沈立軍 朱雪梅 邱玉華 (蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,蘇州 215123)
蛋白質(zhì)組學(xué)是以體系中所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象,然后進(jìn)行定性、定量及相互作用分析,進(jìn)而揭示蛋白質(zhì)功能的一門學(xué)科。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)能夠找出兩個(gè)甚至多個(gè)蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系。其中Label-free 無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種通過(guò)觀察離子強(qiáng)度變化,測(cè)量?jī)蓚€(gè)或更多樣本間表達(dá)差異蛋白的技術(shù)。Label-free 方法與其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比,無(wú)須標(biāo)記,應(yīng)用廣泛,不受比較樣品數(shù)限制,靈敏度高,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)便。近年來(lái),隨著先進(jìn)的高通量、高靈敏和快速掃描質(zhì)譜儀的快速發(fā)展,蛋白質(zhì)分析鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域[1-2]。
B7-1(即CD80)分子是活化T 細(xì)胞的信號(hào)分子之一,主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)表面,其與相應(yīng)受體 CD28 結(jié)合可介導(dǎo)T細(xì)胞活化,為促使T-B細(xì)胞間的相互作用提供了重要的分子基礎(chǔ),從而有效地維持了機(jī)體在正常生理狀態(tài)下的自我免疫應(yīng)答[3-5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),B7-1特異性抗體通過(guò)與APCs 表面表達(dá)的B7-1 分子相互結(jié)合,阻斷或減弱B7-1-CD28 間的傳遞通路,抑制T 細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌,抑制T-B 細(xì)胞間的黏附,進(jìn)而抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答等[6]。故此類免疫干預(yù)方法對(duì)由于免疫應(yīng)答異常而引起的疾病,如自身免疫病、超敏反應(yīng)和移植排斥等均具有潛在的研究和治療意義。
研究結(jié)果表明,B7-1 分子可在人B 系惡性腫瘤細(xì)胞株中高表達(dá),是參與T 細(xì)胞活化增殖必需的信號(hào)分子之一,推測(cè)該分子可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及逃逸,與多種B系腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。本文通過(guò)注射雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水,采用Protein A 層析技術(shù),制備鼠抗人B7-1 單克隆抗體(命名為4E5),通過(guò)將該抗體與人B 系腫瘤細(xì)胞Daudi 共同培養(yǎng),觀察和分析其對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)和增殖的影響,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究小鼠抗人B7-1 單克隆抗體抑制Daudi 細(xì)胞增殖的信號(hào)通路及機(jī)制,旨在探究B7-1 表達(dá)于B 系腫瘤表面的意義,從宏觀角度為B系惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療及預(yù)后提供參考。
1.1 材料 SPF 級(jí)雌性裸鼠(BALB/c,3~5 周齡)購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;雜交瘤細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室自行制備并保存;Daudi 細(xì)胞購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù);RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone;胰酶購(gòu)自 Mediatech;DMSO、Pristane 均購(gòu)自 Sigma-Aldrich;DTT、IAA、尿素、NaHCO3均購(gòu)自 Sigma;甲醇、乙醇、甲酸、蛋白酶抑制劑、乙腈均購(gòu)自Thermo Fisher;MTT購(gòu)自BD公司;Protein A親和層析柱購(gòu)自Merck;山羊抗小鼠 IgG-PE 購(gòu)自 eBioscience;蛋白純化儀購(gòu)自GE;多功能超聲儀購(gòu)自Sonics;真空濃縮儀購(gòu)自Eppendorf;酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices;流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD 公司;Orbitrap Fusion Lumos 三合一超高分辨質(zhì)譜儀購(gòu)自Thermo Fisher。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1 單抗的雜交瘤細(xì)胞株,向培養(yǎng)皿中加入含10 ml/L FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基,將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2 抗體的制備與純化 腹腔注射0.5 ml Pris?tane,使裸鼠致敏。離心收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞,重懸并計(jì)數(shù)。向已致敏的裸鼠腹腔內(nèi)注入細(xì)胞(1×107個(gè)/只),輕按裸鼠腹部,7~10 d 后腹水即可形成。抽取腹水,3 000 r/min 離心10 min,收取上清,以PBS等體積稀釋,采用Protein A免疫層析法進(jìn)行抗體純化,過(guò)濾除菌后進(jìn)行濃度和活性檢測(cè)。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體活性 收集Daudi 細(xì)胞懸液于15 ml 離心管,1 200 r/min 室溫離心5 min,棄上清,PBS 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),吸取1×106個(gè)細(xì)胞至離心管,每管加入0.2 μg 4E5 mAb 混勻,4 ℃孵育45 min,用 含 10 ml/L FBS 的 PBS 洗 滌 細(xì) 胞 3 次 ,2 000 r/min 離心5 min,棄上清,PBS 重懸,加入熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,4 ℃避光孵育染色30 min。流式細(xì)胞儀定量分析4E5 mAb 與細(xì)胞膜分子B7-1的結(jié)合。
1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 Daudi 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板(5×104個(gè)/孔),實(shí)驗(yàn)分為 3 組:①4E5 mAb 組(5、10、20、40 μg/ml);②同型IgG 組:等劑量的同源型IgG1 抗體;③空白對(duì)照組。培養(yǎng)48 h 后,每孔加入 10 μl MTT(5 mg/ml),作用 4 h 后,加入150 μl DMSO 溶液溶解結(jié)晶。讀取酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(即A 值),記錄結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。
1.2.5 質(zhì)譜樣本的處理和收集 收集處理好的Daudi 細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次。細(xì)胞中加入含8 mol/L 尿素、1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進(jìn)行超聲裂解,離心取上清。向蛋白質(zhì)溶液中加入終濃度為 5 mmol/L 的DTT,60 ℃條件下孵育30 min 進(jìn)行還原。加入15 mmol/L 的IAA 烷基化。然后向上述體系中加入25 mmol/L 的NH4HCO3溶液置換出尿素。將胰蛋白酶和蛋白按1∶50的質(zhì)量比加入胰酶,37 ℃酶切過(guò)夜。將10%TFA 加入消化后的樣本終止消化,BCA 測(cè)定蛋白濃度。將該樣品溶液過(guò)C18除鹽小柱后收集濾液,在離心濃縮儀中常溫旋干。
1.2.6 質(zhì)譜檢測(cè) 除鹽純化后的多肽樣品通過(guò)Orbitrap Fusion Lumos 三合一質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置質(zhì)譜檢測(cè)分析條件:陽(yáng)離子采集模式;一級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率為60 000;高能碰撞解離(HCD)設(shè)置為15;二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為30%。自動(dòng)采集各多肽信息,獲得其二級(jí)譜圖。
1.2.7 數(shù)據(jù)分析 將UniProt 人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(更新于2021 年1 月 4 日)導(dǎo)入Proteome Discoverer 2.2(Thermo Fisher)軟件,將MS/MS圖譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,檢索方法參考文獻(xiàn)[10],基于Labelfree定量(LFQ)在軟件中表示為肽量化蛋白質(zhì)豐度,將 4E5 mAb 組與同型 IgG 組均值比值≥2.0 且P<0.05 定義為蛋白表達(dá)量上調(diào),比值≤0.5 且P<0.05定義為蛋白表達(dá)量下調(diào)。
1.2.8 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring,PRM)靶向驗(yàn)證 選擇蛋白表達(dá)量上調(diào)最顯著的5個(gè)蛋白(P63218、O14813、P62861、Q9H0D6、O75340)和下調(diào)最為顯著的 5 個(gè)蛋白(O43708、P35998、Q8N4Q1、Q81YS1、Q13526)進(jìn)行蛋白提取,利用Skyline(v. 3.6)軟件進(jìn)行PRM 靶向驗(yàn)證。參數(shù)設(shè)置:蛋白酶為胰蛋白酶,最多允許2 次漏切位點(diǎn);分析肽段長(zhǎng)度:4~50 個(gè)氨基酸;固定氨基酸修飾:半胱氨酸烷基化、乙?;把趸?。
2.1 鼠抗人B7-1 單克隆抗體4E5 的制備純化 將雜交瘤細(xì)胞注射入裸鼠腹腔后,10 只裸鼠均形成腹水,經(jīng)Protein A 柱純化抗體,共收集抗體洗脫液10.2 ml,中和過(guò)濾后測(cè)定蛋白濃度為3.83 mg/ml。
2.2 單克隆抗體4E5 活性鑒定 利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定純化后的抗體活性,結(jié)果顯示,抗人B7-1 單克隆抗體4E5 與Daudi 細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率為93.7%(圖1),純化后的抗體具有B7-1抗原結(jié)合活性。
圖1 4E5與Daudi細(xì)胞表面B7-1的結(jié)合率(陽(yáng)性率)Fig.1 Binding rate of 4E5 mAb to membrane B7-1 of Daudi(Positive rate)
2.3 單克隆抗體4E5對(duì)Daudi細(xì)胞增殖的影響 將4E5抗體加入Daudi細(xì)胞中培養(yǎng)48 h,MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)抗體終濃度為20、40 μg/ml 時(shí),4E5 mAb對(duì)Daudi 細(xì)胞增殖的抑制率分別為(23.52±1.25)%和(30.84±1.09)%(P<0.05,P<0.01,圖2)。表明4E5 mAb可明顯抑制Daudi腫瘤細(xì)胞的增殖。
圖2 單克隆抗體4E5體外抑制Daudi細(xì)胞的增殖Fig.2 Inhibitory effect of 4E5 mAb on proliferation of Daudi in vitro
2.4 質(zhì)譜分析結(jié)果 單克隆抗體4E5 處理Daudi細(xì)胞后的分泌蛋白經(jīng)Label-free定量蛋白技術(shù)分析,共獲得605 122 個(gè)二級(jí)質(zhì)譜譜圖數(shù),其中與肽段相匹配的譜圖數(shù)為25 362 個(gè),有8 076 個(gè)肽段被鑒定,唯一肽段總數(shù)為7 747 個(gè),蛋白質(zhì)總數(shù)為1 705 個(gè),如圖 3A 所示。以差異倍數(shù)≥2 或≤0.5,且P<0.05 作為參考標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白,與IgG 組細(xì)胞相比,4E5組細(xì)胞中共鑒定出169個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中131個(gè)蛋白顯著上調(diào),38 個(gè)蛋白顯著下調(diào)(圖3B);如圖3C所示,紅點(diǎn)在差異蛋白火山圖中代表上調(diào)蛋白,藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)蛋白,黑點(diǎn)代表在兩組樣本中未發(fā)生顯著變化的蛋白;熱圖如圖3D 所示,圖中呈現(xiàn)的為上調(diào)和下調(diào)最顯著的5 個(gè)蛋白;在這169 個(gè)差異表達(dá)蛋白中,涉及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控的有11 個(gè),涉及正調(diào)控的有1個(gè),差異蛋白聚類熱圖如圖3E所示。
圖3 蛋白定性結(jié)果Fig.3 Results of qualitative identification of protein
2.5 PRM 靶向驗(yàn)證 采用靶向PRM 方法對(duì)肽段標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證,比較分析高分辨率質(zhì)譜采集的10個(gè)表達(dá)差異最顯著的蛋白和PRM 定量準(zhǔn)確性,結(jié)果如表1 所示,證實(shí)PRM 的結(jié)果與蛋白組學(xué)的結(jié)果具有一致性。
表1 PRM驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白Tab.1 PRM was used to verify differentially expressed proteins
2.6 差異表達(dá)蛋白的基因本體(gene ontology,GO)注釋分析 GO 分析結(jié)果顯示,差異蛋白主要參與線粒體翻譯的延伸和終止、細(xì)胞增殖、mRNA 的加工、剪接和翻譯、細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸、正轉(zhuǎn)錄調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體間的囊泡運(yùn)輸、基因表達(dá)的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程;差異蛋白主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體、核質(zhì)等細(xì)胞器,其中大部分分布在線粒體附近;在分子功能方面,差異蛋白主要涉及調(diào)節(jié)核苷及GTP連接、調(diào)控激酶活性等,見(jiàn)圖4。
圖4 差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞成分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins involved in cell component,molecular function and biological process
2.7 KEGG 通路分析 采用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行通路富集分析,發(fā)現(xiàn)它們主要參與212 條信號(hào)通路,其中與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)通路主要有 PI3K-Akt、Ras、DNA replication、AMPK、mTOR、Hippo、VEGF、FoxO、Metabolic 等,見(jiàn)表2。
表2 KEGG通路分析與Daudi增殖相關(guān)的差異表達(dá)蛋白注釋Tab.2 Annotation of differentially expressed proteins associated with proliferation of Daudi-related KEGG pathways
本研究利用能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1 mAb 的雜交瘤細(xì)胞株注射小鼠腹腔,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水[11-12]。采用Protein A 免疫親和層析法純化抗體,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定抗體的純度和活性,證實(shí)B7-1 抗體具有高特異性。
研究表明,特異性抗體具有抑瘤效應(yīng)[13-14]。本研究在獲取B7-1 mAb 的基礎(chǔ)上,為探討B(tài)7-1 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的意義,以腫瘤細(xì)胞Daudi(天然高表達(dá)B7-1 分子)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,進(jìn)行一系列研究。通過(guò)MTT 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),該抗體通過(guò)與相應(yīng)抗原分子B7-1 結(jié)合后在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞增殖,表明腫瘤細(xì)胞表面分子B7-1 可能在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
為進(jìn)一步探討B(tài)7-1 分子參與細(xì)胞增殖的機(jī)制,本文采用Orbitrap Fusion Lumos 三合一超高分辨質(zhì)譜儀分析了小鼠抗人B7-1 單克隆抗體4E5 抑制Daudi 細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)水平,兩組細(xì)胞中共鑒定出1 705個(gè)蛋白,其中有169個(gè)差異表達(dá)蛋白。在這些差異表達(dá)蛋白中,131個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),38個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào),涉及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控的有11 個(gè),正調(diào)控的有1個(gè)。差異表達(dá)的蛋白無(wú)疑對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要作用。
本研究結(jié)果表明,參與腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的代表性差異蛋白有P63218、O14813、P62861、Q9H0D6、O75340、O43708、P35998、Q8N4Q1、Q81YS1、Q13526,部分代表性差異蛋白與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系已有報(bào)道[15-17]。PRM 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)利用高分辨率、高精度分析器采集目的肽段的所有碎片離子信息,而后選擇性定量分析目標(biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段,可更好地排除各種干擾因素,具有更好的高效性、準(zhǔn)確性和靈敏度,是蛋白質(zhì)組學(xué)最理想、最有效的驗(yàn)證手段[18-21]。本研究對(duì)5 個(gè)代表性上調(diào)差異蛋白和5 個(gè)代表性下調(diào)差異蛋白,采用PRM 手段進(jìn)行靶向驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí)蛋白組學(xué)結(jié)果與靶向PRM 結(jié)果一致。
GO 注釋和KEGG 信號(hào)富集分析在生物信息學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用[22]。通過(guò)GO注釋發(fā)現(xiàn),4E5封閉的B系腫瘤細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞器,其中又以線粒體附近最多;參與線粒體的翻譯、延伸和終止,細(xì)胞增殖,mRNA的加工、剪接和翻譯,細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸,正轉(zhuǎn)錄調(diào)控等;參與29 個(gè)代謝途徑,其中與細(xì)胞內(nèi)部分子轉(zhuǎn)運(yùn)、受體活性、線粒體功能、GTP結(jié)合活性等密切相關(guān)。線粒體基因(mtDNA)表達(dá)異??梢鹁€粒體能量代謝障礙,進(jìn)而引起神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤等的發(fā)生[23-24]。結(jié)果顯示,4E5 組細(xì)胞中線粒體相關(guān)基因(MRPL58、MRPS35、ANXA6、CLPB、TPP1、NDUFA8、BNIP1、UQCRH 等)表達(dá)發(fā)生變化,提示線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常可引起一系列的損傷過(guò)程,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
KEGG 通路富集結(jié)果顯示4E5 封閉B 系腫瘤細(xì)胞可影響多個(gè)信號(hào)通路,其中與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的主要包括AMPK、PI3K-Akt、mTOR、Ras、DNA replication、Hippo、VEGF、FoxO、Metabolic 信號(hào)通路。AMPK 是參與能量代謝調(diào)節(jié)和多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子之一,其在腫瘤快速增殖的新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮抑制作用,因此,AMPK 蛋白是各種相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)[25]。KANG 等[26]發(fā)現(xiàn)石斑魚(yú)在受到溶藻菌感染時(shí),宿主發(fā)生免疫反應(yīng),CD80(B71)、P13KAkt 等表達(dá)升高刺激免疫細(xì)胞增殖,同時(shí),具有抑制細(xì)胞增殖作用的AMPK 表達(dá)降低,幫助宿主抵御微生物病原體的侵襲。KOVACH 等[27]發(fā)現(xiàn) CD80 配體和VEGF 抗體的聯(lián)合用藥在減少大鼠成骨細(xì)胞(OSA)異常增殖方面比任何一種抗體單獨(dú)用藥更為有效,VEGF 抗體靶向性O(shè)SA 細(xì)胞表面的VEGF 抗原,配體CD80 與細(xì)胞表面的CTLA-4 受體反應(yīng)從而共同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。竇春鵬等[28]發(fā)現(xiàn)DC 經(jīng)K-ras 突變多肽修飾后,可促進(jìn)DC 表面成熟分子(CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CD1a)高表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)DC成熟,增加CIK的增殖及對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。本研究也發(fā)現(xiàn),4E5 組細(xì)胞中通過(guò)封閉人B 系腫瘤細(xì)胞 Daudi 表面的 B7-1 分子導(dǎo)致 AMPK 信號(hào)通路發(fā)生變化,從而抑制了腫瘤細(xì)胞的快速增殖。此外,在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮極其重要生物學(xué)功能的信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR、Ras、DNA replication、Hippo、VEGF、FoxO 等也發(fā)生了顯著變化,提示4E5 也可通過(guò)其他信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生存,其機(jī)制有待后續(xù)探究。
綜上所述,本研究通過(guò)Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出了特異性鼠抗人B7-1 單抗處理B 系腫瘤細(xì)胞Daudi后的差異蛋白,并分析了其GO 功能與KEGG 富集通路,揭示了差異蛋白參與的生物學(xué)功能及信號(hào)通路,從一定程度上為B 系腫瘤的診斷和治療方案提供了研究方向和理論依據(jù)。