miR-1-5p修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠的治療作用研究①

胡明智 丁麗麗 張晶瑩 龐春艷 張 偉 王永福 孫曉林

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，包頭 014010）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以血清中出現(xiàn)抗核抗體為代表的多種自身抗體和全身多系統(tǒng)受累為主要臨床特征的慢性自身免疫性疾?。?］。目前SLE 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究證實(shí)輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）以及輔助性T細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）和輔助性T細(xì)胞2（T helper cell 2，Th2）比例失衡在SLE 的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［2-4］。糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑是SLE 傳統(tǒng)治療手段，雖然能控制多數(shù)患者的病情并改善預(yù)后，但關(guān)于療效與安全性一直存在爭(zhēng)議。近年來(lái)，關(guān)于MSCs治療SLE的研究取得很大進(jìn)展。MSCs 具有多向分化、低免疫原性、促進(jìn)組織損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)［5］。但有研究提示MSCs在宿主內(nèi)的移植存活率較低，其在宿主內(nèi)的組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)功能會(huì)受到影響。對(duì)MSCs 進(jìn)行基因修飾，可以提高M(jìn)SCs 的存活率、增殖率以及促再生能力，有利于MSCs 在宿主內(nèi)更有效地發(fā)揮組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)作用［6］。miRNA 屬于非編碼小分子RNA，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA 在自身免疫性疾病中異常表達(dá)，其中miR-1 在多發(fā)性肌炎中呈低表達(dá)［7］。有研究發(fā)現(xiàn)miR-1-3p 通過(guò)作用于靶基因影響多發(fā)性硬化患者 Th17 細(xì)胞的分化［8］。TIAN 等［9］在一篇關(guān)于急性期哮喘患兒外周血炎癥因子表達(dá)的研究中指出，miR-1可能通過(guò)直接或間接改變Th1/Th2細(xì)胞的平衡，從而影響相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)并在炎癥過(guò)程中發(fā)揮作用。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE 的常見(jiàn)并發(fā)癥，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析顯示腎小球內(nèi)單核細(xì)胞增多，腎小管間質(zhì)巨噬細(xì)胞增多，有研究表明miR-1能顯著抑制C-C基序趨化因子配體5和C-X-C 基序趨化因子配體10 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移［10-11］。因此，本研究利用hsa-miR-1-5p mimic轉(zhuǎn)染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord-mesen?chymal stem cells，UC-MSCs），經(jīng)尾靜脈移植治療MRL/lpr SLE模型小鼠，探討miR-1-5p修飾的UC-MSCs對(duì)MRL/lpr小鼠的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新生兒臍帶由包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，經(jīng)患者知情同意。選取包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科處于疾病活動(dòng)期、年齡性別相匹配的20~60歲SLE患者和健康體檢者各26例，SLE的診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)ACR 1997 年推薦的SLE 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。所有患者經(jīng)過(guò)知情同意后獲取外周血標(biāo)本，該研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)MRL/lpr SLE 模型小鼠15 只，雌性，6~8 周齡，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，16~18周齡時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，體質(zhì)量約20 g。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基、OPTI 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；mirVanaTMmiRNA mimic、miR-1 Positive Control、FAM3TMDye-Labeled Pre-miR Nega?tive Control#1、Lipofectamine?RNAiMAX Reagent、Trizol Reagent 購(gòu)自 Themor Fisher 公司；佛波酯/離子霉素混合物［PMA/Ionomycin mixture（250×）］、布雷非德菌素A/莫能霉素混合物［BFA/Monensin Mixture（250×）］購(gòu)自聯(lián)科生物；Mouse Th17/Treg Phenotyp?ing Kit 試劑盒、FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse IFN-γ、APC Rat Anti-Mouse IL-4 購(gòu)自 BD公司；細(xì)胞內(nèi)固定和破膜緩沖液組合購(gòu)自eBioscience公司；miRNA第一鏈cDNA合成（莖環(huán)法）試劑盒購(gòu)自上海生工；RT-PCR Kit試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司；定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 用TRIzol 試劑獲取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)miR-1-5p 在SLE 患者、健康人群PBMCs 中的表達(dá)，使用miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異引物和SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒于定量PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀進(jìn)行定量檢測(cè)，最后結(jié)果以2?ΔΔCt分析 miR-1-5p 的相對(duì)表達(dá)。miR-1-5p 基因引物序列如下，正向：5'-GCGCGCGACATACTTCTT?TATAT-3'；反向：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC?GA-3'。內(nèi)參U6 基因引物序列如下，正向：5'-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3'；反向：5'-GTCG?TATCCAGTGCAGGGTCCGA-3'。

1.2.2 UC-MSCs 的分離培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，取健康足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)新生兒臍帶組織，在超凈臺(tái)內(nèi)用含兩性霉素B 的PBS 反復(fù)洗滌去除殘血，并剔除臍動(dòng)靜脈，留下Wharton 膠樣組織。用組織剪將其剪碎至1 mm3大小，接種于含有DMEM/F12（含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清，1%雙抗）培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3~4 d 換液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，取2代UC-MSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取第2 代UC-MSCs 接種于6 孔板，待細(xì)胞融合至60%~80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前用OPTI 培 養(yǎng) 基 潤(rùn) 洗 2 遍 ，將 9 μl Lipofectamine?RNAiMAX Reagent 和150 μl OPTI 培養(yǎng)基混合稀釋?zhuān)?0 pmol 的 miRNA mimic 和 150 μl OPTI 培養(yǎng)基混合稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮膍iRNA 加入稀釋后的Lipo?fectamine?RNAiMAX Reagent（1∶1 比例），室溫孵育5 min，每孔加入250 μl 的RNA-脂質(zhì)體混合物，轉(zhuǎn)染48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 動(dòng)物治療 小鼠隨機(jī)分為5 組：MRL/lpr 狼瘡小鼠未處理組（Control 組）、PBS 治療組（PBS 組）、UC-MSCs 治療組（UC-MSCs 組）、miRNA negative control轉(zhuǎn)染UC-MSCs治療組（UC-MSCs+miR-NC組）、miR-1-5p轉(zhuǎn)染UC-MSCs治療組（UC-MSCs+miR-1組），每組3 只。16~18 周齡時(shí)開(kāi)始治療，尾靜脈注射UC-MSCs，每次注射的細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/100 μl，每周1 次，共治療5 次，PBS 組尾靜脈給予等體積的PBS，治療結(jié)束1周后處死所有小鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.5 HE 染色 取小鼠腎臟和肺臟，PBS 清洗，用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，中性樹(shù)膠封存，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟和肺臟的病理變化。

1.2.6 ELISA 檢測(cè) 用4%水合氯醛麻醉小鼠，0.2 ml/20 g 腹腔注射，麻醉過(guò)程中進(jìn)行心臟采血，4 000 r/min，離心10 min，獲取血清，ELISA 試劑盒測(cè)定小鼠血清中IL-10 濃度，加樣后37 ℃溫育30 min，洗滌，加入酶標(biāo)試劑，再次溫育、洗滌，加入顯色劑，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)的吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組IL-10的濃度。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠胸腺T 淋巴細(xì)胞亞群的分化情況 處死小鼠后摘取胸腺組織，用含1%雙抗的PBS 清洗，移至超凈工作臺(tái)，置于細(xì)胞篩研磨，用 PBS 沖洗過(guò)篩，1 600 r/min，離心 5 min，棄上清，用1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞置于6 孔板中培養(yǎng)，加入12.5 μg/ml 的PMA 和1 mg/ml 的BFA，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~10 h，收集細(xì)胞。CD4單抗對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行標(biāo)記染色，4 ℃避光孵育30 min；DPBS 洗滌1 次離心棄上清，加入固定破膜液并渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min，加入透化液，1 300 r/min 離心5 min，棄上清；在剩余體積的透化液中重懸沉淀，分別加入1 μl Foxp3、IL-17A、IFN-γ、IL-4單抗進(jìn)行胞內(nèi)標(biāo)記染色，室溫避光孵育30 min；加入透化液，1 300 r/min 離心5 min 棄上清，將細(xì)胞重懸于400 μl 流式細(xì)胞術(shù)染色液中，上機(jī)檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群的分化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用表示，各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較用LSD-t法和塔姆黑尼法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1-5p 在 SLE 患者 PBMCs 中的表達(dá)下調(diào)收集年齡和性別相匹配的26 例SLE 患者和26 例健康對(duì)照人群的PBMCs，采用qRT-PCR 檢測(cè)miR-1-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示：miR-1-5p 在 SLE 患者 PBMCs 中的表達(dá)顯著低于健康對(duì)照人群（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 SLE患者和健康對(duì)照人群PBMCs中miR-1-5p的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-1-5p in PBMCs isolated from SLE and healthy control subjects

2.2 miR-1-5p 修飾的 UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠腎組織和肺組織病理學(xué)變化的影響

2.2.1 HE 染色觀察各組小鼠腎臟病理變化 結(jié)果如圖2 可見(jiàn)，Control 組小鼠有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、微血栓出現(xiàn)。與Control組相比，UC-MSCs+miR-1組病理表現(xiàn)得到明顯緩解，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、微血栓明顯減少。

圖2 miR-1-5p 修飾的 UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠腎組織病理學(xué)變化的影響Fig.2 Effects of miR-1-5p modified UC-MSCs on renal tissue pathology of MRL/lpr mice

2.2.2 HE 染色觀察各組小鼠肺臟病理變化 結(jié)果如圖3 可見(jiàn)，Control 組小鼠肺組織出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎改變，表現(xiàn)為肺間質(zhì)內(nèi)血管充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺組織發(fā)生實(shí)變。與Control 組相比，UC-MSCs+miR-1 組炎癥反應(yīng)得到明顯緩解，肺間質(zhì)血管充血水腫、肺實(shí)變明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

圖3 miR-1-5p 修飾的 UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響Fig.3 Effects of miR-1-5p modified UC-MSCs on lung tissue pathology of MRL/lpr mice

2.3 miR-1-5p 修飾的 UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠脾臟的影響 研究miR-1-5p 修飾的UC-MSCs 對(duì)MRL/lpr 小鼠脾臟腫大的抑制作用，如圖4 所示，與未處理組相比，miR-1-5p 轉(zhuǎn)染UC-MSCs 治療組脾臟腫大程度顯著減輕。

圖4 MRL/lpr小鼠脾臟的代表性圖片F(xiàn)ig.4 Representative pictures of spleen in MRL/lpr mice

2.4 miR-1-5p 修飾的 UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠血清中IL-10 表達(dá)水平的影響 ELISA 檢測(cè)各組小鼠血清中IL-10 表達(dá)水平，結(jié)果如圖5 所示，miR-1-5p轉(zhuǎn)染UC-MSCs 治療組的血清IL-10 水平顯著高于未處理組MRL/lpr小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 各組MRL/lpr小鼠血清中IL-10的水平（，n=3）Fig.5 Levels of IL-10 in serum of MRL/lpr mice in each group（，n=3）

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-1-5p 修飾UC-MSCs 對(duì)MRL/lpr 小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群分化的影響 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)治療后各組小鼠胸腺Th17、Treg、Th1、Th2 細(xì)胞的分化情況及 Th17/Treg、Th1/Th2 細(xì)胞比例的變化。

2.5.1 各組小鼠胸腺Th17細(xì)胞的分化情況 Th17細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6，Th17 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)：UC-MSCs+miR-1 組、UC-MSCs+miR-NC 組、UC-MSCs 組、PBS 組分別與Control 組進(jìn)行組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖6 各組MRL/lpr小鼠胸腺淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞流式檢測(cè)圖Fig.6 Flow cytometric analysis of Th17 cells in thymus of MRL/lpr mice in each group

2.5.2 各組小鼠胸腺Treg 的分化情況 Treg 流式檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7，Treg占CD4+T細(xì)胞的百分比見(jiàn)表1。由表 1 可見(jiàn)：與 Control 組相比，UC-MSCs+miR-1 組Treg 占CD4+T 細(xì)胞的百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。UC-MSCs+miR-1 組 Treg 占 CD4+T 細(xì)胞的百分比也顯著高于PBS 組、UC-MSCs 組、UC-MSCs+miR-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖7 各組MRL/lpr小鼠胸腺淋巴細(xì)胞Treg流式檢測(cè)圖Fig.7 Flow cytometric analysis of Treg in thymus of MRL/lpr mice in each group

2.5.3 各組Th17/Treg 由表1 可見(jiàn)：UC-MSCs+miR-1 組、UC-MSCs+miR-NC 組、UC-MSCs 組、PBS 組分別與Control組進(jìn)行組間比較，Th17/Treg差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組MRL/lpr小鼠胸腺Th17、Treg的分化情況及細(xì)胞比例的變化（，n=3）Tab.1 Differentiation of Th17 and Treg and changes in cell proportions in thymus of MRL/lpr mice in each group（，n=3）

表1 各組MRL/lpr小鼠胸腺Th17、Treg的分化情況及細(xì)胞比例的變化（，n=3）Tab.1 Differentiation of Th17 and Treg and changes in cell proportions in thymus of MRL/lpr mice in each group（，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with PBS group，2）P<0.05.

F P 0.753 0.084 0.270 Indexes Th17 Treg Th17/Treg Control 21.27±6.19 2.27±0.55 9.32±0.54 PBS 15.00±2.61 1.97±0.84 9.03±5.08 UC-MSCs 21.37±8.27 3.07±1.59 7.27±0.90 UC-MSCs+miR-NC 23.73±11.40 2.93±2.15 11.22±6.41 UC-MSCs+miR-1 21.23±9.60 6.70±3.341）2）3.96±2.45 0.476 2.821 1.515

2.5.4 各組小鼠胸腺Th1 細(xì)胞的分化情況 Th1細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8，Th1 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比見(jiàn)表2。由表2 可見(jiàn)：UC-MSCs+miR-1 組、UC-MSCs+miR-NC 組、UC-MSCs 組、PBS 組分別與Control 組進(jìn)行組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖8 各組MRL/lpr小鼠胸腺淋巴細(xì)胞Th1細(xì)胞流式檢測(cè)圖Fig.8 Flow cytometric analysis of Th1 cells in thymus of MRL/lpr mice in each group

2.5.5 各組小鼠胸腺Th2 細(xì)胞的分化情況 Th2細(xì)胞流式檢測(cè)圖，見(jiàn)圖9，Th2 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比，見(jiàn)表2。由表2 可見(jiàn)：與Control 組相比，UCMSCs+miR-1 組Th2 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖9 各組MRL/lpr小鼠胸腺淋巴細(xì)胞Th2細(xì)胞流式檢測(cè)圖Fig.9 Flow cytometric analysis of Th2 cells in thymus of MRL/lpr mice in each group

2.5.6 各組Th1/Th2 細(xì)胞比例 由表2 可見(jiàn)：UCMSCs+miR-1 組、UC-MSCs+miR-NC 組、UC-MSCs 組、PBS組分別與Control組進(jìn)行組間比較，Th1/Th2比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組MRL/lpr小鼠胸腺Th1、Th2細(xì)胞的分化情況及細(xì)胞比例的變化（，n=3）Tab.2 Differentiation of Th1 and Th2 cells and changes in cell proportions in thymus of MRL/lpr mice in each group（，n=3）

表2 各組MRL/lpr小鼠胸腺Th1、Th2細(xì)胞的分化情況及細(xì)胞比例的變化（，n=3）Tab.2 Differentiation of Th1 and Th2 cells and changes in cell proportions in thymus of MRL/lpr mice in each group（，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

F P 0.878 0.297 0.526 Indexes Th1 Th2 Th1/Th2 Control 8.50±3.46 1.67±1.32 9.98±11.80 PBS 10.57±7.13 4.57±2.03 3.49±4.06 UC-MSCs 15.70±8.37 4.33±2.53 3.86±2.14 UC-MSCs+miR-NC 14.90±15.88 3.57±1.71 3.66±2.91 UC-MSCs+miR-1 11.77±9.06 6.53±4.201）2.00±0.93 0.289 1.417 0.848

3 討論

MSCs 是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層的一群具有多向分化潛能、高度自我更新的多能干細(xì)胞，其來(lái)源廣泛，正常骨髓、脂肪、胎盤(pán)、牙髓和臍帶等組織都可分離出MSCs。同時(shí)MSCs 還具有低免疫原性、促進(jìn)組織損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等特性，且相對(duì)易于分離培養(yǎng)，因此在治療移植物抗宿主病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾病中有極大的應(yīng)用前景［12］。MSCs 對(duì)多種免疫細(xì)胞都具有免疫調(diào)節(jié)功能，可有效抑制巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化［13］。UC-MSCs從新生兒廢棄臍帶組織中獲得，因此較其他組織來(lái)源干細(xì)胞也更具有倫理學(xué)優(yōu)勢(shì)［14］。近年來(lái)關(guān)于基因修飾MSCs 治療疾病的研究越來(lái)越多，基因修飾可以使目的基因得到穩(wěn)定有效表達(dá)，分泌針對(duì)疾病有益的特定因子，提高移植后細(xì)胞在體內(nèi)的存活率，具有巨大的治療潛力［6］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1-5p在SLE 患者中呈低表達(dá)，利用miR-1-5p 修飾UCMSCs 治療SLE 模型 MRL/lpr 小鼠，探討其治療作用機(jī)制，為MSCs 在臨床治療上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

MRL/lpr 狼瘡小鼠是常見(jiàn)的SLE 動(dòng)物模型之一，與人類(lèi)SLE 有相似的癥狀表現(xiàn)，由于Fas 基因突變導(dǎo)致T 細(xì)胞增生，發(fā)生自身免疫性反應(yīng)。MRL/lpr小鼠的癥狀主要表現(xiàn)為自身抗體滴度升高、狼瘡性腎炎、間質(zhì)性肺炎等［15］。本研究HE 染色結(jié)果顯示，與MRL/lpr 未處理組相比，miR-1-5p 轉(zhuǎn)染的UCMSCs 治療組和UC-MSCs 治療組中腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺間質(zhì)血管充血水腫、肺實(shí)變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯得到緩解，其中miR-1-5p 轉(zhuǎn)染的UCMSCs 治療組的治療效果更顯著，提示UC-MSCs 可能對(duì)MRL/lpr 小鼠的腎臟和肺臟的病理改變起到一定緩解作用，而miR-1-5p 通過(guò)修飾UC-MSCs 可以更有效地改善MRL/lpr 小鼠狼瘡性腎炎和間質(zhì)性肺炎的病理變化。

IL-10 是一種抗炎細(xì)胞因子，也能促進(jìn)B 細(xì)胞反應(yīng)，一般認(rèn)為在SLE 中起致病作用［16］。大量研究證明了IL-10 在小鼠狼瘡發(fā)病機(jī)制中的復(fù)雜性，IL-10在各小鼠狼瘡模型中的作用是不同的［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，在MRL/lpr 狼瘡模型中，IL-10 可以通過(guò)抑制致病性Th1 細(xì)胞因子反應(yīng)而對(duì)病情起到緩解作用［18］。FU 等［19］在研究血管活性腸肽調(diào)節(jié) Th17/Treg平衡改善狼瘡小鼠腎損傷中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 和IL-10 表達(dá)水平的降低與潑尼松誘導(dǎo)狼瘡小鼠的腎小球腎炎有關(guān)。本研究ELISA 結(jié)果顯示，UC-MSCs 上調(diào)MRL/lpr 小鼠血清中IL-10 表達(dá)水平的作用不顯著，miR-1-5p 修飾的 UC-MSCs 可以顯著上調(diào) MRL/lpr 小鼠血清中IL-10 的表達(dá)，進(jìn)而參與改善MRL/lpr 小鼠病情。鑒于SLE是一種高度異質(zhì)性的自身免疫性疾病，IL-10在SLE 患者中的作用也可能取決于其臨床特征，例如不同器官的受累情況［20］。

已有大量研究證實(shí)在SLE 中Th1/Th2、Th17/Treg 的比值升高，平衡受到破壞，導(dǎo)致促炎反應(yīng)增強(qiáng)［2-3，21］。有研究報(bào)道，SLE患者外周血Th1/Th2細(xì)胞比值可作為反映狼瘡性腎炎組織病理學(xué)變化的有用指標(biāo)［22］。Th17/Treg 免疫失衡使促炎細(xì)胞因子分泌，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體，是促進(jìn)狼瘡性腎炎發(fā)生發(fā)展的重要因素之一［23］。本研究結(jié)果顯示，UC-MSCs 治療組和未處理組相比，Treg 和Th2 細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均有上調(diào)趨勢(shì)；miR-1-5p修飾的UC-MSCs 治療組和未處理組相比，Th17/Treg和Th1/Th2 細(xì)胞比例顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均有下調(diào)趨勢(shì)；UC-MSCs 治療組和未處理組相比，Th17/Treg和Th1/Th2細(xì)胞比例顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但同樣均有下調(diào)趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明UC-MSCs對(duì) MRL/lpr 小鼠胸腺 Treg、Th2 細(xì)胞及 Th17/Treg 比例和Th1/Th2 比例均有一定的調(diào)節(jié)作用，但作用可能不顯著。而miR-1-5p 修飾的UC-MSCs 治療組和未處理組相比，Treg 和Th2 細(xì)胞比例均顯著上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-1-5p 可以通過(guò)修飾UC-MSCs，上調(diào)MRL/lpr小鼠胸腺Treg和Th2細(xì)胞的比例，加強(qiáng)UC-MSCs 對(duì)MRL/lpr 小鼠胸腺Th17/Treg比例和Th1/Th2 比例失衡的免疫調(diào)節(jié)作用，從而減輕MRL/lpr小鼠腎損害，改善病情，對(duì)UC-MSCs治療MRL/lpr 狼瘡小鼠起到協(xié)同作用。研究結(jié)果也顯示，miR-1-5p 修飾的UC-MSCs 治療組和未處理組相比，Th17 和Th1 細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明miR-1-5p修飾UC-MSCs對(duì)MRL/lpr小鼠胸腺Th17和Th1細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用不顯著。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、自噬中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)大量研究證實(shí)，mTOR 信號(hào)通路的激活是 SLE 發(fā)病的基礎(chǔ)［24-25］。mTOR 高表達(dá)是導(dǎo)致 SLE患者T 細(xì)胞代謝異常和Th17/Treg 失衡的重要信號(hào)機(jī)制［26］。HAXHINASTO 等［27］研究證實(shí) AKT/mTOR信號(hào)通路可以調(diào)控 Treg 分化，AKT 通過(guò) mTORC1 途徑顯著降低Foxp3 的表達(dá)，從而抑制Treg 細(xì)胞的分化。SAUER 等［28］也在研究中發(fā)現(xiàn)，抑制 PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路可促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞中Foxp3 表達(dá)。這些研究均表明mTOR信號(hào)通路可以調(diào)控Treg細(xì)胞的分化和Foxp3 的表達(dá)［29］。本研究已經(jīng)證實(shí)miR-1-5p修飾的UC-MSCs可以促進(jìn)MRL/lpr小鼠胸腺Treg細(xì)胞的分化和增殖，但其機(jī)制尚不明確。LI 等［30］研究發(fā)現(xiàn)miR-183 可以通過(guò)靶向抑制mTOR 信號(hào)通路，減輕小鼠狼瘡性腎炎損傷，恢復(fù)Treg 和Th17 細(xì)胞的免疫失衡。CHEN等［31］研究發(fā)現(xiàn)，AKT1是miR-633 的 直 接 靶 點(diǎn) ，miR-633 過(guò) 表 達(dá) 可 導(dǎo) 致 AKT1 和mTOR 表達(dá)水平降低，miR-633 下調(diào)可使AKT/mTOR通路激活，參與SLE 的發(fā)病。因此，檢測(cè)mTOR 信號(hào)通路的激活情況可作為下一步深入研究的內(nèi)容，探討miR-1-5p 是否通過(guò)調(diào)控mTOR 信號(hào)通路，影響Treg 分化和增殖，從而加強(qiáng) UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠胸腺Th17/Treg比例失衡的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在SLE 患者中miR-1-5p的表達(dá)下調(diào)，miR-1-5p 修飾的UC-MSCs 可以顯著上調(diào)MRL/lpr 小鼠血清中抗炎因子IL-10 的表達(dá)水平，并且抑制MRL/lpr 小鼠脾臟腫大。miR-1-5p 修飾的UC-MSCs 對(duì) MRL/lpr 小鼠胸 腺 Treg 和 Th2 細(xì)胞 具有免疫調(diào)節(jié)作用，可能通過(guò)促進(jìn)MRL/lpr 小鼠胸腺Treg 和 Th2 細(xì)胞分化，對(duì) MRL/lpr 小鼠胸腺 Th17/Treg 和Th1/Th2 比例失衡起到免疫調(diào)節(jié)作用，并減輕MRL/lpr 小鼠腎損害和肺損害，改善病情，為治療SLE提供了新思路。