傷寒沙門菌非編碼RNA617的分子鑒定及其對(duì)生物膜形成的影響

靳夢(mèng)彤，李雪，黨娟娟，李澤宇，張盈，黃新祥

1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226006

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S. Typhi)是沙門菌屬中的一種重要的腸道致病菌，人是其天然宿主[1]。由傷寒沙門菌引起的傷寒熱，主要跡象為發(fā)熱、血培養(yǎng)或肥達(dá)反應(yīng)陽(yáng)性等。傷寒沙門菌可通過污染的食品或水經(jīng)口感染，抵御宿主免疫屏障在其體內(nèi)大量繁殖，且隨血流播散至實(shí)質(zhì)器官中，引發(fā)多種臨床癥狀[2]。S. Typhi 形成的細(xì)菌聚集膜樣物，即生物膜，可抵御宿主免疫的殺傷和外界環(huán)境的刺激，從而利于自身傳播及在體內(nèi)定植[3-4]。生物膜的主要成分包括細(xì)菌本身和其分泌的多糖基質(zhì)和多種蛋白，其形成過程受復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，包括雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)、全局調(diào)節(jié)因子、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[5-6]等。ncRNA指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，一般通過與靶RNA互補(bǔ)配對(duì)或者改變靶標(biāo)構(gòu)象的方式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7-8]。

本課題組前期通過RNA-Seq技術(shù)對(duì)生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)的S. Typhi進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)在2種狀態(tài)下差異表達(dá)的ncRNA[9]，其中ncRNA617在生物膜細(xì)菌中的表達(dá)豐度明顯高于浮游菌。鑒于此，本研究對(duì)ncRNA617進(jìn)行分子鑒定，以探究其在生物膜形成過程中發(fā)揮的作用, 為后續(xù)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒傷寒沙門菌野生菌株S. Typhi GIFU10007、大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)λ372、DH5α和自殺質(zhì)粒 pGMB151由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng)，重組質(zhì)粒pGMB151-F、ncRNA617過表達(dá)重組質(zhì)粒、ncRNA617缺陷菌株(Δ617)、回補(bǔ)菌株(Δ617-c617)和過表達(dá)菌株(007-p617)、野生對(duì)照菌株(007-pBAD33)和缺陷對(duì)照菌株(Δ617-pBAD33)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.2 試劑胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，氨芐西林購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，TRIZOL、氯仿均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，限制性核酸內(nèi)切酶Bam H I、T4 DNA連接酶、SMART RACE 5’/3’ Kit均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR熒光定量試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司，DIG Northern Starter Kit購(gòu)自瑞士Roche生物科技公司。

1.1.3 引物本研究所用引物信息如表1所示，引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。

表1 研究用引物Tab.1 List of primers

(續(xù)表1)

1.2 傷寒沙門菌ncRNA617的分子鑒定

1.2.1 RNA提取挑取細(xì)菌的單克隆在溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)培養(yǎng)基中于37 ℃和250 r/min進(jìn)行過夜培養(yǎng)，第2天將過夜培養(yǎng)物以1∶100比例稀釋繼續(xù)培養(yǎng)至吸光度A600值為0.4，4 ℃、4 000 r/min離心10 min后收集菌體，用TRIZOL法提取總RNA，具體方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 Northern blot實(shí)驗(yàn)依照已有方法[11]進(jìn)行，依據(jù)ncRNA617表達(dá)高峰區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性探針引物制備探針，檢查探針質(zhì)量后保存待用。在6%的(尿素)變性聚丙烯酰胺凝膠上分離RNA(30 μg)，經(jīng)電轉(zhuǎn)(300 mA，40 min)將凝膠上的RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用2×SSC(saline sodium citrate，SSC)緩沖溶液洗滌含有RNA的膜2次，洗去部分非特異性結(jié)合的探針，并在80 ℃下干燥2 h以固定RNA。隨后，將膜用焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水洗滌3遍，并將膜放入含ncRNA617特異性探針的雜交液中。雜交完成后經(jīng)過洗膜、孵育地高辛抗體，再用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光并拍照。

1.2.3 5’RACE使用SMART 5’RACE Kit進(jìn)行cDNA 5’末端快速擴(kuò)增反應(yīng)，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。為獲得第一鏈cDNA，在1 μg總RNA中加入基因特異性引物(gene-specific primers，GSP)和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA，以通用短引物和基因特異性引物為引物，以cDNA為模板進(jìn)行 5’RACE PCR反應(yīng)，獲取目的PCR產(chǎn)物。通過克隆將PCR產(chǎn)物插入基于pUC19載體改造的載體中。利用DNA測(cè)序確定ncRNA617的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

1.2.4 3’RT-PCR為探尋ncRNA617可能的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，在ncRNA617表達(dá)高峰區(qū)域設(shè)計(jì)前向引物3’PA，在ncRNA617的下游設(shè)計(jì)后向引物 3’PB1～3’PB5。以各個(gè)后向引物為特異性引物對(duì)S. Typhi總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再分別對(duì)前向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取適量產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

1.3 菌株構(gòu)建

1.3.1 ncRNA617缺陷菌株構(gòu)建依據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法構(gòu)建缺陷菌株(Δ617)，首先通過PCR從S. Typhi 野生菌株DNA中擴(kuò)增出ncRNA617上下游同源臂片段F1和F2，用重疊PCR獲得重組片段F。然后將含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I的重組片段F克隆到自殺質(zhì)粒pGMB151中。通過熱激法將重組質(zhì)粒pGMB151-F轉(zhuǎn)入大腸埃希菌λ372感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)蘇州泓訊生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒在電壓2.5 kV、電阻200～1 000 Ω條件下電轉(zhuǎn)入S. Typhi野生菌株感受態(tài)，經(jīng)5%蔗糖板傳代篩選和普通LB平板穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，最終獲得缺陷菌株(Δ617)。

1.3.2 ncRNA617回補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株構(gòu)建使用ncRNA617特異性引物PF/PR擴(kuò)增目的片段，將含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Xba I、Hind III的目的片段克隆至質(zhì)粒pBAD33，將重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含 34 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR驗(yàn)證，將疑似陽(yáng)性質(zhì)粒送至蘇州泓訊生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，陽(yáng)性重組質(zhì)粒在電壓2.5 kV、電阻200～1 000 Ω條件下電轉(zhuǎn)入缺陷菌株和野生菌株，經(jīng)質(zhì)粒pBAD33驗(yàn)證引物YZF/YZR篩選，構(gòu)建回補(bǔ)菌株(Δ617-c617)和過表達(dá)菌株(007-p617)。

1.3.3 野生對(duì)照菌株和ncRNA617缺陷對(duì)照菌株構(gòu)建將pBAD33空質(zhì)粒按照同樣的電轉(zhuǎn)條件電轉(zhuǎn)入野生菌株和缺陷菌株，經(jīng)質(zhì)粒pBAD33驗(yàn)證引物YZF/YZR篩選，構(gòu)建相應(yīng)的野生對(duì)照菌株(007-pBAD33)和缺陷對(duì)照菌株(Δ617-pBAD33)。

1.4 傷寒沙門菌ncRNA617對(duì)生物膜形成的影響

1.4.1 生物膜形成測(cè)定使用胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic-soytone-broth-medium，TSB)培養(yǎng)相關(guān)菌株至A600值為0.4，取200 μL菌液，接種于96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板，30 ℃靜置培養(yǎng)96 h，進(jìn)行生物膜形成量檢測(cè)[10]，培養(yǎng)結(jié)束后吸棄孔內(nèi)菌液，用無(wú)菌磷酸緩沖液輕柔吹洗孔內(nèi)3次，經(jīng)甲醇固定后將培養(yǎng)板真空干燥20 min，加入 200 μL 結(jié)晶紫溶液后染色15 min，最后用蒸餾水清洗孔內(nèi)3次，扣干水分后將板置于干燥箱內(nèi)干燥20 min，加入 200 μL 30%乙酸溶液溶解孔內(nèi)壁上的生物膜，采用酶標(biāo)儀于A570波長(zhǎng)測(cè)定對(duì)應(yīng)孔內(nèi)吸光度，測(cè)定值的高低代表細(xì)菌形成生物膜能力的大小。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR傷寒沙門菌生物膜的成分較多[14-15]，包括鞭毛、菌毛、纖維素等。此次研究選定生物膜形成通路中與鞭毛、菌毛、胞外多糖、纖維素等相關(guān)的11個(gè)基因(見表2)，采用qPCR分析相關(guān)基因的mRNA水平。TRIZOL法提取細(xì)菌總RNA，用4×gDNA Wiper消化除去基因組DNA，取2.5 μg RNA用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，這些cDNA分別作為內(nèi)參基因5s和生物膜形成相關(guān)基因的cDNA模板，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 生物膜形成相關(guān)基因Tab.2 Biofilm formation-related genes

1.4.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)將ncRNA617和差異基因mRNA序列信息提交至IntaRNA系統(tǒng)，進(jìn)行ncRNA617與差異基因的相互作用區(qū)域分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用GraphPad Prism8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傷寒沙門菌ncRNA617的分子鑒定

在生物膜及浮游狀態(tài)下，由S. Typhi野生株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可知，在mig-14和t2681(假定基因)基因間區(qū)存在一段高峰表達(dá)區(qū)，該序列在生物膜S.Typhi 細(xì)菌中的表達(dá)豐度明顯高于浮游S.Typhi 細(xì)菌。用對(duì)應(yīng)特異性探針進(jìn)行Northern blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1條特異性雜交帶，與RNA Marker對(duì)照得知其長(zhǎng)度約300 nt(見圖1A)。5’RACE PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泳道S有擴(kuò)增出片段(見圖1B)，泳道U和G為陰性對(duì)照，均無(wú)條帶，通過克隆將PCR產(chǎn)物插入pUC19載體改造的載體中，通過比對(duì)DNA測(cè)序與S.Typhi基因組序列信息(見圖1C)，結(jié)果提示該ncRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于mig-14終止密碼子下游967 nt處。3’RT-PCR結(jié)果表明，片段長(zhǎng)度為270 bp有陽(yáng)性擴(kuò)增，但長(zhǎng)為452 bp、651 bp、887 bp、1123 bp的擴(kuò)增為陰性(見圖1D)。結(jié)合S.Typhi基因組的結(jié)構(gòu)分析，提示該ncRNA轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)位于t2681基因起始密碼子上游 2 378～2 560 nt。綜合Northern blot、5’RACE實(shí)驗(yàn)和3’RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可知ncRNA617長(zhǎng)度在270～452 nt，從而繪制其基因結(jié)構(gòu)位置圖(見圖1E)。

A. ncRNA617 was detected by Northern blot analysis using a specific DIG-labeled probe (M: Marker). B. 5’ RACE PCR product of ncRNA617 (S: sample; U: UPM only; G: GSP only;M: Marker). C. Blast analysis of the sequence. D. 3’ RT-PCR of the ncRNA617(1,4,7,10,13：Sample ；2,5,8,11,14：Blank control；3,6,9,12,15：Positive control; M: Marker). E. Genomic location and structure of ncRNA617.

2.2 ncRNA617缺陷菌株的構(gòu)建

以S.Typhi野生株DNA為模板，分別進(jìn)行PCR以獲取目的片段上下游同源臂片段F1(272 bp)和F2(459 bp)，如圖2A所示，用重疊PCR獲得重組片段F(731 bp)(見圖2B)，將重組片段F插入自殺質(zhì)粒pGMB151的Bam H I位點(diǎn)，通過測(cè)序篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)插入自殺質(zhì)粒pGMB151的Bam H I位點(diǎn)的片段無(wú)突變?nèi)笔?，并且與已知片段序列的信息一致性達(dá)100%(見圖2C)。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGMB151-F電轉(zhuǎn)導(dǎo)入S.Typhi野生株，經(jīng)5%蔗糖板傳代培養(yǎng)篩選和普通LB平板穩(wěn)定傳代培養(yǎng)獲得Δ617菌株(見圖2D)。

A. Electropherograms of homology arms F1 and F2 (M: Marker). B. Electropherogram of total homologous fragment F (M: Marker). C. Sequence alignment. D. PCR identification of clones(-：Negative control; +：Positive control; B：Blank control; 1-8：PCR identification results of mutant strains; M: Marker).

2.3 ncRNA617回補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以傷寒沙門菌野生菌株基因組DNA為模板，用引物PF/PR進(jìn)行PCR，獲得ncRNA617回補(bǔ)片段，該片段長(zhǎng)270 bp(見圖3A)。將ncRNA617回補(bǔ)片段克隆至質(zhì)粒pBAD33，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切雙重驗(yàn)證，以重組質(zhì)粒為模板，引物PA/PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到270 bp的目的帶，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切也產(chǎn)生相同的目的帶(見圖3B)。將質(zhì)粒送至蘇州鴻訊生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果與正確序列，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒中插入的序列完全正確(見圖3C)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。提取重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至ncRNA617缺陷菌株和野生菌株中，分別挑取6個(gè)單克隆用引物pBAD33YZ F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。12個(gè)單克隆均擴(kuò)增出525 bp的條帶(見圖3D)，表明ncRNA617回補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

A. Amplification of complemented fragment (M: Marker). B. Validation by PCR and enzyme-cutting (1: PCR product using recombinant plasmid as template; 2: Enzyme digestion product of recombinant plasmid; 3: Positive control; 4: Blank control; M: DL500 DNA Marker). C. Blast analysis of the sequencing result of the recombinant vector. D.PCR verification of complemented strain and overexpression strain(-：Negative control；+：Positive control；B：Blank control；1-6：PCR identification results of complemented strains; 7-12：PCR identification results of overexpression strains；M: Marker).

2.4 野生對(duì)照菌株和ncRNA617缺陷對(duì)照菌株的構(gòu)建

提取空質(zhì)粒pBAD33分別電轉(zhuǎn)至野生菌株和缺陷菌株中，分別挑取3個(gè)單克隆用引物pBAD33YZ F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，6個(gè)單克隆菌落均擴(kuò)增出255 bp的條帶(見圖4)，代表野生對(duì)照菌株和ncRNA617缺陷對(duì)照菌株構(gòu)建成功。

+: Positive control; B: Blank control; 1-6: PCR products of monoclonal colonies; M: DL2000 DNA Marker.

2.5 ncRNA617可削弱傷寒沙門菌的生物膜形成能力

培養(yǎng)野生對(duì)照菌株(007-pBAD33)、ncRNA617缺陷對(duì)照菌株(Δ617-pBAD33)和ncRNA617回補(bǔ)菌株(Δ617-c617)，進(jìn)行生物膜形成檢測(cè)(見圖5A、5C)，菌株Δ617-pBAD33的生物膜形成較于菌株007-pBAD33和Δ617-c617明顯增強(qiáng)，且菌株Δ617-c617的生物膜形成能力恢復(fù)至菌株007-pBAD33的水平，表明ncRNA617缺失可使S. Typhi野生株的生物膜形成能力增強(qiáng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證ncRNA617發(fā)揮的作用，培養(yǎng)野生對(duì)照菌株(007-pBAD33)和ncRNA617過表達(dá)菌株(007-p617)進(jìn)行生物膜形成實(shí)驗(yàn)(見圖5B、5D)，菌株007-p617生物膜形成能力較菌株007-pBAD33有明顯減弱，表明ncRNA617可削弱傷寒沙門菌生物膜的形成能力。

A, B：Crystal violet staining of biofilms. C, D：Columnar statistical analysis of the biofilm biomasses (**P<0.01, *P<0.05).

2.6 ncRNA617下調(diào)生物膜相關(guān)基因的表達(dá)水平

qPCR分析生物膜相關(guān)基因的mRNA水平(見圖6)，與野生對(duì)照菌株相比，ncRNA617缺陷對(duì)照菌株中csgD、fimA、flhD、fljB、bapA、yihP的mRNA的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明ncRNA617可能是通過下調(diào)這些生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控傷寒沙門菌的生物膜形成能力。

**P<0.01, *P<0.05。

2.7 ncRNA617與相關(guān)基因mRNA的相互作用區(qū)域

經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，ncRNA617與受調(diào)控的生物膜相關(guān)基因的mRNA均有不同位置片段的結(jié)合區(qū)域(見圖7)，其中ncRNA617與csgDmRNA、fimAmRNA和yihPmRNA有多個(gè)不連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，而與flhDmRNA、fljBmRNA 和bapAmRNA 存在連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對(duì)。

圖7 ncRNA617與相關(guān)基因mRNA的相互作用Fig.7 Interaction between ncRNA617 and related gene mRNA

3 討論

生物膜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成屬于動(dòng)態(tài)進(jìn)程，其中非編碼RNA發(fā)揮著重要作用[16]。非編碼RNA是一種只在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄而不翻譯的RNA，幾乎所有細(xì)菌體內(nèi)都含有ncRNA，其在某些特定環(huán)境中可被激活并參與調(diào)控細(xì)菌基因的表達(dá)[17-18]。它們通常與靶mRNA進(jìn)行堿基配對(duì)或者直接結(jié)合蛋白，從而在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯水平發(fā)揮作用[19-20]。本研究前期通過RNA-Seq技術(shù)獲得了生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)的S. Typhi轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并對(duì)其中的ncRNA617進(jìn)行了分子鑒定，探究其在生物膜形成過程中發(fā)揮的作用，為后續(xù)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

目前，RNA-Seq是發(fā)掘ncRNA的主要技術(shù)，許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均可驗(yàn)證及檢測(cè)ncRNA的表達(dá)，比如RT-PCR、Northern blot、微陣列雜交等方法，但是通常情況下Northern blot的特異性較高，而且該方法可檢測(cè)出目的片段的大小以及是否有剪切體存在，所以從特定角度來(lái)看Northern blot是檢測(cè)RNA水平的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。本研究中，Northern blot結(jié)果提示傷寒沙門菌中確有ncRNA617的表達(dá)，長(zhǎng)度約300 nt。為了探究ncRNA617的全長(zhǎng)序列，本研究采用5’RACE和3’RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析ncRNA617的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ncRNA617起始位點(diǎn)位于mig-14終止密碼子下游967 nt處，終止位點(diǎn)位于t2681起始密碼子上游 2 378～2 560 nt處。綜合Northern blot、5’RACE和3’RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可知ncRNA617的分子全長(zhǎng)約270～452 nt。

為探究ncRNA617在生物膜形成過程中發(fā)揮的作用，本研究構(gòu)建了野生對(duì)照菌株、ncRNA617缺陷對(duì)照菌株、回補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株，通過生物膜形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ncRNA617可削弱傷寒沙門菌生物膜的形成能力。隨后，通過qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ncRNA617的缺失可使得菌毛相關(guān)基因csgD、fimA，鞭毛相關(guān)基因flhD、fljB，表面蛋白bapA，胞外多糖相關(guān)基因yihP的mRNA水平均有不同程度的上調(diào)，這提示ncRNA617可能是通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和基質(zhì)合成進(jìn)而負(fù)調(diào)控生物膜的形成。

csgD是負(fù)責(zé)編碼生物膜中央調(diào)控因子CsgD的基因，其在細(xì)菌穩(wěn)態(tài)期細(xì)胞中表達(dá)水平會(huì)升高，不僅能促進(jìn)curli菌毛和纖維素的生成[22]，而且其轉(zhuǎn)錄過程會(huì)受諸多非編碼RNA的調(diào)控，比如McaS、RprA等已知非編碼RNA[23]。本研究的qPCR結(jié)果提示，ncRNA617可負(fù)調(diào)控csgDmRNA的水平，同時(shí)推測(cè)fimAmRNA水平的上調(diào)可能是由ncRNA617缺陷后引起的csgDmRNA水平上升導(dǎo)致，但也不排除fimA是由ncRNA617直接調(diào)控。細(xì)菌的鞭毛組成較為復(fù)雜且鞭毛基因的表達(dá)呈級(jí)聯(lián)調(diào)控方式，但這種級(jí)聯(lián)調(diào)控并非絕對(duì)，因?yàn)檫@些基因的表達(dá)除受自身調(diào)控因子的影響外，還受外界環(huán)境變化的調(diào)控[24]。flhD位于flhDC操縱子，其編碼產(chǎn)物是鞭毛基因的主要調(diào)節(jié)子FlhDC，F(xiàn)lhDC負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)二級(jí)基因啟動(dòng)子的活性。fliA屬于二級(jí)鞭毛基因，可調(diào)控三級(jí)鞭毛基因的表達(dá)。fljB編碼的鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛的關(guān)鍵組成部分，用于鞭毛絲的形成[25]。本研究的qPCR結(jié)果提示，ncRNA617缺失后flhD和fljB的mRNA的水平升高，說(shuō)明ncRNA617可能通過抑制細(xì)菌鞭毛的形成進(jìn)而負(fù)調(diào)控生物膜的形成。bapA的序列在沙門菌中高度保守，其負(fù)責(zé)編碼BapA蛋白，該蛋白不僅與纖維素和菌毛一起構(gòu)成生物膜，還改善宿主外細(xì)菌的增殖，并增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)消毒劑和干燥劑的抵抗力[15]。本研究的qPCR結(jié)果提示，ncRNA617缺失后bapAmRNA水平升高，說(shuō)明ncRNA617可影響bapA的轉(zhuǎn)錄水平，但是否影響其翻譯水平有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)可能受ncRNA617調(diào)控的生物膜基質(zhì)的相關(guān)基因進(jìn)行了初步探索，但是ncRNA617對(duì)相關(guān)基因mRNA的影響機(jī)制目前還不明確。由于ncRNA與靶標(biāo)主要通過形成互補(bǔ)配對(duì)來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用，為了明確這種相互作用機(jī)制，本研究采用IntaRNA這一生物信息學(xué)工具對(duì)非編碼RNA和靶基因的mRNA結(jié)合進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ncRNA617與csgD、fimA、flhD、fljB、bapA、yihP的mRNA均有不同位置和不同長(zhǎng)度的結(jié)合。其中，ncRNA617與csgD、fimA和yihP的mRNA有不連續(xù)的堿基配對(duì)，這點(diǎn)符合反式編碼RNA的作用特點(diǎn)。但ncRNA617下調(diào)這些基因的mRNA水平是否由互補(bǔ)配對(duì)而引起有待深入研究。

綜上所述，本研究對(duì)新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA ncRNA617進(jìn)行了分子鑒定，其起始位點(diǎn)位于mig-14 終止密碼子下游967 nt處，終止位點(diǎn)位于t2681起始密碼子上游 2 378～2 560 nt處，全長(zhǎng)約270～452 nt。ncRNA617可能通過靶向結(jié)合生物膜形成相關(guān)基因序列從而下調(diào)基因表達(dá)，負(fù)向調(diào)控傷寒沙門菌生物膜的生成，但該調(diào)控作用的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。