小鼠抗人B7-1單克隆抗體抑制腫瘤細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)組學(xué)分析①

沈立軍 朱雪梅 邱玉華 （蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，蘇州 215123）

蛋白質(zhì)組學(xué)是以體系中所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，然后進(jìn)行定性、定量及相互作用分析，進(jìn)而揭示蛋白質(zhì)功能的一門學(xué)科。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)能夠找出兩個(gè)甚至多個(gè)蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系。其中Label-free 無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種通過(guò)觀察離子強(qiáng)度變化，測(cè)量?jī)蓚€(gè)或更多樣本間表達(dá)差異蛋白的技術(shù)。Label-free 方法與其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比，無(wú)須標(biāo)記，應(yīng)用廣泛，不受比較樣品數(shù)限制，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。近年來(lái)，隨著先進(jìn)的高通量、高靈敏和快速掃描質(zhì)譜儀的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)分析鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域［1-2］。

B7-1（即CD80）分子是活化T 細(xì)胞的信號(hào)分子之一，主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）表面，其與相應(yīng)受體 CD28 結(jié)合可介導(dǎo)T細(xì)胞活化，為促使T-B細(xì)胞間的相互作用提供了重要的分子基礎(chǔ)，從而有效地維持了機(jī)體在正常生理狀態(tài)下的自我免疫應(yīng)答［3-5］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，B7-1特異性抗體通過(guò)與APCs 表面表達(dá)的B7-1 分子相互結(jié)合，阻斷或減弱B7-1-CD28 間的傳遞通路，抑制T 細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，抑制T-B 細(xì)胞間的黏附，進(jìn)而抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答等［6］。故此類免疫干預(yù)方法對(duì)由于免疫應(yīng)答異常而引起的疾病，如自身免疫病、超敏反應(yīng)和移植排斥等均具有潛在的研究和治療意義。

研究結(jié)果表明，B7-1 分子可在人B 系惡性腫瘤細(xì)胞株中高表達(dá)，是參與T 細(xì)胞活化增殖必需的信號(hào)分子之一，推測(cè)該分子可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及逃逸，與多種B系腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7-9］。本文通過(guò)注射雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水，采用Protein A 層析技術(shù)，制備鼠抗人B7-1 單克隆抗體（命名為4E5），通過(guò)將該抗體與人B 系腫瘤細(xì)胞Daudi 共同培養(yǎng)，觀察和分析其對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)和增殖的影響，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究小鼠抗人B7-1 單克隆抗體抑制Daudi 細(xì)胞增殖的信號(hào)通路及機(jī)制，旨在探究B7-1 表達(dá)于B 系腫瘤表面的意義，從宏觀角度為B系惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療及預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)雌性裸鼠（BALB/c，3~5 周齡）購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雜交瘤細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室自行制備并保存；Daudi 細(xì)胞購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone；胰酶購(gòu)自 Mediatech；DMSO、Pristane 均購(gòu)自 Sigma-Aldrich；DTT、IAA、尿素、NaHCO3均購(gòu)自 Sigma；甲醇、乙醇、甲酸、蛋白酶抑制劑、乙腈均購(gòu)自Thermo Fisher；MTT購(gòu)自BD公司；Protein A親和層析柱購(gòu)自Merck；山羊抗小鼠 IgG-PE 購(gòu)自 eBioscience；蛋白純化儀購(gòu)自GE；多功能超聲儀購(gòu)自Sonics；真空濃縮儀購(gòu)自Eppendorf；酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD 公司；Orbitrap Fusion Lumos 三合一超高分辨質(zhì)譜儀購(gòu)自Thermo Fisher。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1 單抗的雜交瘤細(xì)胞株，向培養(yǎng)皿中加入含10 ml/L FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 抗體的制備與純化 腹腔注射0.5 ml Pris?tane，使裸鼠致敏。離心收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，重懸并計(jì)數(shù)。向已致敏的裸鼠腹腔內(nèi)注入細(xì)胞（1×107個(gè)/只），輕按裸鼠腹部，7~10 d 后腹水即可形成。抽取腹水，3 000 r/min 離心10 min，收取上清，以PBS等體積稀釋，采用Protein A免疫層析法進(jìn)行抗體純化，過(guò)濾除菌后進(jìn)行濃度和活性檢測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體活性 收集Daudi 細(xì)胞懸液于15 ml 離心管，1 200 r/min 室溫離心5 min，棄上清，PBS 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，吸取1×106個(gè)細(xì)胞至離心管，每管加入0.2 μg 4E5 mAb 混勻，4 ℃孵育45 min，用 含 10 ml/L FBS 的 PBS 洗 滌 細(xì) 胞 3 次 ，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 重懸，加入熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，4 ℃避光孵育染色30 min。流式細(xì)胞儀定量分析4E5 mAb 與細(xì)胞膜分子B7-1的結(jié)合。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 Daudi 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板（5×104個(gè)/孔），實(shí)驗(yàn)分為 3 組：①4E5 mAb 組（5、10、20、40 μg/ml）；②同型IgG 組：等劑量的同源型IgG1 抗體；③空白對(duì)照組。培養(yǎng)48 h 后，每孔加入 10 μl MTT（5 mg/ml），作用 4 h 后，加入150 μl DMSO 溶液溶解結(jié)晶。讀取酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（即A 值），記錄結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.5 質(zhì)譜樣本的處理和收集 收集處理好的Daudi 細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次。細(xì)胞中加入含8 mol/L 尿素、1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進(jìn)行超聲裂解，離心取上清。向蛋白質(zhì)溶液中加入終濃度為 5 mmol/L 的DTT，60 ℃條件下孵育30 min 進(jìn)行還原。加入15 mmol/L 的IAA 烷基化。然后向上述體系中加入25 mmol/L 的NH4HCO3溶液置換出尿素。將胰蛋白酶和蛋白按1∶50的質(zhì)量比加入胰酶，37 ℃酶切過(guò)夜。將10%TFA 加入消化后的樣本終止消化，BCA 測(cè)定蛋白濃度。將該樣品溶液過(guò)C18除鹽小柱后收集濾液，在離心濃縮儀中常溫旋干。

1.2.6 質(zhì)譜檢測(cè) 除鹽純化后的多肽樣品通過(guò)Orbitrap Fusion Lumos 三合一質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置質(zhì)譜檢測(cè)分析條件：陽(yáng)離子采集模式；一級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率為60 000；高能碰撞解離（HCD）設(shè)置為15；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為30%。自動(dòng)采集各多肽信息，獲得其二級(jí)譜圖。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 將UniProt 人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（更新于2021 年1 月 4 日）導(dǎo)入Proteome Discoverer 2.2（Thermo Fisher）軟件，將MS/MS圖譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索方法參考文獻(xiàn)［10］，基于Labelfree定量（LFQ）在軟件中表示為肽量化蛋白質(zhì)豐度，將 4E5 mAb 組與同型 IgG 組均值比值≥2.0 且P<0.05 定義為蛋白表達(dá)量上調(diào)，比值≤0.5 且P<0.05定義為蛋白表達(dá)量下調(diào)。

1.2.8 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（parallel reaction monitoring，PRM）靶向驗(yàn)證 選擇蛋白表達(dá)量上調(diào)最顯著的5個(gè)蛋白（P63218、O14813、P62861、Q9H0D6、O75340）和下調(diào)最為顯著的 5 個(gè)蛋白（O43708、P35998、Q8N4Q1、Q81YS1、Q13526）進(jìn)行蛋白提取，利用Skyline（v. 3.6）軟件進(jìn)行PRM 靶向驗(yàn)證。參數(shù)設(shè)置：蛋白酶為胰蛋白酶，最多允許2 次漏切位點(diǎn)；分析肽段長(zhǎng)度：4~50 個(gè)氨基酸；固定氨基酸修飾：半胱氨酸烷基化、乙?；把趸?。

2 結(jié)果

2.1 鼠抗人B7-1 單克隆抗體4E5 的制備純化 將雜交瘤細(xì)胞注射入裸鼠腹腔后，10 只裸鼠均形成腹水，經(jīng)Protein A 柱純化抗體，共收集抗體洗脫液10.2 ml，中和過(guò)濾后測(cè)定蛋白濃度為3.83 mg/ml。

2.2 單克隆抗體4E5 活性鑒定 利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定純化后的抗體活性，結(jié)果顯示，抗人B7-1 單克隆抗體4E5 與Daudi 細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率為93.7%（圖1），純化后的抗體具有B7-1抗原結(jié)合活性。

圖1 4E5與Daudi細(xì)胞表面B7-1的結(jié)合率（陽(yáng)性率）Fig.1 Binding rate of 4E5 mAb to membrane B7-1 of Daudi（Positive rate）

2.3 單克隆抗體4E5對(duì)Daudi細(xì)胞增殖的影響 將4E5抗體加入Daudi細(xì)胞中培養(yǎng)48 h，MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)抗體終濃度為20、40 μg/ml 時(shí)，4E5 mAb對(duì)Daudi 細(xì)胞增殖的抑制率分別為（23.52±1.25）%和（30.84±1.09）%（P<0.05，P<0.01，圖2）。表明4E5 mAb可明顯抑制Daudi腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖2 單克隆抗體4E5體外抑制Daudi細(xì)胞的增殖Fig.2 Inhibitory effect of 4E5 mAb on proliferation of Daudi in vitro

2.4 質(zhì)譜分析結(jié)果 單克隆抗體4E5 處理Daudi細(xì)胞后的分泌蛋白經(jīng)Label-free定量蛋白技術(shù)分析，共獲得605 122 個(gè)二級(jí)質(zhì)譜譜圖數(shù)，其中與肽段相匹配的譜圖數(shù)為25 362 個(gè)，有8 076 個(gè)肽段被鑒定，唯一肽段總數(shù)為7 747 個(gè)，蛋白質(zhì)總數(shù)為1 705 個(gè)，如圖 3A 所示。以差異倍數(shù)≥2 或≤0.5，且P<0.05 作為參考標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白，與IgG 組細(xì)胞相比，4E5組細(xì)胞中共鑒定出169個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中131個(gè)蛋白顯著上調(diào)，38 個(gè)蛋白顯著下調(diào)（圖3B）；如圖3C所示，紅點(diǎn)在差異蛋白火山圖中代表上調(diào)蛋白，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)蛋白，黑點(diǎn)代表在兩組樣本中未發(fā)生顯著變化的蛋白；熱圖如圖3D 所示，圖中呈現(xiàn)的為上調(diào)和下調(diào)最顯著的5 個(gè)蛋白；在這169 個(gè)差異表達(dá)蛋白中，涉及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控的有11 個(gè)，涉及正調(diào)控的有1個(gè)，差異蛋白聚類熱圖如圖3E所示。

圖3 蛋白定性結(jié)果Fig.3 Results of qualitative identification of protein

2.5 PRM 靶向驗(yàn)證 采用靶向PRM 方法對(duì)肽段標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證，比較分析高分辨率質(zhì)譜采集的10個(gè)表達(dá)差異最顯著的蛋白和PRM 定量準(zhǔn)確性，結(jié)果如表1 所示，證實(shí)PRM 的結(jié)果與蛋白組學(xué)的結(jié)果具有一致性。

表1 PRM驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白Tab.1 PRM was used to verify differentially expressed proteins

2.6 差異表達(dá)蛋白的基因本體（gene ontology，GO）注釋分析 GO 分析結(jié)果顯示，差異蛋白主要參與線粒體翻譯的延伸和終止、細(xì)胞增殖、mRNA 的加工、剪接和翻譯、細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸、正轉(zhuǎn)錄調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體間的囊泡運(yùn)輸、基因表達(dá)的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；差異蛋白主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體、核質(zhì)等細(xì)胞器，其中大部分分布在線粒體附近；在分子功能方面，差異蛋白主要涉及調(diào)節(jié)核苷及GTP連接、調(diào)控激酶活性等，見(jiàn)圖4。

圖4 差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞成分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins involved in cell component，molecular function and biological process

2.7 KEGG 通路分析 采用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與212 條信號(hào)通路，其中與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)通路主要有 PI3K-Akt、Ras、DNA replication、AMPK、mTOR、Hippo、VEGF、FoxO、Metabolic 等，見(jiàn)表2。

表2 KEGG通路分析與Daudi增殖相關(guān)的差異表達(dá)蛋白注釋Tab.2 Annotation of differentially expressed proteins associated with proliferation of Daudi-related KEGG pathways

3 討論

本研究利用能穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1 mAb 的雜交瘤細(xì)胞株注射小鼠腹腔，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水［11-12］。采用Protein A 免疫親和層析法純化抗體，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定抗體的純度和活性，證實(shí)B7-1 抗體具有高特異性。

研究表明，特異性抗體具有抑瘤效應(yīng)［13-14］。本研究在獲取B7-1 mAb 的基礎(chǔ)上，為探討B(tài)7-1 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的意義，以腫瘤細(xì)胞Daudi（天然高表達(dá)B7-1 分子）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行一系列研究。通過(guò)MTT 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該抗體通過(guò)與相應(yīng)抗原分子B7-1 結(jié)合后在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，表明腫瘤細(xì)胞表面分子B7-1 可能在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步探討B(tài)7-1 分子參與細(xì)胞增殖的機(jī)制，本文采用Orbitrap Fusion Lumos 三合一超高分辨質(zhì)譜儀分析了小鼠抗人B7-1 單克隆抗體4E5 抑制Daudi 細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)水平，兩組細(xì)胞中共鑒定出1 705個(gè)蛋白，其中有169個(gè)差異表達(dá)蛋白。在這些差異表達(dá)蛋白中，131個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，38個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，涉及細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控的有11 個(gè)，正調(diào)控的有1個(gè)。差異表達(dá)的蛋白無(wú)疑對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，參與腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的代表性差異蛋白有P63218、O14813、P62861、Q9H0D6、O75340、O43708、P35998、Q8N4Q1、Q81YS1、Q13526，部分代表性差異蛋白與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系已有報(bào)道［15-17］。PRM 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)利用高分辨率、高精度分析器采集目的肽段的所有碎片離子信息，而后選擇性定量分析目標(biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段，可更好地排除各種干擾因素，具有更好的高效性、準(zhǔn)確性和靈敏度，是蛋白質(zhì)組學(xué)最理想、最有效的驗(yàn)證手段［18-21］。本研究對(duì)5 個(gè)代表性上調(diào)差異蛋白和5 個(gè)代表性下調(diào)差異蛋白，采用PRM 手段進(jìn)行靶向驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)蛋白組學(xué)結(jié)果與靶向PRM 結(jié)果一致。

GO 注釋和KEGG 信號(hào)富集分析在生物信息學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用［22］。通過(guò)GO注釋發(fā)現(xiàn)，4E5封閉的B系腫瘤細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞器，其中又以線粒體附近最多；參與線粒體的翻譯、延伸和終止，細(xì)胞增殖，mRNA的加工、剪接和翻譯，細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸，正轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；參與29 個(gè)代謝途徑，其中與細(xì)胞內(nèi)部分子轉(zhuǎn)運(yùn)、受體活性、線粒體功能、GTP結(jié)合活性等密切相關(guān)。線粒體基因（mtDNA）表達(dá)異?？梢鹁€粒體能量代謝障礙，進(jìn)而引起神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤等的發(fā)生［23-24］。結(jié)果顯示，4E5 組細(xì)胞中線粒體相關(guān)基因（MRPL58、MRPS35、ANXA6、CLPB、TPP1、NDUFA8、BNIP1、UQCRH 等）表達(dá)發(fā)生變化，提示線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常可引起一系列的損傷過(guò)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

KEGG 通路富集結(jié)果顯示4E5 封閉B 系腫瘤細(xì)胞可影響多個(gè)信號(hào)通路，其中與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的主要包括AMPK、PI3K-Akt、mTOR、Ras、DNA replication、Hippo、VEGF、FoxO、Metabolic 信號(hào)通路。AMPK 是參與能量代謝調(diào)節(jié)和多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子之一，其在腫瘤快速增殖的新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮抑制作用，因此，AMPK 蛋白是各種相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)［25］。KANG 等［26］發(fā)現(xiàn)石斑魚(yú)在受到溶藻菌感染時(shí)，宿主發(fā)生免疫反應(yīng)，CD80（B71）、P13KAkt 等表達(dá)升高刺激免疫細(xì)胞增殖，同時(shí)，具有抑制細(xì)胞增殖作用的AMPK 表達(dá)降低，幫助宿主抵御微生物病原體的侵襲。KOVACH 等［27］發(fā)現(xiàn) CD80 配體和VEGF 抗體的聯(lián)合用藥在減少大鼠成骨細(xì)胞（OSA）異常增殖方面比任何一種抗體單獨(dú)用藥更為有效，VEGF 抗體靶向性O(shè)SA 細(xì)胞表面的VEGF 抗原，配體CD80 與細(xì)胞表面的CTLA-4 受體反應(yīng)從而共同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。竇春鵬等［28］發(fā)現(xiàn)DC 經(jīng)K-ras 突變多肽修飾后，可促進(jìn)DC 表面成熟分子（CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CD1a）高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DC成熟，增加CIK的增殖及對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，4E5 組細(xì)胞中通過(guò)封閉人B 系腫瘤細(xì)胞 Daudi 表面的 B7-1 分子導(dǎo)致 AMPK 信號(hào)通路發(fā)生變化，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的快速增殖。此外，在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮極其重要生物學(xué)功能的信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR、Ras、DNA replication、Hippo、VEGF、FoxO 等也發(fā)生了顯著變化，提示4E5 也可通過(guò)其他信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生存，其機(jī)制有待后續(xù)探究。

綜上所述，本研究通過(guò)Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出了特異性鼠抗人B7-1 單抗處理B 系腫瘤細(xì)胞Daudi后的差異蛋白，并分析了其GO 功能與KEGG 富集通路，揭示了差異蛋白參與的生物學(xué)功能及信號(hào)通路，從一定程度上為B 系腫瘤的診斷和治療方案提供了研究方向和理論依據(jù)。