腦膜炎敗血伊麗莎白菌耐藥性的研究進展

巫祺樂，方子璇，袁舒穎，陳妍雯，陳力，孫桂芹

1. 浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術與信息工程學院，浙江 杭州 310053； 2. 復旦大學上海醫(yī)學院基礎醫(yī)學院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningosepticum，EM)，又稱腦膜炎膿毒性黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum，CM或Flavobacteriummeningosepticum，F(xiàn)M)，2005年Kim等[1]將EM從黃桿菌屬重新劃分至伊麗莎白菌屬，并將其正式更名為EM。該菌是非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，無鞭毛、莢膜，其生化特征主要表現(xiàn)為過氧化氫酶、氧化酶和吲哚陽性[2]。EM廣泛存在于自然界中，多見于土壤、水源以及醫(yī)院環(huán)境[3]，是引起院內(nèi)侵入性感染的重要病原體[4]。近年來，EM院內(nèi)感染呈上升趨勢[5]，在全球范圍散發(fā)[6-8]。有研究表明，EM呈多重耐藥，且不同地區(qū)分離得到的EM耐藥性存在差異[9-11]。因此，加強EM耐藥性的檢測并分析其耐藥機制，對選擇臨床用藥和預防耐藥菌株出現(xiàn)具有重要意義。本研究收集整理國內(nèi)外關于EM耐藥性的報道，就其耐藥現(xiàn)狀和耐藥機制作綜述。

1 EM的耐藥現(xiàn)狀

EM對大多數(shù)抗菌藥物具有天然抵抗力，給臨床治療帶來極大困難。該菌對用于治療革蘭陰性菌感染的抗菌藥物，如β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等具有較高耐藥率，且不同地區(qū)分離得到的EM存在耐藥性差異(見表1)。

本研究收集中國北京、上海、浙江以及美國、法國、印度等地區(qū)關于EM耐藥性的報道，根據(jù)抗菌藥物分類，對其耐藥性數(shù)據(jù)進行整理，結果詳見表1。大部分地區(qū)分離的EM對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率達到或接近100%；對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物哌拉西林/他唑巴坦敏感率為70%左右，但少數(shù)地區(qū)如中國臺州[20-22]、美國[30]分離的EM對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物哌拉西林/他唑巴坦耐藥。大部分地區(qū)分離的EM對氟喹諾酮類藥物較為敏感，耐藥率在20%左右，而中國的北京[9]、寧波[17]、臺州[20-22]、湖南[26]以及韓國等地區(qū)[11]的耐藥率則超過50%。

替加環(huán)素是一種新型的四環(huán)素類抗菌藥物，可與細菌核糖體30S亞單位結合，阻止肽鏈延長[28]。根據(jù)表1的統(tǒng)計結果，EM的臨床分離株對替加環(huán)素有較好的敏感性，敏感率約為60%，但中國湖南[26]、沙特阿拉伯[29]等地區(qū)已出現(xiàn)對替加環(huán)素耐藥的EM菌株，耐藥率在70%以上。另外，多黏菌素被認為是革蘭陰性菌治療的最后一道防線，主要作用于細菌細胞膜，使胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏，從而起到抗菌作用[30]，然而各個地區(qū)EM對多黏菌素的耐藥率為100%(見表1)。

2 EM耐藥機制

不同地區(qū)分離的EM具有不同的耐藥性，存在多種耐藥機制，如藥物滅活酶的產(chǎn)生、藥物作用靶位基因的改變、生物膜的形成、外排系統(tǒng)過表達等。本研究收集了已報道的EM耐藥基因情況，并進行分析，結果如表2所示。

2.1 產(chǎn)生藥物滅活酶

2.1.1 產(chǎn)生藥物水解酶β-內(nèi)酰胺類藥物是臨床常用的抗生素，根據(jù)氨基酸序列，可將β-內(nèi)酰胺酶分為A、B、C和D 4類[54]。目前研究表明，EM可以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)，為A類β-內(nèi)酰胺酶，主要介導EM對頭孢菌素、青霉素類藥物的抗性[35, 39]。另外，EM還能產(chǎn)B類β-內(nèi)酰胺酶，又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)，主要介導EM對碳青霉烯類藥物耐藥[39]。

EM產(chǎn)生的ESBLs主要有CME(Chryseo～bacteriummeningosepticumESBLs)和TLA-1。有報道發(fā)現(xiàn)，EM產(chǎn)生的CME(CME-1、CME-2)可以介導耐藥[34-35]。另外，Chen等[31]通過全基因組測序檢測到EM中含有編碼A類β-內(nèi)酰胺酶的tla-1。有研究表明，TLA-1的水解能力與CME-1相當，對頭孢他啶、頭孢噻肟有良好的水解活性[36]。

EM產(chǎn)MBL有BlaB和GOB兩種型別。blaB和blaGOB耐藥基因位于染色體上，無法跨物種傳播，且前者活性高于后者[39]，二者可在EM中同時存在。如上海的部分EM菌株不僅同時含有blaB和blaGOB，還含有cme[13]，而安徽部分EM只含blaB[25]，杭州部分EM只含blaGOB[37](見表2)。另有研究表明，EM產(chǎn)生的BlaB還能夠水解β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，包括他唑巴坦等[31, 55]。

表2 不同國家/地區(qū)已報道的EM耐藥相關基因統(tǒng)計Tab.2 Statistics of resistance-related genes of Elizabeth meningitidis reported in different countries/regions

2.1.2 產(chǎn)生藥物修飾酶產(chǎn)生藥物修飾酶是EM對氨基糖苷類藥物耐藥的重要原因，這些修飾酶可以使氨基糖苷類藥物的一些結構被修飾、滅活，或者抑制與其他類藥物的協(xié)同作用[56]。Chen等[31]報道，EM含編碼乙?；D(zhuǎn)移酶(aminoglycoside acetyltransferases，AACs)的相關基因aac(6′)-Iaj，可以編碼乙?；D(zhuǎn)移酶，乙?；龖c大霉素以外的氨基糖苷類藥物[42]，從而降低藥物的活性。EM中還檢測到了編碼核苷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside nucleotidyltranferases，ANTs)的ant(6)基因，介導EM對鏈霉素耐藥[43]。

2.1.3 產(chǎn)生其他酶類產(chǎn)生二氫葉酸合成酶(Sul)和二氫葉酸還原酶(Dfr)可能導致EM對磺胺類藥物如復方新諾明的耐藥[44-45]。有研究報道，對復方新諾明耐藥的EM中，可以檢測到合成上述2種酶的基因sul1、sul2，且在sul2陽性的菌株中，檢測到一株含有編碼二氫葉酸還原酶基因(dfrA12)的EM[44]，而其余對復方新諾明敏感的分離株中未檢測到上述基因。

2.2 藥物作用靶位的改變

氟喹諾酮類藥物是治療EM感染的候選藥物[10, 31]，然而北京[9]、臺州[20-22]、湖南[26]等地已出現(xiàn)耐藥菌株(見表1)。Jian等[46]研究報道，EM中DNA促旋酶的GyrA亞基末端，常發(fā)生Ser83Ile取代，從而介導其對氟喹諾酮類藥物耐藥。除發(fā)生Ser83Ile突變外，發(fā)生Ser83Arg突變也會提高EM對氟喹諾酮類抗生素的耐藥率[13]。除此之外，Jian等[46]認為，gyrB、parC、parE保守區(qū)域的突變也可能引起EM對氟喹諾酮類藥物耐藥。

2.3 主動外排機制

細菌對抗菌藥物的外排機制是造成耐藥的重要原因之一[57]。研究報道，EM的外排泵主要包括RND家族(resistance nodulation division family)、MFS家族(major facilitator super family)、MATE家族(multidrug and toxic compound extrusion)和ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette)[58-60]。

Kukutla等[58]通過比較伊麗莎白菌屬基因組序列，發(fā)現(xiàn)伊麗莎白按蚊中37個編碼RND轉(zhuǎn)運蛋白的基因與EM有83.5%的同一性，以及44個編碼MFS超家族的基因與EM有73.7%的同一性，可以非特異性排出β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類藥物。Chen等[31]在2015年—2016年美國密歇根州暴發(fā)EM感染的病人身上分離得到3株菌株，并從中檢測出18個編碼耐多藥外排泵的基因，包括ceoB，msrB，adeG等。

Agrawal等[49]、Liang等[59]在EM中檢測出耐多藥外排泵相關蛋白。Liang等[59]在標準菌株(ATCC 13253)中同時檢測到MATE家族蛋白、ABC轉(zhuǎn)運蛋白(CmeB蛋白)以及RND家族蛋白(AcrB蛋白)。Agrawal等[49]通過蛋白質(zhì)組學相關研究發(fā)現(xiàn)，EM中含有ABC轉(zhuǎn)運蛋白以及TetR/AcrR家族(TetR/AcrR family)，賦予EM對四環(huán)素和其他有毒化合物的抗性(見表2)。

2.4 外膜蛋白的改變

外膜蛋白(outer memberain protein，OMP)是革蘭陰性細菌運輸抗生素的重要通道[61]。Agrawal等[49]在EM中檢出OmpA和OmpW。OmpA是細菌中高度保守的一種β桶型孔蛋白，有報道稱該蛋白在鮑曼不動桿菌中可以與內(nèi)膜外排泵系統(tǒng)耦合(如MFS超家族、RND家族)，將抗生素從質(zhì)膜排出[50]。OmpW也是一種β桶型孔蛋白，在阪崎腸桿菌中，OmpW的表達可導致硫酸新霉素、氨芐西林耐藥[51]。

3 討論與展望

自20世紀50年代腦膜炎敗血伊麗莎白菌引發(fā)腦膜炎被首次報道以來[1]，中國、美國、英國、法國、印度等國家都有由該菌引起的新生兒腦膜炎、菌血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎等疾病的報道，EM已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一[4]。因EM呈多重耐藥，給臨床治療特別是藥物選擇帶來一定困難，故受到醫(yī)務人員的重視。

EM對臨床常用于治療革蘭陰性菌的抗菌藥物天然耐藥，如碳青霉烯類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類，耐藥率幾乎達100%；多黏菌素作為治療革蘭陰性菌的最后一道防線[30]，EM對其耐藥率也達100%(見表1)。因此，臨床用藥時應盡量避免使用上述藥物。而大部分地區(qū)EM對氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物、替加環(huán)素等藥物有較好的敏感性，可將其作為臨床治療EM感染的候選藥物。目前已有研究報道，使用氟喹諾酮類藥物可提高感染EM患者的生存率[62]；且通過替加環(huán)素與左氧氟沙星聯(lián)合用藥，能夠成功治療EM引起的敗血癥[63]。但值得注意的是，目前EM被檢出含耐氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物、替加環(huán)素等藥物的基因。因此，在臨床治療用藥時，應根據(jù)實驗室藥敏結果，選擇適當?shù)目股?，同時可考慮聯(lián)合用藥。

EM的多重耐藥，與其具有多種耐藥基因相關，從而具有多種耐藥機制。目前，國內(nèi)外對EM耐藥機制的研究主要集中于EM能產(chǎn)生MBL和ESBLs(主要為CME型)，且不同地區(qū)分離的EM所含有的基因型不同[13, 25, 37]，而關于EM其他耐藥機制的研究尚待進一步深入。有學者發(fā)現(xiàn)，EM能同時含有編碼MBL和ESBLs的基因[13]，也能僅含blaB或blaGOB中的一種[25, 37]。Chang等[41]提出，EM應同時具有blaB和blaGOB，若將僅含其中一種基因的菌種也鑒定為EM，則可能會將黃桿菌屬的細菌誤判為EM，這也表明EM的快速鑒定有待改進。

EM的快速準確鑒定和菌株溯源對其預防和控制具有重要意義。但由于數(shù)據(jù)庫尚未建立，伊麗莎白菌屬中其他菌種容易被誤認為EM[64]，因此須推動高通量測序、質(zhì)譜技術在臨床感染性疾病中的應用，從而加強EM與其他伊麗莎白菌屬的精準鑒別，以提高EM的臨床檢出率。