豬鏈球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白多抗的制備及Dot-ELISA檢測方法的建立

蔡旭燊,燕書豪,趙芷若,鄭 峰，胡 丹，盧亞維,申雪嬌,何 鎧,熊曉輝,操 敏,盧一辰

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種人獸共患病病原體[1]。豬鏈球菌根據(jù)莢膜多糖抗原特異性的不同，可分為 35 個血清型，其中豬鏈球菌2型(Streptococcussuis2,S.suis2)在全世界范圍內(nèi)分布最廣、致病性最強[2]。感染S.suis2可引起腦膜炎、敗血癥、急性死亡等嚴(yán)重病癥，我國曾在江蘇、四川兩地暴發(fā)過大規(guī)模感染S.suis2的疫情，不僅導(dǎo)致了大量生豬的死亡，還分別造成了 25 人感染14 人死亡和 204 人感染 38 人死亡的嚴(yán)重后果[3-4]。其它血清型的分布有明顯的地理差異[5]，英國最流行的血清型是1型和14型。而血清型 9型在澳大利亞、德國、比利時等國家最為流行[6]，血清型 3 型在泰國、韓國等亞洲國家最為常見[7-8]。人感染豬鏈球菌疫情的反復(fù)密集暴發(fā)引起了人們的高度關(guān)注，及時的診斷和發(fā)現(xiàn)S.suis感染，是防控人感染豬鏈球菌疫情的重要措施。因此，針對豬鏈球菌檢測方法的研究具有重要意義。

目前，豬鏈球菌的檢測方法主要包括病原學(xué)檢測、核酸檢測和免疫學(xué)檢測[9]。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的過程主要包括豬鏈球菌的分離和鑒定，該過程繁雜耗時且靈敏度不高。核酸檢測方法包括普通 PCR[10-11]、多重 PCR[12]、熒光定量 PCR[13]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增[14]、基因芯片[15]、脈沖場凝膠電泳[16]等方法。核酸檢測方法靈敏度高，但對設(shè)備和人員的要求較高，在偏遠(yuǎn)地區(qū)不宜廣泛開展。免疫學(xué)檢測方法利用抗原和抗體之間高度特異性結(jié)合的原理，包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫層析法(Immunochromat-ographic assay,ICA)和斑點酶聯(lián)免疫吸附法(Dot enzyme-linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)。免疫學(xué)檢測方法操作簡單，不需要任何復(fù)雜的設(shè)備儀器，適合大規(guī)模現(xiàn)場診斷[17]。Yang等[18]研制了一種免疫層析試紙條，用于檢測S.suis抗體。該方法具有良好的敏感性和特異性，然而這種方法不是直接檢測抗原，不能較早的檢測到S.suis感染。目前，建立一種簡便、快速、經(jīng)濟的S.suis檢測方法是畜牧業(yè)和科學(xué)研究亟待解決的問題[19]。

組氨酸三聯(lián)體蛋白(Histidine triad protein,HTP)是一組膜表面蛋白，廣泛分布于多種鏈球菌中，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域組成不同可以分為 HTP Ⅰ 和HTP Ⅱ 兩個亞型[20]。與 HTP Ⅰ 型蛋白相比，大多數(shù) HTP Ⅱ 型蛋白在末端含有一個富含亮氨酸的重復(fù)序列(Leucine-rich repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域，這表明 HTP Ⅱ 型蛋白在鏈球菌感染中可能起到粘附因子的作用[21]。Shao等[22-23]在S.suis2強毒株05ZYH33中鑒定了3個HTP基因(ORF編號SSU0332、SSU1267和SSU1577)，將它們分別命名為 HtpsA、HtpsB和HtpsC。其中 HtpsC 是唯一一個包含 LRR 結(jié)構(gòu)域的蛋白。Li 等[24]研究發(fā)現(xiàn) HtpsC 蛋白能夠與人細(xì)胞外基質(zhì)的兩種不同組分(層粘連蛋白和纖維連接蛋白)結(jié)合，表明 HtpsC 蛋白是一種新型的粘附素。Lu 等[25]發(fā)現(xiàn) HtpsC在結(jié)構(gòu)上與單增李斯特菌毒力因子內(nèi)化素 A(Internalin A,InlA)相似，進(jìn)一步研究表明，HtpsC 蛋白參與了S.suis2侵襲宿主上皮細(xì)胞的過程，是與細(xì)胞粘附和侵襲有關(guān)的重要毒力因子。我們將 HtpsC 蛋白氨基酸序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上做 BLAST 分析，結(jié)果顯示該蛋白廣泛存在于S.suis多種株型中，且相似性高。Shao 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，35 種不同血清型S.suis的標(biāo)準(zhǔn)株中，29種都含有 HtpsC 蛋白基因。另外，HtpsC 蛋白是暴露于S.suis表面的毒力因子，因此，該蛋白可作為抗原建立一種通用的檢測方法。

本研究通過原核表達(dá)制備了S.suis2強毒株 05ZYH33 的 HtpsC 蛋白，然后經(jīng)過動物免疫試驗獲得了可特異性識別 HtpsC 蛋白的多克隆抗體 Anti-HtpsC，基于制備的 Anti-HtpsC 多克隆抗體建立了S.suis的 Dot-ELISA 檢測方法，并對方法中的 Anti-HtpsC 的工作濃度以及酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，為快速檢測S.suis提供了思路和方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒來源S.suis2強毒株 05ZYH33 分離自 2005 年四川資陽中毒性休克癥病人[26]。S.suis2(NCTC 10234)和S.suis1(5428)、S.suis4(2524)、S.suis7(8074)、S.suis9(22083)、S.suis14(13730)標(biāo)準(zhǔn)株由加拿大 Marecelo Gottschalk 教授惠贈。S.suis2(T15)來自荷蘭 Greeff 實驗室，由Astrid de Greeff惠贈。S.suis2(WZ48-1)由陸軍軍醫(yī)大學(xué)李明老師惠贈。大腸桿菌 GDMCC 801268 (Escherichiacoli)、沙門氏菌 GDMCC 801304(Salmonella)、金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26305(Staphylococcusaureus)、單增李斯特菌ATCC 19115(isteriamonocytegenes)、化膿性鏈球菌ATCC 19615(Streptococcuspyogenes)、無乳鏈球菌GDMCC 1.408(Streptococcusagalactiae)、糞腸球菌 ATCC 51299(Enterococcusfacealis)購自廣東省微生物菌種保藏中心。BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pET-30a 質(zhì)粒由本課題組鑒定和保存。

1.2 主要試劑 5 K DNA Marker、硫酸卡那霉素購于生工生物工程(上海)股份有限公司；NdeI和Hind III購于美國 NEB 公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒(10%)、雙色預(yù)染蛋白Marker(15 ～150 kDa)、ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜 0.45 μm)購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Ni-NTA Agarose 購于德國QIAGEN公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；2×PrimeSTAR mix Premix 購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；硝酸纖維素膜(NC 膜，貨號：abs959)購于愛必信(上海)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔 lgG(H+L)(貨號：bs-40295G-HRP)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP-DAB 底物顯色試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司(貨號：PA110)，THB培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基購于海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 HtpsC 蛋白的制備

1.3.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建 根據(jù) pET-30a 質(zhì)粒多克隆位點分析，選擇NdeI和Hind III 作為插入位點。使用NdeI和Hind III內(nèi)切酶將 pET-30a 載體切線性化。根據(jù)S.suis2強毒株 05ZYH33 的 HtpsC 蛋白基因序列(GenBank: CP000407.1)設(shè)計特異性引物，引物序列如表1所示。以菌液為模板擴增目的基因，使用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒純化目的片段。使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 試劑盒將目的片段和線性化載體進(jìn)行無縫克隆連接獲得重組質(zhì)粒(pET-30a-HtpsC)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞獲得表達(dá)菌株。表達(dá)菌株通過質(zhì)粒提取、測序進(jìn)行驗證。

表1 HtpsC基因擴增引物Tab.1 Primers for the HtpsC gene

1.3.2 HtpsC 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將表達(dá)菌株接種于含有卡納抗性(終濃度為 50 μg/mL)的 LB 培養(yǎng)基，在 37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)至OD600=0.8，然后加終濃度為 0.2 mmol/L的IPTG，在15 ℃誘導(dǎo)16 h后收集菌體。離心后使用 PBS 重懸菌體，超聲破碎后離心分離上清和沉淀，分別加入 SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液并煮沸10 min，然后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析。

1.3.3 HtpsC 蛋白的純化 擴大培養(yǎng)體積并在15 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)16 h 后收集菌體，然后全菌采用 50 mmol/L Tris(pH8.0)，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole含1% Triton X-100，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF 超聲裂解，同時以50 mmol/L Tris(pH8.0)，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L Imidazole緩沖液平衡 Ni-IDA 親和層析柱，之后用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白并收集。將收集的HtpsC蛋白透析至1×PBS中，并在透析結(jié)束后使用0.22 μm濾器過濾，檢測蛋白濃度后分裝，凍藏于-80 ℃。

1.3.4 Western blot驗證HtpsC蛋白 純化的HtpsC蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)后，使用Western blot方法進(jìn)一步驗證。具體操作如下：將蛋白凝膠經(jīng)PBST緩沖液(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS，pH7.4)潤洗3 min。將PVDF膜放入甲醇中浸潤活化15 s，然后將蛋白凝膠與PVDF膜在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min。將蛋白凝膠緊貼PVDF膜后，裝入轉(zhuǎn)膜夾并放入轉(zhuǎn)印槽中，在冰浴條件下300 mA恒流轉(zhuǎn)膜120 min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜放于封閉液(含5%脫脂奶粉、0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS，pH7.4)中室溫封閉1 h。PBST洗滌3次后，加入鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體(1∶3 000稀釋)，室溫孵育1 h。再次用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶3 000稀釋)，室溫孵育1 h。使用PBST洗滌3次后，加HRP-DAB底物顯色液，避光反應(yīng)10 min，然后觀察顯色。

1.3.5 ELISA驗證HtpsC蛋白 以HtpsC蛋白作為抗原，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液按10 μg/mL、100 μL/孔4 ℃過夜包被，次日使用PBST洗滌3次。每孔加200 μL封閉液，37 ℃封閉1 h。PBST洗滌3次后每孔加100 μL稀釋200倍的感染豬鏈球菌的豬血清，用正常豬血清稀釋200倍做陰性對照，37 ℃孵育1 h。用PBST洗滌3次后，每孔加100 μL兔抗豬IgG(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗滌4次，每孔加100 μL TMB顯色液避光反應(yīng)10 min。每孔加2 mol/L硫酸100 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下測定OD值。

1.4 Anti-HtpsC多克隆抗體的制備

1.4.1 動物免疫 將2只新西蘭白兔(2～2.5 kg)編號A、B，飼養(yǎng)觀察3 d，耳緣采血2 mL作為陰性血清。以純化的HtpsC蛋白作為抗原，皮下免疫2只新西蘭白兔，初免劑量為300 μg/只，二免、三免、四免劑量為150 μg/只，2周免疫1次。免疫4次后采血，收集血清。

1.4.2 間接ELISA方法測定多抗血清效價 以HtpsC蛋白作為抗原，用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液按6 μg/mL、100 μL/孔4 ℃過夜包被，次日使用PBST洗滌3次。每孔加200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h。PBST洗滌3次后每孔加100 μL稀釋的兔血清(依次稀釋1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000倍)，用陰性血清稀釋1 000倍做陰性對照，37 ℃孵育1 h。用PBST洗滌3次后，每孔加100 μL山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗滌4次，每孔加100 μL TMB顯色液避光反應(yīng)10 min。每孔加2 mol/L硫酸100 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下測定OD值。

1.4.3 Western blot驗證Anti-HtpsC多克隆抗體 將收集的多抗血清通過親和層析純化得到Anti-HtpsC多克隆抗體，然后進(jìn)行抗原Western blot檢測。具體操作如下：取純化的HtpsC蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(HtpsC蛋白上樣量為20 ng)。然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，清洗后室溫封閉1 h。清洗3次后加入Anti-HtpsC多克隆抗體(1∶2 000)，室溫孵育1 h。清洗3次，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h。清洗3次后，加HRP-DAB底物顯色液，避光反應(yīng)10 min，然后觀察顯色。

1.5 Dot-ELISA檢測方法的建立 將S.suis接種于THB培養(yǎng)基中，160 r/min、37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。將NC膜裁剪成1×1 cm2大小的方格置于24孔板中。取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，吸棄上清，加1 mL無菌1×PBS緩沖液重懸，100 ℃煮沸10 min后作為抗原。向NC膜中央滴加2 μL抗原，37 ℃干燥15 min。加500 μL封閉液，37 ℃振蕩封閉2 h。然后用PBST振蕩洗滌3次，每次5 min。多克隆抗體使用封閉液進(jìn)行稀釋并加入到24孔板中，每孔200 μL，37 ℃振蕩孵育1 h。孵育結(jié)束后用PBST清洗3次。每孔加200 μL稀釋到工作濃度的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃振蕩孵育1 h。PBST清洗4次后，吸去多余水分，每孔加20 μL DAB顯色液，避光反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，蒸餾水清洗4次并吸干。膜上呈黃褐色斑點的即為陽性，反之為陰性。

1.6 Dot-ELISA 檢測方法條件的優(yōu)化

1.6.1 最佳Anti-HtpsC多抗使用濃度的確定 封閉結(jié)束后，將Anti-HtpsC按照1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600稀釋，按1.5操作流程進(jìn)行后續(xù)操作，根據(jù)顯色結(jié)果選擇最佳Anti-HtpsC多抗使用濃度。試驗重復(fù)3次。

1.6.2 最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定 在確定的最佳Anti-HtpsC多抗使用濃度下，將HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG以1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000進(jìn)行稀釋，按1.5操作流程進(jìn)行后續(xù)操作，根據(jù)顯色結(jié)果確定最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)。試驗重復(fù)3次。

1.7 靈敏度試驗 將S.suis稀釋至1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL，100 ℃煮沸10 min后作為抗原，以無菌1×PBS溶液做空白對照，分別滴加2 μL于NC膜中央。在確定的最佳方法上進(jìn)行后續(xù)操作，根據(jù)NC膜上是否出現(xiàn)明顯黃褐色斑點確定本方法的檢測限。試驗重復(fù)3次。

1.8 特異性試驗 使用大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌作為陰性對照。將9株S.suis(4株血清型為2型，血清型為1、4、7、9、14型各1株)同上述陰性對照菌株培養(yǎng)至1×106CFU/mL，煮沸后作為抗原。以無菌1×PBS溶液作為空白對照，分別滴加2 μL于NC膜中央。在確定的最佳方法上進(jìn)行后續(xù)操作，根據(jù)NC膜上是否出現(xiàn)明顯黃褐色斑點檢測本方法的特異性。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 HtpsC氨基酸序列比對 將HtpsC蛋白的氨基酸序列同Slr(GenBank: HQ908654.1)、Blr(GenBank: DQ242614.1)、InlA(GenBank: ABO32426.1)的氨基酸序列進(jìn)行比對。結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)HtpsC蛋白氨基酸序列與Slr和Blr的氨基酸序列相似性較高，分別為37.23%和37.07%；和InlA的相似性為 27.32%。

2.2 HtpsC蛋白的表達(dá)和純化 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌體經(jīng)超聲破碎后，上清和沉淀分別用10% SDS-PAGE電泳分析。在113 kDa附近可見明顯的HtpsC蛋白條帶，且重組蛋白主要以可溶性蛋白形式存在(圖2)。離心去除超聲破碎后的菌體沉淀，對上清進(jìn)行親和層析純化。經(jīng)300 mmol/L咪唑多次洗脫后，幾乎沒有雜蛋白的存在，蛋白純度大于90%。收集純度較高的HtpsC蛋白，然后透析至1×PBS中，分裝后凍存于-80 ℃冰箱。

2.3 HtpsC蛋白的Western blot/ELISA驗證 使用His標(biāo)簽抗體作為檢測抗體，對純化后的HtpsC蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖3所示：純化的HtpsC蛋白能夠被His標(biāo)簽抗體特異性識別。使用感染豬鏈球菌的豬血清以及正常豬血清對制備的HtpsC蛋白進(jìn)行ELISA驗證分析，感染豬鏈球菌的豬血清均大于正常豬血清OD450數(shù)值的2.1倍。綜上所述，通過原核表達(dá)及親和層析純化成功制備了HtpsC蛋白(表2)。

表2 ELISA 驗證HtpsC蛋白Tab.2 Identification of HtpsC protein by indirect ELISA

2.4 Anti-HtpsC效價檢測及Western blot分析 動物免疫試驗后收集多抗血清并使用間接ELISA法測定收集的血清中Anti-HtpsC的效價。4次免疫后，兩只試驗兔收集的多抗血清效價均大于1∶128 000。將多抗血清經(jīng)親和層析純化，分裝凍存于-80 ℃冰箱。使用HtpsC蛋白作為檢測抗原對Anti-HtpsC多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖4所示：制備的Anti-HtpsC多克隆抗體可特異性識別HtpsC蛋白(表3)。

2.5 最佳多抗工作濃度 Anti-HtpsC多抗工作濃度優(yōu)化結(jié)果如圖5所示，背景顏色干擾較小，且多抗稀釋小于400倍時(圖5A-D)斑點清晰。稀釋倍數(shù)大于400時斑點顏色變淡(圖5E-F)。因此選擇多抗的最佳稀釋倍數(shù)為1∶400，此時Anti-HtpsC多抗工作濃度為2.5 μg/mL。

2.6 最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù) 在確定的最佳多抗工作濃度條件下進(jìn)行酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化，結(jié)果如圖 6 所示：酶標(biāo)二抗稀釋1∶3 000時斑點仍然清晰可見(圖 6 C)。稀釋倍數(shù)大于1∶3 000后斑點顏色減淡。因此選擇最佳的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1∶3 000。

2.7 靈敏度、特異性試驗 靈敏度檢測結(jié)果如圖7所示：當(dāng)S.suis濃度大于1×107CFU/mL時，斑點清晰可見；當(dāng)濃度為1×106CFU/mL時，斑點顏色較淺；當(dāng)濃度小于1×105CFU/mL時，幾乎無斑點顯現(xiàn)。靈敏度試驗表明，該方法可檢測到的S.suis為1×106CFU/mL。特異性檢測結(jié)果如圖8所示：4株S.suis2(圖8A-D)以及血清型為1、4、7、14型的S.suis標(biāo)準(zhǔn)株，斑點清晰明顯，而S.suis9標(biāo)準(zhǔn)株因為不含有HtpsC蛋白基因[22]，所以未見明顯的黃褐色斑點(圖8H)。其它對照菌均沒有斑點出現(xiàn)，表明該方法的特異性較好。

3 討 論

在過去的幾十年里，免疫分析已經(jīng)成為實驗室中最普遍使用的檢測細(xì)菌或者病毒的免疫學(xué)檢測方法[27]。其中 Dot-ELISA 方法是一種可以在一次試驗中篩選大量樣本的同時，檢測抗原或者抗體的快速且簡便的試驗方法[28]。Attia 等[29]的研究表明，與間接ELISA方法相比，Dot-ELISA方法具有更高的敏感性和特異性。周俊明等[30]建立了針對S.suis2溶菌酶釋放蛋白抗體間接 ELISA 檢測方法。朱劍等[31]制備了S.suis2分泌核酸酶(SsnA)，并建立了間接 ELISA 檢測方法用于檢測血清中抗體。Xia等[32]以谷氨酸脫氫酶為診斷抗原建立了豬鏈球菌間接 Dot-PPA-ELISA 快速特異性檢測方法，與常規(guī)平板 ELISA 試劑盒進(jìn)行比較分析，該方法的的特異性和敏感性分別為 97.5% 和 96.6%。然而上述方法的檢測對象均為抗體，不能較早的檢測到S.suis感染。歐瑜等[33]利用S.suis2分離株 HA9801 毒力相關(guān)蛋白溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)構(gòu)建了 Dot-ELISA 方法和間接 ELISA 方法用于檢測豬鏈球菌，兩種方法的陽性率均為 61%，但沒有給出明確的檢測限。

由于資源有限，我們選擇了幾種主要致病血清型的S.suis(包括4株S.suis2型菌株以及血清型為1、4、7、9、14 型的S.suis標(biāo)準(zhǔn)株)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，該方法能檢出血清型為1、2、4、7、14型的S.suis，而不含有 HtpsC 蛋白基因的S.suis9型沒有被檢出。雖然我們沒有獲得所有血清型的豬鏈球菌用于驗證，但基于實驗結(jié)果，我們可以推測該方法可以適用于含有 HtpsC 蛋白基因的多種血清型S.suis的檢測，而不適用于一些不含有 HtpsC 蛋白基因的S.suis(包括血清型為9、12、20、29、32以及33型)的檢測。在不含HtpsC 蛋白基因的S.suis血清型中，僅血清型 9 型有致病性報道，因此在血清型 9 型比較流行的澳大利亞、德國以及北美洲地區(qū)[6]，該方法需要結(jié)合其它S.suis檢測方法一起使用。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，S.suis的 HtpsC 蛋白和鏈球菌屬中的化膿性鏈球菌 Slr、無乳鏈球菌 Blr 存在較高的相似性，因此我們選擇這兩種鏈球菌以及常見致病菌中的糞腸球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌作為對照菌株進(jìn)行特異性實驗。實驗結(jié)果表明，所建立的 Dot-ELISA方法具有良好的特異性，因此該方法可以滿足S.suis的初步檢測。

綜上所述，本研究利用原核表達(dá)制備了 HtpsC 蛋白，并制備了 Anti-HtpsC 多克隆抗體?；?Anti-HtpsC 多克隆抗體，我們建立了能夠直接檢測S.suis的 Dot-ELISA 檢測方法。在優(yōu)化的試驗方案下，背景清晰、斑點明顯。由于試驗條件的限制，沒有充足的臨床實際樣本，因此本方法的臨床應(yīng)用表現(xiàn)還有待檢驗。該方法可以通過直接觀察 NC 膜上是否有黃褐色斑點得到試驗結(jié)果，具有操作簡單、方便快捷等特點，適用于在基層、鄉(xiāng)鎮(zhèn)偏遠(yuǎn)地區(qū)開展S.suis的初步檢測。本方法檢測靈敏度可達(dá) 1×106CFU/mL，和化膿性鏈球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌無交叉反應(yīng)，特異性好。

利益沖突：無

引用本文格式：蔡旭燊,燕書豪,趙芷若，等. 豬鏈球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白多抗的制備及Dot-ELISA檢測方法的建立[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(8)：657-665. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.104