jié)果表明使用改進(jìn)后的方法與國標(biāo)法并沒有顯著差別。此外，還有利用比色法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、電化學(xué)法、熒光探針法以及試劑盒等快檢法對(duì)二氧化硫進(jìn)行測定和分析[8-14]。比色法準(zhǔn)確度低、容易受周圍環(huán)境影響且試驗(yàn)過程需使用有毒試劑，拉曼光譜法和電化學(xué)法具有重復(fù)性差的缺點(diǎn)，熒光探針法使用范圍受限，試劑盒等快檢方法具有準(zhǔn)確度低的劣勢[15]。尋求一種簡單、快捷且同時(shí)適合大批量樣品測定的方法意義重大。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、操作簡便、測定樣品使用量少等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于微量元素、重金屬元素、特異性熒光化合物等的定性及定量分析[16-17]，通過熒光分光光度法試驗(yàn)條件的優(yōu)化，建立一種蜜餞食品中二氧化硫殘留量的檢測方法，為蜜餞類產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及產(chǎn)品檢測提供了更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干：鄭州市丹尼斯超市；亞硫酸鈉(分析純)：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛(分析純)：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；乙酸銨(分析純)：廣東光華化學(xué)廠有限公司；十二水合磷酸氫二鈉(分析純)：西隴化工股份有限公司；磷酸二氫鉀(分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；無水乙醇(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 試驗(yàn)儀器

F380熒光分光光度計(jì) 天津港東科技股份有限公司；FA1004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋 上海高致精密儀器有限公司；ZL22-500A超聲波振蕩儀 上海左樂儀器有限公司；JJ-2BS破壁機(jī) 美的科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

分別將蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干用破壁機(jī)粉碎成小塊，再準(zhǔn)確稱量5.0000 g，加入0.5%的氫氧化鈉溶液100 mL，超聲提取 30 min后以8000 r/min 離心5 min，取上清液1.0 mL 用水稀釋至10 mL，待用。

1.3.2 最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定

吸取已配制好的相當(dāng)于10 μg/mL二氧化硫的亞硫酸鈉標(biāo)液1.0 mL置于50 mL容量瓶中，依次加入pH為6.6的緩沖溶液、1.0 mmol/L鄰苯二甲醛溶液、5.0 mmol/L乙酸銨溶液各2.0 mL，定容混勻，置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱反應(yīng)10 min后取出，放入冷水中終止反應(yīng)，靜置30 min后取出，使用熒光分光光度計(jì)掃描吸收光譜和發(fā)射光譜，由此得出最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長。

1.3.3 亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將濃度為100 μg/mL的亞硫酸鈉標(biāo)品稀釋成濃度為1 μg/mL的亞硫酸鈉儲(chǔ)備液，使用時(shí)移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL亞硫酸鈉儲(chǔ)備液分別置于50 mL容量瓶中，依次加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液、1.0 mmol/L鄰苯二甲醛溶液和5.0 mmol/L乙酸銨溶液各2.0 mL，定容混勻，再將其置于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min后立即取出，放入冷水中終止反應(yīng)，靜置30 min后在激發(fā)波長為324 nm、發(fā)射波長為390 nm的條件下，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、二氧化硫的濃度為橫坐標(biāo)，繪制亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 試驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果的影響

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

分別探究緩沖液pH值(6.2，6.4，6.6，6.8，7.0)、緩沖液添加量(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL)、鄰苯二甲醛溶液用量(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL)、乙酸銨用量(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，探究緩沖液pH、鄰苯二甲醛溶液用量、乙酸銨溶液用量之間交互作用對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)所得最優(yōu)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn)，尋找優(yōu)化方案并進(jìn)行極差、方差分析。

1.3.5 二氧化硫殘留量計(jì)算

式中：X為二氧化硫含量，mg/kg；C為標(biāo)曲計(jì)算得出的二氧化硫濃度，μg/mL；V提取為樣品提取時(shí)使用超純水體積，mL；V定容為反應(yīng)定容體積，mL；V吸取為吸取樣品提取液體積，mL；M稱量為樣品稱量質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定

設(shè)定儀器發(fā)射波長為386 nm，掃描激發(fā)波長，發(fā)現(xiàn)在324 nm處出現(xiàn)最大激發(fā)光譜峰，設(shè)定激發(fā)波長為324 nm，掃描發(fā)射波長，在390 nm處出現(xiàn)最大發(fā)射光譜峰，見圖1。

圖1 激發(fā)發(fā)射掃描光譜圖

根據(jù)掃描結(jié)果，設(shè)定熒光分光光度計(jì)參數(shù)：激發(fā)波長為324 nm，發(fā)射波長為390 nm，激發(fā)波長狹縫為5.0 nm，發(fā)射波長狹縫為5.0 nm，PMT電壓為400 V，增益指數(shù)為2，曝光時(shí)間為0.1 s，延遲0 s。

2.2 熒光化合物生成條件優(yōu)化

2.2.1 緩沖液pH值及用量的影響

緩沖液pH值的大小及添加量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖2。

圖2 緩沖液pH值及添加量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖2可知，pH范圍在6.0～6.2之間時(shí)，熒光強(qiáng)度增加幅度并不明顯，pH在6.2～6.4之間時(shí)，熒光強(qiáng)度呈指數(shù)性增加，緩沖溶液的pH為6.4時(shí)，體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值322，pH在6.4～6.6之間時(shí)，熒光強(qiáng)度緩慢減小，pH再增加時(shí)，該數(shù)值加劇減小。方差分析結(jié)果顯示，緩沖液pH值為6.6與pH值為6.4和6.8對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度大小有顯著性差異(P<0.05)，緩沖溶液的pH為6.4較適宜。

在緩沖溶液添加量范圍在1.0～3.5 mL之間時(shí)，隨著緩沖溶液添加量的增加，熒光強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)緩沖溶液的添加量為2.0 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，隨后和pH值呈負(fù)相關(guān)。原因可能是在特定pH值條件下分子有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)像，pH值變大和變小均會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[18]。方差分析結(jié)果顯示，緩沖溶液添加量為2.0 mL與添加量為1.5，2.5 mL對(duì)熒光強(qiáng)度有顯著差異(P<0.05)，因此選擇緩沖溶液添加量為2.0 mL。

2.2.2 鄰苯二甲醛用量的影響

鄰苯二甲醛用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖3。

圖3 鄰苯二甲醛添加量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖3可知，隨著鄰苯二甲醛添加量的增加，體系熒光強(qiáng)度先增加后降低，鄰苯二甲醛添加量在0.5～2.0 mL之間時(shí)，其熒光強(qiáng)度基本呈線性增加，為鄰苯二甲醛添加量為2.0 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)最大值420.54。而鄰苯二甲醛添加量超過2.0 mL之后，熒光強(qiáng)度的數(shù)值迅速減小，原因可能是鄰苯二甲醛添加量過大，熒光物質(zhì)分子易與溶劑分子相互作用發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)，或熒光物質(zhì)在樣品池中分布不均勻發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度變低[19]。方差分析結(jié)果顯示，鄰苯二甲醛添加量為2.0 mL和添加量為1.5，2.5 mL有顯著性差異(P<0.05)，因此，鄰苯二甲醛加入量為2.0 mL較適宜。

2.2.3 乙酸銨用量的影響

乙酸銨用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖4。

圖4 乙酸銨添加量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖4可知，體系熒光強(qiáng)度隨著乙酸銨用量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙酸銨加入量為1.5 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)最大值268.494。乙酸銨用量在0.5～1.5 mL時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大，乙酸銨用量超過1.5 mL之后，熒光強(qiáng)度的數(shù)值呈減小趨勢。原因可能是乙酸銨屬于強(qiáng)電解質(zhì)，易水解，添加量過大吸電子基團(tuán)COO-會(huì)削弱電子共軛性，熒光強(qiáng)度減弱[20]。方差分析結(jié)果顯示，乙酸銨用量為1.5 mL和用量為1.0，2.0 mL有顯著性差異(P<0.05)，因此，乙酸銨加入量為1.5 mL較適宜。

2.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)條件

2.2.4.1 正交試驗(yàn)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，為探究磷酸鹽緩沖溶液pH值、鄰苯二甲醛加入量、乙酸銨加入量之間的交互作用對(duì)生成熒光強(qiáng)度的影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交條件(見表1)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 三因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表2可知，在熒光化合物生成過程中，緩沖溶液pH(A)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響最大，其次是乙酸銨加入量(C)，影響較小的是鄰苯二甲醛加入量(B)；從均值結(jié)果可以看出，最佳條件組合是A3B3C3，即緩沖液pH值為6.6，鄰苯二甲醛加入量為2.0 mL，乙酸銨加入量為2.0 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度的效果最佳。

2.2.4.2 正交試驗(yàn)方差分析

對(duì)反應(yīng)條件三因素四水平正交試驗(yàn)的結(jié)果使用SPSS進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表3，利用多因素方差分析研究緩沖液pH、鄰苯二甲醛用量、乙酸銨用量對(duì)熒光強(qiáng)度的差異影響，由顯著性分析可知緩沖液pH值會(huì)對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生顯著性差異影響(P<0.05)，而鄰苯二甲醛用量(P=0.859)、乙酸銨用量(P=0.361)并不會(huì)對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生差異影響。

表3 方差分析結(jié)果

2.3 亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)1.3.3中配制的溶液在激發(fā)波長324 nm、發(fā)射波長390 nm的條件下測定每個(gè)溶液的熒光強(qiáng)度，以亞硫酸鹽的濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5。

圖5 亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖5可知，亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=290.92x+89.163，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，其擬合程度高，可以用于二氧化硫含量的計(jì)算。

2.4 樣品二氧化硫含量檢測

按1.3.1步驟處理樣品，然后按照1.3.3添加相應(yīng)的衍生化試劑后測定蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干中二氧化硫殘留量。每個(gè)樣品平行測定5次，結(jié)果見表4。

表4 5種樣品中二氧化硫殘留量測定結(jié)果

由表4可知，在優(yōu)化后的條件下測定蜜棗二氧化硫平均殘留量為35.731 mg/kg，藍(lán)莓干二氧化硫平均殘留量為13.087 mg/kg，話梅二氧化硫平均殘留量為300.542 mg/kg，葡萄干二氧化硫平均殘留量為127.092 mg/kg，芒果干二氧化硫平均殘留量為189.961 mg/kg，5種蜜餞樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD介于0.83%～4.59%之間，結(jié)果表明該方法的精密度較好。根據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算可知，熒光分光光度法測定二氧化硫檢出限為0.644 mg/kg。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 回收率試驗(yàn)

取各類樣品各3份，分別加入100 μg/mL亞硫酸鈉使用液1.0 mL，測定熒光強(qiáng)度，計(jì)算加標(biāo)回收率以及平均回收率，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收結(jié)果

由表5可知，5組樣品的加標(biāo)回收率在93.35%～106.50%之間，平均回收率在97.68%～102.71%之間，說明該檢測方法有良好的準(zhǔn)確性。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取蜜棗、葡萄干、話梅、芒果干、藍(lán)莓干樣本待測液，按照測定二氧化硫的方法測定其在0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h的熒光強(qiáng)度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.5 h以內(nèi)5種樣本的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性好，RSD范圍在1.76%～2.64%之間，表明5種樣本的避光保存穩(wěn)定時(shí)間為2.5 h。

2.5.3 國標(biāo)檢測方法比對(duì)

國標(biāo)GB 5009.34—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測定》規(guī)定方法為滴定法，為了進(jìn)一步驗(yàn)證熒光光度法的準(zhǔn)確性和適用性，同時(shí)將5個(gè)樣品用國標(biāo)方法進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定5次，并將結(jié)果進(jìn)行對(duì)比和差異分析，結(jié)果見表6。

表6 熒光分光光度法與國標(biāo)方法比較

由表6可知，熒光分光光度法和國標(biāo)法測定二氧化硫的結(jié)果無顯著差異(P>0.05)，且熒光分光光度法建立的測定二氧化硫的分析方法精密度更好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合蜜餞類食品中二氧化硫殘留量的測定。

3 結(jié)論

本研究使用熒光分光光度計(jì)建立一套測定蜜餞食品中二氧化硫殘留量的新方法，通過掃描光譜發(fā)現(xiàn)最佳激發(fā)波長為324 nm，最佳發(fā)射波長為390 nm。對(duì)熒光化合物生成過程中緩沖液pH和添加量、鄰苯二甲醛加入量、乙酸銨加入量4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。最終確定最佳因素條件為緩沖液pH為6.6，鄰苯二甲醛用量、乙酸銨用量均為2.0 mL。根據(jù)優(yōu)化條件繪制亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=290.92x+89.163，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。對(duì)蜜棗、藍(lán)莓干、話梅、葡萄干、芒果干5個(gè)樣品進(jìn)行二氧化硫殘留量檢測，二氧化硫殘留量均值分別為35.731，13.087，300.542，127.092，189.961 mg/kg，均未超過國標(biāo)要求的350 mg/kg。5種樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD介于0.83%～4.59%之間，加標(biāo)回收率均值在97.68%～102.71%之間，說明該方法有較好的準(zhǔn)確性和精密性。通過和國標(biāo)方法檢測結(jié)果比對(duì)，結(jié)果證明熒光分光光度法的精密度更好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于測定蜜餞食品中二氧化硫殘留量的分析。