系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清學(xué)mRNA表達譜差異研究及生物信息學(xué)分析

張 靜 （天津市第五中心醫(yī)院皮膚科，天津 300450）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以多系統(tǒng)損傷，并以血液中多種自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物沉積為主要特征的自身免疫性疾病。SLE 發(fā)生與遺傳背景下的感染因素、藥物因素等密切相關(guān)［1］。針對部分患者靶點基因突變進行個體化生物治療效果更為顯著，進一步提示SLE的基因遺傳機制在發(fā)病過程中起重要作用［2-3］。本文采用生物信息學(xué)方法分析目前數(shù)據(jù)庫收錄的SLE患者信息，篩選出顯著差異表達、可能與SLE發(fā)病相關(guān)的核心基因并深入分析其功能，進一步探究SLE的遺傳學(xué)機制，為SLE治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究共納入38 例SLE 患者和32 例健康志愿者，所有樣本基因表達譜數(shù)據(jù)來源于GEO 數(shù)據(jù)庫，并基于 GPL16699 平臺Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K芯片。

1.2 差異基因篩選 根據(jù)GPL16699 平臺探針信息注釋相應(yīng)基因，采用R 軟件（4.0.1）的scale 函數(shù)對基因表達矩陣進行歸一化處理，采用limma 軟件包分析差異表達基因，BH 方法對P值進行校正，選取 log2|Fold Change|>1.5 以及校正后P值（PBH）<0.05作為差異表達基因閾值。

1.3 功能富集分析 采用toppgene 在線工具對差異表達基因進行通路富集分析，以PBH<0.05 為閾值篩選顯著富集的KEGG 和Reactome 生物學(xué)通路。采用 R 軟件包 clusterProfiler（3.8.1）對差異表達基因進行GO 富集分析，以PBH<0.05 為閾值篩選顯著富集的生物學(xué)過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）。

1.4 基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 采用STRING 數(shù)據(jù)庫建立差異表達基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選 與健康對照組相比，SLE組39 個基因顯著差異表達，其中38 個表達上調(diào)，1 個表達下調(diào)，TNFSF10 上調(diào)表達與 G0S2 下調(diào)表達的差異倍數(shù)最為顯著，差異表達倍數(shù)分別為log2FC=1.52，PBH=3.48E-05和log2FC=?1.72，PBH=0.015。因39 個基因數(shù)量較少，選取log2|Fold Change|>1，P<0.05的383個基因表達情況進行可視化研究（圖1）。

2.2 通路富集分析 以PBH<0.05 為閾值，共篩選到12 條顯著富集的生物學(xué)通路（7 條Reactome 通路和5 條 KEGG 通路，表 1），多數(shù)通路與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病原體感染相關(guān)。

表1 差異表達基因顯著富集的生物學(xué)通路Tab.1 Biological pathways with significant enrichment of differentially expressed genes

2.3 GO 富集分析 以PBH<0.05 為閾值，共篩選到24 條顯著富集的 GO 條目（20 條 BP 條目和 4 條 MF條目），多數(shù)條目與病毒反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、病毒基因組復(fù)制調(diào)控相關(guān)（圖2）。

圖2 差異表達基因顯著富集的GOBP、GOMF條目Fig.2 GOBP and GOMF entries with significant enrich?ment of differentially expressed genes

2.4 基因相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將39個差異表達基因映射到STRING 數(shù)據(jù)庫的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，共得到328條互作對（圖1最內(nèi)層軌道），單獨顯示上調(diào)表達最為顯著的差異基因TNFSF10（黃色顯示）網(wǎng)絡(luò)節(jié)點圖（圖3），TNFSF10 與眾多基因存在錯綜復(fù)雜的關(guān)系，且處于核心地位。而下調(diào)差異表達最為顯著的基因G0S2 與本研究篩選出的其他差異基因無相互作用。提示TNFSF10 在SLE 中的作用比G0S2 更為關(guān)鍵。

圖1 差異表達基因Fig.1 Differential expressed genes

圖3 TNFSF10網(wǎng)絡(luò)節(jié)點圖Fig.3 TNFSF10 network node diagram

3 討論

SLE 是一種具有廣泛臨床表現(xiàn)（包括皮疹、神經(jīng)、精神癥狀、肌肉骨骼表現(xiàn)、狼瘡性腎炎等）的經(jīng)典自身免疫性疾病，在確診和治療過程中可隨時伴發(fā)和繼發(fā)其他多種疾病，如心肌炎、結(jié)核、Bowen 病等，嚴重威脅患者生命健康［4-6］。SLE 發(fā)病原因尚不清楚，目前關(guān)于Ⅰ型干擾素過度激活機制的研究較為廣泛，而本研究篩選出的眾多差異基因無論從生物學(xué)功能還是生物學(xué)通路方面均顯示參與干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。同時大量基因也參與病原體感染過程，包括丙型肝炎、單純皰疹、麻疹及流感等病毒反應(yīng)。既往SLE病因?qū)W將感染因素和遺傳因素作為并列因素討論，但兩者道路不同。全基因組關(guān)聯(lián)顯示SLE 患者有超過50 個基因位點變異，這些變異的位點多數(shù)涉及Ⅰ型干擾素系統(tǒng)，同時病原體可作為一種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)并激活Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，異?；罨霸龆嗟蘑裥透蓴_素通過調(diào)控免疫細胞活化及功能促進SLE發(fā)生發(fā)展［7］。

本研究中篩選出2 個表達差異最為顯著的基因，分別為TNFSF10和G0S2。TNFSF10又名腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL），是 TNF 超家族重要成員。TRAIL 在免疫系統(tǒng)多種細胞，如 NK 細胞、T 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞中表達，并在免疫調(diào)節(jié)、病原抵抗、腫瘤監(jiān)視等方面發(fā)揮重要作用。與健康對照組相比，SLE 患者外周血中此基因與其他多個關(guān)聯(lián)基因的CG 位點甲基化具有顯著差異，并可作為診斷學(xué)指標(biāo)用于臨床［8］。研究證實，SLE 患者血清中可溶性TRAIL（sTRAIL）平均濃度（936.0 pg/ml）高于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者（443.8 pg/ml）、韋格納肉芽腫病患者（357.1 pg/ml）及健康對照組（509.4 pg/ml），且與血液中抗 ssa/ssb 抗體相關(guān)［9］。sTRAIL 在銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者中同樣高表達，但與病情活動程度及臨床表現(xiàn)無關(guān)，并被認為是SLE 血清學(xué)最具特征性的指標(biāo)，可作為診斷依據(jù)［10］。SLE 的病理機制可能為TRAIL濃度增加及其受體TRAIL-R和TRAIL-R2表達增加，通過Fas/FasL（Fas 是一種跨膜蛋白，與FasL 結(jié)合啟動凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細胞凋亡）系統(tǒng)引起單核細胞、淋巴細胞及中性粒細胞程序性凋亡，過多聚集的凋亡細胞碎片可能誘發(fā)自身免疫性疾病，包括SLE。文獻證實，IFN 激活后刺激單核細胞活化，快速表達TRAIL，進一步引起細胞凋亡。通過DNA 微陣列分析TRAIL 介導(dǎo)的基因發(fā)現(xiàn)，TRAIL 凋亡信號通路可與IFN通路相互作用［11-13］。

G0S2是淋巴細胞凝集素誘導(dǎo)的細胞從G0~G1期轉(zhuǎn)換過程中的重要基因，主要參與脂質(zhì)合成代謝，同時通過調(diào)控MYC（最早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因）轉(zhuǎn)錄抑制癌基因轉(zhuǎn)化而作為保護因子存在［14-15］。但G0S2 與SLE 關(guān)系的研究較少，研究者發(fā)現(xiàn)SLE 患者及血管炎患者G0S2表達上調(diào)，并建立G0S2-TG小鼠（過表達人G0S2基因），發(fā)現(xiàn)此小鼠雖未出現(xiàn)血管炎癥狀，但并不健康，子代較少，且血液中抗dsDNA 和抗核抗體升高，并在真皮和皮下脂肪組織形成微膿腫樣脂膜炎病變［16］。盡管以上研究與SLE病理特點吻合，但由于小鼠樣本太少，且與本研究結(jié)論相反，因此本研究得到G0S2基因表達下調(diào)的結(jié)論，有待擴大樣本量或采用人類患者樣本進一步研究。

綜上所述，SLE 是一個免疫細胞過度活化并又過度凋亡的持續(xù)增強的圓環(huán)反饋過程，最終引起一系列臨床表現(xiàn)，進一步探索SLE 發(fā)病機制及靶向治療迫在眉睫。