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    山西老陳醋丟糟微生物群落多樣性分析

    2022-08-30 08:16:04羅愛(ài)國(guó)王家彥郝建偉郭春燕時(shí)曉麗楊博雯趙紅梅
    中國(guó)調(diào)味品 2022年9期
    關(guān)鍵詞:桿菌屬高通量菌門

    羅愛(ài)國(guó),王家彥,2,郝建偉,郭春燕,時(shí)曉麗,楊博雯,趙紅梅*

    (1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系,山西 晉中 030619;2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南通 226019)

    山西老陳醋風(fēng)味鮮美,功效豐富,是深受人們喜愛(ài)的調(diào)味品,但在釀醋過(guò)程中會(huì)不可避免地產(chǎn)生副產(chǎn)物——醋糟。醋糟是原料釀醋后得到的固態(tài)殘?jiān)?,產(chǎn)量巨大[1-2]。目前山西年產(chǎn)80多萬(wàn)噸醋,將產(chǎn)生56萬(wàn)噸左右的醋糟[3]。由于自身含水量大,雜質(zhì)較多,不及時(shí)處理會(huì)造成醋糟變質(zhì),進(jìn)而污染環(huán)境[4],因此,及時(shí)開(kāi)發(fā)利用醋糟是研究人員一直關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái),微生物發(fā)酵醋糟制備發(fā)酵飼料、制備能源等已經(jīng)成為一種熱潮[5],而微生物是發(fā)酵醋糟的核心。

    利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)解析微生物菌群只能分離鑒別少數(shù)菌種[6-7],而且分析序列的速度慢、規(guī)模小且精度低[8],而應(yīng)運(yùn)而生的高通量測(cè)序技術(shù)則能快速、大量、全面地對(duì)微生物菌群序列進(jìn)行分析[9-11],因此近年來(lái)此技術(shù)被越來(lái)越多地應(yīng)用于分析微生物的豐富度和多樣性[12]。但目前幾乎沒(méi)有利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醋糟微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的研究報(bào)道,只有些應(yīng)用于食醋方面的研究,張永杰等基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了釀醋過(guò)程中的真菌群落結(jié)構(gòu),其中釀酒酵母和黑曲霉是發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)真菌[13]。欒春光等利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了漲壺食醋中的微生物菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)微生物主要分布于厚壁菌門、廣古菌門和變形菌門,其中厚壁菌門中的乳酸菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[14]。

    因此,本研究利用高通量測(cè)序技術(shù),通過(guò)收集醋糟樣品、提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析等流程,解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu),為建立山西老陳醋丟糟微生物信息數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用醋糟提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    山西老陳醋丟糟:由晉中市榆次區(qū)宇超醋廠提供。

    1.2 試劑

    E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA M5635-02);Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒(Life Q10212);2×Hieff?Robust PCR Master Mix(Yeasen 10105ES03);Hieff NGSTMDNA Selection Beads(Yeasen 12601ES56)。

    1.3 主要儀器

    Pico-21臺(tái)式離心機(jī) ThermoFisher Scientific公司;DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠;FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司;Invitrogen Q32866 Qubit?3.0熒光計(jì);ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

    1.4 方法

    1.4.1 樣品準(zhǔn)備與預(yù)處理

    收集10 g山西老陳醋丟糟,立即粉碎后密封于無(wú)菌袋中,并編號(hào)醋糟樣品為CZ,保存于-80 ℃?zhèn)溆肹15]。

    1.4.2 醋糟樣品基因組DNA提取

    取粉碎混勻后的醋糟樣品0.2~0.3 g,按照OMEGA試劑盒的使用要求和說(shuō)明對(duì)醋糟微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取,用0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取DNA的完整性[16],用Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取 DNA 的濃度[17],DNA樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆肹18]。

    表1 質(zhì)檢結(jié)果

    質(zhì)檢結(jié)果表明,樣品能進(jìn)行下一步擴(kuò)增。

    1.4.3 ITS1-ITS2區(qū)域PCR擴(kuò)增

    第一輪擴(kuò)增:用于PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA總量可通過(guò)Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行精確定量。利用引物(ITS1F和ITS2R)對(duì)真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表2。

    表2 ITS區(qū)引物序列

    于無(wú)菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系,見(jiàn)表3。混勻并將反應(yīng)離心于管底。

    表3 PCR反應(yīng)體系

    PCR反應(yīng)條件:首先94 ℃預(yù)變性3 min;接著進(jìn)入下一步流程并重復(fù)5次,包括94 ℃變性30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s;然后在94 ℃高溫條件下變性20 s,55 ℃低溫下退火20 s,72 ℃中溫下延伸30 s,該步驟共重復(fù)20次后于72 ℃再延伸5 min,第一輪擴(kuò)增結(jié)束。

    第二輪擴(kuò)增:引入Illumina橋式PCR兼容引物。于無(wú)菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系,見(jiàn)表4。

    表4 PCR反應(yīng)體系

    將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件:95 ℃,3 min→(高溫94 ℃,20 s→低溫55 ℃,20 s→中溫72 ℃,30 s)→72 ℃,5 min(不同溫度下反應(yīng)原理同第一步)。擴(kuò)增結(jié)束后,2%瓊脂糖電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

    醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見(jiàn)圖1,結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增效果較好,滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的要求。

    圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    1.4.4 16S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增

    第一輪擴(kuò)增:用于PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA總量可通過(guò)Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒來(lái)精確地定量。利用引物(341F和805R)對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表5。

    表5 16S區(qū)引物序列

    其余反應(yīng)體系與實(shí)驗(yàn)過(guò)程同2.4.3流程。

    PCR 反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)其產(chǎn)物。

    醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見(jiàn)圖2,結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增效果較好,滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的要求。

    圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    1.4.5 高通量測(cè)序

    真菌ITS1-ITS2以及細(xì)菌16S rDNA V3-V4的測(cè)序過(guò)程委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

    1.4.6 數(shù)據(jù)分析

    高通量測(cè)序原始序列得到的是雙端序列數(shù)據(jù),且序列中含有起始加入的引物接頭序列以及barcode標(biāo)簽序列。

    首先需要對(duì)引物接頭序列進(jìn)行去除,然后根據(jù)雙端序列之間的重復(fù)關(guān)系,將所有成對(duì)的序列拼接成一條序列,再根據(jù)barcode標(biāo)簽序列區(qū)分醋糟樣品中真菌及細(xì)菌的各序列數(shù)據(jù),之后對(duì)各序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,如對(duì)小于150 bp的短序列,低復(fù)雜度及低質(zhì)量序列等進(jìn)行過(guò)濾[19],最后得到各序列的有效數(shù)據(jù),即有效序列。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 序列的拼接

    醋糟樣品經(jīng)分析后得到真菌、細(xì)菌的原始序列分別為64558,62542條,平均長(zhǎng)度分別為199.26,460.54 bp;經(jīng)拼接、質(zhì)控過(guò)濾后,得到的有效序列分別為64558,62382條,平均長(zhǎng)度分別為157.26,422.87 bp。真菌,細(xì)菌的序列有效率分別為100%、99.75%。

    表6 醋糟樣品中有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    2.2 樣品OTU分類

    97%相似水平下對(duì)醋糟樣品中真菌及細(xì)菌各序列進(jìn)行聚類分析劃分操作分類單元(OTU)[20],其中醋糟樣品中真菌有33個(gè)OTU 序列,細(xì)菌有95個(gè)OTU序列。由此可以看出,醋糟中細(xì)菌的微生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌。

    2.3 樣品OTU物種統(tǒng)計(jì)

    以門、綱、目、科、屬、種的順序依次將醋糟中OTU進(jìn)行分類信息統(tǒng)計(jì)。

    由表7可知,醋糟樣品中的真菌菌群分布在3個(gè)門、7個(gè)綱、10個(gè)目、16個(gè)科、20個(gè)屬、29個(gè)種中;細(xì)菌菌群分布在7個(gè)門、11個(gè)綱、22個(gè)目、39個(gè)科、56個(gè)屬中。以上結(jié)果進(jìn)一步表明,醋糟中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

    表7 醋糟樣品各類水平OTU物種統(tǒng)計(jì)

    2.4 Rank-abundance曲線

    對(duì)比圖3,由圖4 Rank-abundance曲線可知,圖4中的曲線更寬,更平緩,說(shuō)明組成醋糟的菌群中,細(xì)菌菌群的豐富程度、均勻程度均高于真菌菌群。

    圖3 ITS(真菌)Rank-abundance曲線圖

    圖4 16S(細(xì)菌)Rank-abundance曲線圖

    2.5 α多樣性分析

    研究樣品中微生物的多樣性常用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)4個(gè)多樣性指數(shù)進(jìn)行描述。其中,Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)被用來(lái)描述物種的組成多樣性;ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)被用來(lái)描述物種的豐富度。覆蓋率可以反映本次實(shí)驗(yàn)的取樣能否代表樣品的真實(shí)情況。若覆蓋率>97%,則證明實(shí)驗(yàn)的取樣可以反映樣品中微生物的分布情況。

    由表8和表9中的覆蓋率可知,實(shí)驗(yàn)測(cè)定的序列數(shù)已足夠大,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的取樣能夠真實(shí)反映醋糟樣品中的真核以及原核微生物的分布情況。

    表8 醋糟真菌群落多樣性指數(shù)

    表9 醋糟細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

    對(duì)比表8和表9數(shù)據(jù)可知,醋糟中真菌的Shannon 指數(shù)值、ACE指數(shù)值、Chaol值均低于細(xì)菌中相對(duì)應(yīng)的值,而Simpson指數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌中的Simpson指數(shù)值。這表明醋糟中真菌的物種多樣性和豐富度均低于細(xì)菌,即醋糟中的原核微生物多樣性高于真核。

    2.6 稀釋性曲線分析

    由圖5和圖6可知,隨著隨機(jī)抽取測(cè)序數(shù)目的增多,曲線逐漸走向平緩,說(shuō)明測(cè)序數(shù)目足夠大,更多的測(cè)序不會(huì)產(chǎn)生更多的OTU,測(cè)序數(shù)量足夠合理,并且從兩條曲線在縱軸上的最大截距可知,醋糟樣品中細(xì)菌菌群的OTU數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于真菌菌群,即醋糟中細(xì)菌菌群多樣性高于真菌。

    圖5 ITS(真菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

    圖6 16S(細(xì)菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

    2.7 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

    由圖7和圖8可知,隨著測(cè)定序列數(shù)目的逐步增加,曲線走向平緩,說(shuō)明了測(cè)序的深度合理。對(duì)比真菌、細(xì)菌的Shannon指數(shù)值,可知醋糟樣品中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

    圖7 ITS(真菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

    圖8 16S(細(xì)菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

    2.8 基于門和屬水平的真菌菌群分類

    醋糟樣品中真菌共有33個(gè)OTU序列。由圖9可知,醋糟中真核微生物由子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)3個(gè)門組成。其中子囊菌門占比最大,為89.847%,其次為擔(dān)子菌門,占比10.152%,最后是毛霉菌門,占比0.001%。分析數(shù)據(jù),以豐度>1%為閾值,共得到2個(gè)門。分別是子囊菌門(Ascomycota,89.847%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota,10.152%)。

    圖9 真菌門水平分布圖

    分析測(cè)得數(shù)據(jù),結(jié)果表明,以豐度>0.01%為閾值,醋糟樣品共得到4個(gè)屬;以豐度>0.5%為閾值,醋糟樣品共得到4個(gè)屬;以豐度>1%為閾值,醋糟樣品共得到4個(gè)屬。由圖10可知,醋糟樣品中的真核微生物由畢赤酵母屬(Pichia,85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon,9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus,3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida,1.02%)以及一些豐度小于1%的真菌菌屬組成。

    圖10 真菌屬水平分布圖

    由此可以看出,在真菌屬水平組成上,醋糟中的優(yōu)勢(shì)真菌為畢赤酵母屬,其次為毛孢子菌屬,最后是雙足囊菌屬和假絲酵母菌屬,其中畢赤酵母屬為醋糟中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌菌屬;同時(shí)醋糟中還有一些豐度小于1%的真核微生物菌屬,它們?cè)诖自阏婢械恼急刃。粚儆趦?yōu)勢(shì)真菌。

    2.9 基于門和屬水平的細(xì)菌菌群分類

    醋糟樣品中的細(xì)菌共有95個(gè)OTU序列。由圖11可知,醋糟樣品中的細(xì)菌菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門組成,還有一些豐度小于1%的細(xì)菌菌門。其中以豐度>0.01%為閾值,共得到5個(gè)門;以>1%為閾值,共得到3個(gè)門,分別是厚壁菌門(Firmicutes,61.64%)、變形菌門(Proteobacteria,35.96%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,2.03%)。

    圖11 細(xì)菌門水平分布圖

    由圖12可知,醋糟樣品中的原核微生物由乳桿菌屬、醋菌屬、小球菌屬、嗜冷桿菌屬、金黃桿菌屬,還有一些未得到分類的菌屬以及豐度小于1%的菌屬組成。分析數(shù)據(jù)結(jié)果,其中以豐度>0.01%為閾值,醋糟樣品共得到19個(gè)屬;以豐度>0.5%為閾值,共得到10個(gè)屬;以豐度>1%為閾值,共得到7個(gè)屬,分別是乳桿菌屬(Lactobacillus,47.29%)、醋菌屬(Acetobacter,27.31%)、小球菌屬(Pediococcus,7.74%)、未分類的乳桿菌屬(unclassified_Lactobacillales,6.11%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter,3.2%)、未分類的腸桿菌科(unclassified_ Enterobacteriaceae,2.45%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium,1.32%)。

    圖12 細(xì)菌屬水平分布圖

    由此可以看出,醋糟中的原核微生物中占最大優(yōu)勢(shì)的是乳桿菌屬,其次是醋菌屬,同時(shí)含有一定數(shù)量的小球菌屬以及其他菌類。

    3 結(jié)論

    本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu),同時(shí)也對(duì)醋糟中真核微生物以及原核微生物的多樣性及豐富度進(jìn)行了分析。從醋糟樣品中得到的真菌及細(xì)菌OTU序列分別有33個(gè)和95個(gè)。

    以門為水平分析醋糟樣品中的真核及原核微生物。結(jié)果表明,醋糟中的真菌最主要分布于子囊菌門(Ascomycota,89.847%),其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota,10.152%);細(xì)菌主要分布于厚壁菌門(Firmicutes,61.64%),其次為變形菌門(Proteobacteria,35.96%),最后為擬桿菌門(Bacteroidetes,2.03%)。

    以屬為水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明,樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌有畢赤酵母屬(Pichia,85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon,9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus,3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida,1.02%);樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有乳桿菌屬(Lactobacillus,47.29%)、醋菌屬(Acetobacter,27.31%)、小球菌屬(Pediococcus,7.74%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter,3.2%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium,1.32%)以及一些未得到分類學(xué)注釋的菌群。

    該研究解析了山西老陳醋丟糟微生物菌群結(jié)構(gòu),為將醋糟轉(zhuǎn)化為利用率更高的發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù),在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用醋糟資源,提供清潔、環(huán)保、無(wú)污染的環(huán)境中具有重要意義。

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