• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山西老陳醋丟糟微生物群落多樣性分析

    2022-08-30 08:16:04羅愛(ài)國(guó)王家彥郝建偉郭春燕時(shí)曉麗楊博雯趙紅梅
    中國(guó)調(diào)味品 2022年9期
    關(guān)鍵詞:桿菌屬高通量菌門

    羅愛(ài)國(guó),王家彥,2,郝建偉,郭春燕,時(shí)曉麗,楊博雯,趙紅梅*

    (1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系,山西 晉中 030619;2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南通 226019)

    山西老陳醋風(fēng)味鮮美,功效豐富,是深受人們喜愛(ài)的調(diào)味品,但在釀醋過(guò)程中會(huì)不可避免地產(chǎn)生副產(chǎn)物——醋糟。醋糟是原料釀醋后得到的固態(tài)殘?jiān)?,產(chǎn)量巨大[1-2]。目前山西年產(chǎn)80多萬(wàn)噸醋,將產(chǎn)生56萬(wàn)噸左右的醋糟[3]。由于自身含水量大,雜質(zhì)較多,不及時(shí)處理會(huì)造成醋糟變質(zhì),進(jìn)而污染環(huán)境[4],因此,及時(shí)開(kāi)發(fā)利用醋糟是研究人員一直關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái),微生物發(fā)酵醋糟制備發(fā)酵飼料、制備能源等已經(jīng)成為一種熱潮[5],而微生物是發(fā)酵醋糟的核心。

    利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)解析微生物菌群只能分離鑒別少數(shù)菌種[6-7],而且分析序列的速度慢、規(guī)模小且精度低[8],而應(yīng)運(yùn)而生的高通量測(cè)序技術(shù)則能快速、大量、全面地對(duì)微生物菌群序列進(jìn)行分析[9-11],因此近年來(lái)此技術(shù)被越來(lái)越多地應(yīng)用于分析微生物的豐富度和多樣性[12]。但目前幾乎沒(méi)有利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醋糟微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的研究報(bào)道,只有些應(yīng)用于食醋方面的研究,張永杰等基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了釀醋過(guò)程中的真菌群落結(jié)構(gòu),其中釀酒酵母和黑曲霉是發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)真菌[13]。欒春光等利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了漲壺食醋中的微生物菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)微生物主要分布于厚壁菌門、廣古菌門和變形菌門,其中厚壁菌門中的乳酸菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[14]。

    因此,本研究利用高通量測(cè)序技術(shù),通過(guò)收集醋糟樣品、提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析等流程,解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu),為建立山西老陳醋丟糟微生物信息數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用醋糟提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    山西老陳醋丟糟:由晉中市榆次區(qū)宇超醋廠提供。

    1.2 試劑

    E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA M5635-02);Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒(Life Q10212);2×Hieff?Robust PCR Master Mix(Yeasen 10105ES03);Hieff NGSTMDNA Selection Beads(Yeasen 12601ES56)。

    1.3 主要儀器

    Pico-21臺(tái)式離心機(jī) ThermoFisher Scientific公司;DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠;FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司;Invitrogen Q32866 Qubit?3.0熒光計(jì);ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

    1.4 方法

    1.4.1 樣品準(zhǔn)備與預(yù)處理

    收集10 g山西老陳醋丟糟,立即粉碎后密封于無(wú)菌袋中,并編號(hào)醋糟樣品為CZ,保存于-80 ℃?zhèn)溆肹15]。

    1.4.2 醋糟樣品基因組DNA提取

    取粉碎混勻后的醋糟樣品0.2~0.3 g,按照OMEGA試劑盒的使用要求和說(shuō)明對(duì)醋糟微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取,用0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取DNA的完整性[16],用Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取 DNA 的濃度[17],DNA樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆肹18]。

    表1 質(zhì)檢結(jié)果

    質(zhì)檢結(jié)果表明,樣品能進(jìn)行下一步擴(kuò)增。

    1.4.3 ITS1-ITS2區(qū)域PCR擴(kuò)增

    第一輪擴(kuò)增:用于PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA總量可通過(guò)Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行精確定量。利用引物(ITS1F和ITS2R)對(duì)真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表2。

    表2 ITS區(qū)引物序列

    于無(wú)菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系,見(jiàn)表3。混勻并將反應(yīng)離心于管底。

    表3 PCR反應(yīng)體系

    PCR反應(yīng)條件:首先94 ℃預(yù)變性3 min;接著進(jìn)入下一步流程并重復(fù)5次,包括94 ℃變性30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s;然后在94 ℃高溫條件下變性20 s,55 ℃低溫下退火20 s,72 ℃中溫下延伸30 s,該步驟共重復(fù)20次后于72 ℃再延伸5 min,第一輪擴(kuò)增結(jié)束。

    第二輪擴(kuò)增:引入Illumina橋式PCR兼容引物。于無(wú)菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系,見(jiàn)表4。

    表4 PCR反應(yīng)體系

    將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件:95 ℃,3 min→(高溫94 ℃,20 s→低溫55 ℃,20 s→中溫72 ℃,30 s)→72 ℃,5 min(不同溫度下反應(yīng)原理同第一步)。擴(kuò)增結(jié)束后,2%瓊脂糖電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

    醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見(jiàn)圖1,結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增效果較好,滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的要求。

    圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    1.4.4 16S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增

    第一輪擴(kuò)增:用于PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA總量可通過(guò)Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒來(lái)精確地定量。利用引物(341F和805R)對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列見(jiàn)表5。

    表5 16S區(qū)引物序列

    其余反應(yīng)體系與實(shí)驗(yàn)過(guò)程同2.4.3流程。

    PCR 反應(yīng)結(jié)束后,用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)其產(chǎn)物。

    醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見(jiàn)圖2,結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增效果較好,滿足后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的要求。

    圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    1.4.5 高通量測(cè)序

    真菌ITS1-ITS2以及細(xì)菌16S rDNA V3-V4的測(cè)序過(guò)程委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

    1.4.6 數(shù)據(jù)分析

    高通量測(cè)序原始序列得到的是雙端序列數(shù)據(jù),且序列中含有起始加入的引物接頭序列以及barcode標(biāo)簽序列。

    首先需要對(duì)引物接頭序列進(jìn)行去除,然后根據(jù)雙端序列之間的重復(fù)關(guān)系,將所有成對(duì)的序列拼接成一條序列,再根據(jù)barcode標(biāo)簽序列區(qū)分醋糟樣品中真菌及細(xì)菌的各序列數(shù)據(jù),之后對(duì)各序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,如對(duì)小于150 bp的短序列,低復(fù)雜度及低質(zhì)量序列等進(jìn)行過(guò)濾[19],最后得到各序列的有效數(shù)據(jù),即有效序列。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 序列的拼接

    醋糟樣品經(jīng)分析后得到真菌、細(xì)菌的原始序列分別為64558,62542條,平均長(zhǎng)度分別為199.26,460.54 bp;經(jīng)拼接、質(zhì)控過(guò)濾后,得到的有效序列分別為64558,62382條,平均長(zhǎng)度分別為157.26,422.87 bp。真菌,細(xì)菌的序列有效率分別為100%、99.75%。

    表6 醋糟樣品中有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    2.2 樣品OTU分類

    97%相似水平下對(duì)醋糟樣品中真菌及細(xì)菌各序列進(jìn)行聚類分析劃分操作分類單元(OTU)[20],其中醋糟樣品中真菌有33個(gè)OTU 序列,細(xì)菌有95個(gè)OTU序列。由此可以看出,醋糟中細(xì)菌的微生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌。

    2.3 樣品OTU物種統(tǒng)計(jì)

    以門、綱、目、科、屬、種的順序依次將醋糟中OTU進(jìn)行分類信息統(tǒng)計(jì)。

    由表7可知,醋糟樣品中的真菌菌群分布在3個(gè)門、7個(gè)綱、10個(gè)目、16個(gè)科、20個(gè)屬、29個(gè)種中;細(xì)菌菌群分布在7個(gè)門、11個(gè)綱、22個(gè)目、39個(gè)科、56個(gè)屬中。以上結(jié)果進(jìn)一步表明,醋糟中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

    表7 醋糟樣品各類水平OTU物種統(tǒng)計(jì)

    2.4 Rank-abundance曲線

    對(duì)比圖3,由圖4 Rank-abundance曲線可知,圖4中的曲線更寬,更平緩,說(shuō)明組成醋糟的菌群中,細(xì)菌菌群的豐富程度、均勻程度均高于真菌菌群。

    圖3 ITS(真菌)Rank-abundance曲線圖

    圖4 16S(細(xì)菌)Rank-abundance曲線圖

    2.5 α多樣性分析

    研究樣品中微生物的多樣性常用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)4個(gè)多樣性指數(shù)進(jìn)行描述。其中,Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)被用來(lái)描述物種的組成多樣性;ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)被用來(lái)描述物種的豐富度。覆蓋率可以反映本次實(shí)驗(yàn)的取樣能否代表樣品的真實(shí)情況。若覆蓋率>97%,則證明實(shí)驗(yàn)的取樣可以反映樣品中微生物的分布情況。

    由表8和表9中的覆蓋率可知,實(shí)驗(yàn)測(cè)定的序列數(shù)已足夠大,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的取樣能夠真實(shí)反映醋糟樣品中的真核以及原核微生物的分布情況。

    表8 醋糟真菌群落多樣性指數(shù)

    表9 醋糟細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

    對(duì)比表8和表9數(shù)據(jù)可知,醋糟中真菌的Shannon 指數(shù)值、ACE指數(shù)值、Chaol值均低于細(xì)菌中相對(duì)應(yīng)的值,而Simpson指數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌中的Simpson指數(shù)值。這表明醋糟中真菌的物種多樣性和豐富度均低于細(xì)菌,即醋糟中的原核微生物多樣性高于真核。

    2.6 稀釋性曲線分析

    由圖5和圖6可知,隨著隨機(jī)抽取測(cè)序數(shù)目的增多,曲線逐漸走向平緩,說(shuō)明測(cè)序數(shù)目足夠大,更多的測(cè)序不會(huì)產(chǎn)生更多的OTU,測(cè)序數(shù)量足夠合理,并且從兩條曲線在縱軸上的最大截距可知,醋糟樣品中細(xì)菌菌群的OTU數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于真菌菌群,即醋糟中細(xì)菌菌群多樣性高于真菌。

    圖5 ITS(真菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

    圖6 16S(細(xì)菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

    2.7 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

    由圖7和圖8可知,隨著測(cè)定序列數(shù)目的逐步增加,曲線走向平緩,說(shuō)明了測(cè)序的深度合理。對(duì)比真菌、細(xì)菌的Shannon指數(shù)值,可知醋糟樣品中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

    圖7 ITS(真菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

    圖8 16S(細(xì)菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

    2.8 基于門和屬水平的真菌菌群分類

    醋糟樣品中真菌共有33個(gè)OTU序列。由圖9可知,醋糟中真核微生物由子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)3個(gè)門組成。其中子囊菌門占比最大,為89.847%,其次為擔(dān)子菌門,占比10.152%,最后是毛霉菌門,占比0.001%。分析數(shù)據(jù),以豐度>1%為閾值,共得到2個(gè)門。分別是子囊菌門(Ascomycota,89.847%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota,10.152%)。

    圖9 真菌門水平分布圖

    分析測(cè)得數(shù)據(jù),結(jié)果表明,以豐度>0.01%為閾值,醋糟樣品共得到4個(gè)屬;以豐度>0.5%為閾值,醋糟樣品共得到4個(gè)屬;以豐度>1%為閾值,醋糟樣品共得到4個(gè)屬。由圖10可知,醋糟樣品中的真核微生物由畢赤酵母屬(Pichia,85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon,9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus,3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida,1.02%)以及一些豐度小于1%的真菌菌屬組成。

    圖10 真菌屬水平分布圖

    由此可以看出,在真菌屬水平組成上,醋糟中的優(yōu)勢(shì)真菌為畢赤酵母屬,其次為毛孢子菌屬,最后是雙足囊菌屬和假絲酵母菌屬,其中畢赤酵母屬為醋糟中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌菌屬;同時(shí)醋糟中還有一些豐度小于1%的真核微生物菌屬,它們?cè)诖自阏婢械恼急刃。粚儆趦?yōu)勢(shì)真菌。

    2.9 基于門和屬水平的細(xì)菌菌群分類

    醋糟樣品中的細(xì)菌共有95個(gè)OTU序列。由圖11可知,醋糟樣品中的細(xì)菌菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門組成,還有一些豐度小于1%的細(xì)菌菌門。其中以豐度>0.01%為閾值,共得到5個(gè)門;以>1%為閾值,共得到3個(gè)門,分別是厚壁菌門(Firmicutes,61.64%)、變形菌門(Proteobacteria,35.96%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,2.03%)。

    圖11 細(xì)菌門水平分布圖

    由圖12可知,醋糟樣品中的原核微生物由乳桿菌屬、醋菌屬、小球菌屬、嗜冷桿菌屬、金黃桿菌屬,還有一些未得到分類的菌屬以及豐度小于1%的菌屬組成。分析數(shù)據(jù)結(jié)果,其中以豐度>0.01%為閾值,醋糟樣品共得到19個(gè)屬;以豐度>0.5%為閾值,共得到10個(gè)屬;以豐度>1%為閾值,共得到7個(gè)屬,分別是乳桿菌屬(Lactobacillus,47.29%)、醋菌屬(Acetobacter,27.31%)、小球菌屬(Pediococcus,7.74%)、未分類的乳桿菌屬(unclassified_Lactobacillales,6.11%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter,3.2%)、未分類的腸桿菌科(unclassified_ Enterobacteriaceae,2.45%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium,1.32%)。

    圖12 細(xì)菌屬水平分布圖

    由此可以看出,醋糟中的原核微生物中占最大優(yōu)勢(shì)的是乳桿菌屬,其次是醋菌屬,同時(shí)含有一定數(shù)量的小球菌屬以及其他菌類。

    3 結(jié)論

    本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu),同時(shí)也對(duì)醋糟中真核微生物以及原核微生物的多樣性及豐富度進(jìn)行了分析。從醋糟樣品中得到的真菌及細(xì)菌OTU序列分別有33個(gè)和95個(gè)。

    以門為水平分析醋糟樣品中的真核及原核微生物。結(jié)果表明,醋糟中的真菌最主要分布于子囊菌門(Ascomycota,89.847%),其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota,10.152%);細(xì)菌主要分布于厚壁菌門(Firmicutes,61.64%),其次為變形菌門(Proteobacteria,35.96%),最后為擬桿菌門(Bacteroidetes,2.03%)。

    以屬為水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明,樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌有畢赤酵母屬(Pichia,85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon,9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus,3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida,1.02%);樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有乳桿菌屬(Lactobacillus,47.29%)、醋菌屬(Acetobacter,27.31%)、小球菌屬(Pediococcus,7.74%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter,3.2%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium,1.32%)以及一些未得到分類學(xué)注釋的菌群。

    該研究解析了山西老陳醋丟糟微生物菌群結(jié)構(gòu),為將醋糟轉(zhuǎn)化為利用率更高的發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù),在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用醋糟資源,提供清潔、環(huán)保、無(wú)污染的環(huán)境中具有重要意義。

    猜你喜歡
    桿菌屬高通量菌門
    高通量衛(wèi)星網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)漫游關(guān)鍵技術(shù)
    潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群分布特征分析
    高通量血液透析臨床研究進(jìn)展
    野生樹(shù)鼩與人工飼養(yǎng)樹(shù)鼩消化道不同部位微生物組成的比較研究
    Ka頻段高通量衛(wèi)星在鐵路通信中的應(yīng)用探討
    饑餓與重?cái)z食對(duì)河蟹腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響
    養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間生態(tài)位特性
    昆蟲(chóng)體內(nèi)微生物多樣性的影響因素研究進(jìn)展
    妊娠期糖尿病腸道菌群變化及臨床價(jià)值分析
    中國(guó)通信衛(wèi)星開(kāi)啟高通量時(shí)代
    我要看黄色一级片免费的| 免费人妻精品一区二区三区视频| av在线app专区| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品.久久久| 免费在线观看影片大全网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 极品人妻少妇av视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 搡老岳熟女国产| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久精品94久久精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 中文字幕人妻丝袜制服| 不卡一级毛片| 老司机亚洲免费影院| 黄色毛片三级朝国网站| 婷婷丁香在线五月| 精品国产一区二区久久| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲国产av新网站| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看舔阴道视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| videosex国产| 精品亚洲成国产av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 五月天丁香电影| 精品少妇内射三级| 成人影院久久| 亚洲成国产人片在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 午夜精品久久久久久毛片777| 深夜精品福利| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| av在线播放精品| 少妇的丰满在线观看| 1024视频免费在线观看| 91成年电影在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品少妇黑人巨大在线播放| 自线自在国产av| 久久久精品区二区三区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲情色 制服丝袜| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美精品一区二区免费开放| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产欧美亚洲国产| kizo精华| 一区福利在线观看| 乱人伦中国视频| 一级黄色大片毛片| 国产精品1区2区在线观看. | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久久网色| av电影中文网址| 正在播放国产对白刺激| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲avbb在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品高清国产在线一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 性少妇av在线| a级毛片在线看网站| 大陆偷拍与自拍| 男女无遮挡免费网站观看| 无遮挡黄片免费观看| 他把我摸到了高潮在线观看 | 黄片小视频在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 91av网站免费观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产免费福利视频在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利视频精品| 天堂8中文在线网| 亚洲天堂av无毛| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 1024香蕉在线观看| 操出白浆在线播放| 一区福利在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99热网站在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一区在线观看完整版| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 岛国在线观看网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 久久ye,这里只有精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美人与性动交α欧美软件| 极品人妻少妇av视频| 十八禁人妻一区二区| cao死你这个sao货| 久久国产精品大桥未久av| 捣出白浆h1v1| 精品人妻在线不人妻| 色视频在线一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 婷婷色av中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩免费高清中文字幕av| 9191精品国产免费久久| av电影中文网址| av国产精品久久久久影院| 国产精品 欧美亚洲| 欧美另类一区| 久久香蕉激情| 一区二区三区精品91| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 免费看十八禁软件| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 超碰97精品在线观看| 精品福利观看| 曰老女人黄片| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜福利一区二区在线看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久av网站| 在线永久观看黄色视频| 精品一区二区三卡| 亚洲全国av大片| 超碰97精品在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜精品国产一区二区电影| 999精品在线视频| 国产一级毛片在线| 婷婷成人精品国产| 嫩草影视91久久| 午夜福利乱码中文字幕| 国产成人精品在线电影| 最近最新中文字幕大全免费视频| 色精品久久人妻99蜜桃| av网站免费在线观看视频| 丝袜脚勾引网站| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一个人免费看片子| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成年动漫av网址| 久久人人97超碰香蕉20202| 激情视频va一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品亚洲av一区麻豆| bbb黄色大片| 99久久精品国产亚洲精品| 99热全是精品| 动漫黄色视频在线观看| 日本五十路高清| h视频一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄频高清免费视频| a在线观看视频网站| 老司机福利观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲成人手机| netflix在线观看网站| 一级a爱视频在线免费观看| 飞空精品影院首页| 18禁观看日本| 国产野战对白在线观看| 在线永久观看黄色视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产野战对白在线观看| 韩国精品一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 又紧又爽又黄一区二区| 老汉色∧v一级毛片| 婷婷色av中文字幕| 久久国产精品影院| 男人舔女人的私密视频| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲国产日韩一区二区| 1024视频免费在线观看| 国产色视频综合| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜老司机福利片| 在线av久久热| www.精华液| 欧美精品av麻豆av| 日本av手机在线免费观看| av国产精品久久久久影院| 一本综合久久免费| 午夜激情av网站| 999久久久精品免费观看国产| 妹子高潮喷水视频| 亚洲伊人色综图| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品视频人人做人人爽| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美大码av| 大片免费播放器 马上看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲av男天堂| 91大片在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| a级毛片在线看网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久ye,这里只有精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 午夜91福利影院| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老熟妇仑乱视频hdxx| 搡老岳熟女国产| 亚洲国产精品999| 久久av网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 久9热在线精品视频| 大码成人一级视频| 黄色毛片三级朝国网站| 久久国产精品影院| 国产xxxxx性猛交| 一个人免费在线观看的高清视频 | 国产成人免费观看mmmm| 黑人猛操日本美女一级片| www.熟女人妻精品国产| 在线观看免费高清a一片| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久亚洲精品不卡| 十八禁网站网址无遮挡| 男女边摸边吃奶| 国产成人免费观看mmmm| 黄色怎么调成土黄色| 男人爽女人下面视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 啦啦啦免费观看视频1| 人妻一区二区av| 亚洲九九香蕉| 日本av免费视频播放| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久久久久人人人人人| 90打野战视频偷拍视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 日韩制服骚丝袜av| 黑人猛操日本美女一级片| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲少妇的诱惑av| 91麻豆精品激情在线观看国产 | videosex国产| 大型av网站在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 大片电影免费在线观看免费| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久久av美女十八| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品自拍成人| 黄色片一级片一级黄色片| av天堂久久9| 国产免费视频播放在线视频| 手机成人av网站| 亚洲精品一区蜜桃| 精品乱码久久久久久99久播| 69av精品久久久久久 | 国产成人精品久久二区二区91| 国产麻豆69| 美女福利国产在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久天堂一区二区三区四区| 日本a在线网址| 亚洲免费av在线视频| 高清欧美精品videossex| 老司机靠b影院| av欧美777| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产成人av教育| 人人澡人人妻人| 老司机在亚洲福利影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品在线美女| 天天影视国产精品| 欧美激情高清一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲人成77777在线视频| a在线观看视频网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 不卡一级毛片| 国产精品九九99| 99热网站在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 精品国产一区二区三区四区第35| 一个人免费在线观看的高清视频 | 一级毛片电影观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品国产一区二区三区四区第35| kizo精华| 大香蕉久久成人网| 两个人看的免费小视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄片播放在线免费| 日韩一区二区三区影片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 黄频高清免费视频| 亚洲人成电影免费在线| 国精品久久久久久国模美| 一二三四在线观看免费中文在| 精品人妻一区二区三区麻豆| 捣出白浆h1v1| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 新久久久久国产一级毛片| 国产免费现黄频在线看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| videos熟女内射| 亚洲欧美一区二区三区黑人| svipshipincom国产片| 欧美日韩精品网址| 他把我摸到了高潮在线观看 | 一个人免费在线观看的高清视频 | 99久久综合免费| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利,免费看| 91国产中文字幕| 黄色a级毛片大全视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜福利,免费看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品一区二区免费欧美 | 黄色视频不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久 成人 亚洲| 十八禁高潮呻吟视频| 国产伦人伦偷精品视频| 老司机福利观看| 老司机影院成人| avwww免费| 麻豆av在线久日| 91老司机精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 另类亚洲欧美激情| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 蜜桃国产av成人99| 午夜福利免费观看在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品 国内视频| 久久久久久久久免费视频了| 午夜精品国产一区二区电影| 国产伦人伦偷精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 一级片免费观看大全| 欧美精品av麻豆av| 少妇 在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 国产成人欧美在线观看 | 国产一卡二卡三卡精品| 黄片大片在线免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 色播在线永久视频| 少妇精品久久久久久久| av网站免费在线观看视频| 久久影院123| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩欧美国产一区二区入口| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费av中文字幕在线| 老汉色∧v一级毛片| 国产欧美亚洲国产| av片东京热男人的天堂| 国产成人精品久久二区二区91| 久久久久国产一级毛片高清牌| a 毛片基地| 两个人免费观看高清视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 大型av网站在线播放| 两个人看的免费小视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 水蜜桃什么品种好| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 五月天丁香电影| 久热这里只有精品99| 一区二区av电影网| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一个人免费看片子| 在线天堂中文资源库| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| av网站免费在线观看视频| 午夜免费鲁丝| 午夜影院在线不卡| 国产一区二区三区av在线| 午夜日韩欧美国产| 两个人免费观看高清视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av不卡在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 免费黄频网站在线观看国产| tocl精华| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产男人的电影天堂91| 91字幕亚洲| 国产黄色免费在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产av一区二区精品久久| 成人国语在线视频| 老熟女久久久| 香蕉国产在线看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品一区二区在线观看99| 高清av免费在线| 国产xxxxx性猛交| 亚洲伊人久久精品综合| 又紧又爽又黄一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美+亚洲+日韩+国产| 麻豆av在线久日| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| www.自偷自拍.com| 欧美日韩成人在线一区二区| 岛国在线观看网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久ye,这里只有精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久国内视频| 老司机影院成人| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一个人免费看片子| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品1区2区在线观看. | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 丝袜人妻中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 欧美精品亚洲一区二区| 香蕉丝袜av| 亚洲色图综合在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 男女国产视频网站| 国产野战对白在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久国产精品影院| 狠狠狠狠99中文字幕| 丝袜美足系列| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄色a级毛片大全视频| 考比视频在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 黄色 视频免费看| 这个男人来自地球电影免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品影院久久| 日本wwww免费看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产一区二区三区av在线| 亚洲欧美激情在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久人人爽人人片av| av网站免费在线观看视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲av日韩在线播放| 又黄又粗又硬又大视频| 成在线人永久免费视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美久久黑人一区二区| 考比视频在线观看| 国产男女内射视频| 丝袜喷水一区| 制服诱惑二区| 久久人人爽人人片av| 麻豆av在线久日| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产1区2区3区精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久久久精品精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费av中文字幕在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美97在线视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一个人免费看片子| 欧美黄色淫秽网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99热国产这里只有精品6| 蜜桃国产av成人99| 国产av又大| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久久久久电影网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最新的欧美精品一区二区| 女性被躁到高潮视频| 日韩视频一区二区在线观看| 久久青草综合色| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品 欧美亚洲| kizo精华| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久av网站| 亚洲情色 制服丝袜| 深夜精品福利| 精品少妇久久久久久888优播| www.999成人在线观看| 9色porny在线观看| 91精品三级在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 最新的欧美精品一区二区| 国产视频一区二区在线看| 亚洲五月婷婷丁香| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 香蕉国产在线看| 午夜视频精品福利| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 嫩草影视91久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美97在线视频| 一级毛片电影观看| 99re6热这里在线精品视频| 黄色毛片三级朝国网站| 老司机影院毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| av福利片在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久欧美国产精品|