循環(huán)腫瘤細(xì)胞聯(lián)合增強(qiáng)CT對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估的臨床意義

李雯 李楊 朱保玉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 鄭州 450052

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)有著較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅患者健康和生命的兩大原因?yàn)樵缙趶?fù)發(fā)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。目前，雖然OSCC的手術(shù)治療效果有了較大提升，但仍有20%～40%的患者術(shù)后有局部復(fù)發(fā)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。所以，早期發(fā)現(xiàn)OSCC患者有無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)手術(shù)方案的制定至關(guān)重要，亦是提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。OSCC患者術(shù)前評(píng)估方法包括頜面部增強(qiáng)CT檢查，MRI，胸部X線和CT檢查等[3]。單獨(dú)使用某種方法的敏感性和特異性不足以檢測(cè)OSCC是否有早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，使患者失去最佳治療時(shí)機(jī)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)作為一種液體活檢新技術(shù)，在腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估方面顯示出巨大的潛力[4]。澳大利亞墨爾本醫(yī)院的Thomas Ashworth醫(yī)生[5]于1869年提出，癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移和(或)復(fù)發(fā)的患者血液中可發(fā)現(xiàn)CTC，其性質(zhì)與原始腫瘤細(xì)胞相似。近期的研究表明，一些預(yù)后不佳的患者其CTC檢測(cè)數(shù)值明顯增高[6-7]。目前CTC對(duì)許多腫瘤的早期篩查及臨床診治具有重要指導(dǎo)意義，但對(duì)OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估是否具有指導(dǎo)意義，仍缺乏相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2020-01—2021-07在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科治療的76例OSCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)前增強(qiáng)CT評(píng)估符合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，即最大淋巴結(jié)短徑≥10 mm。(2)所有患者均行口腔腫瘤根治術(shù)和頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，且病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。(3)既往健康狀況良好，未進(jìn)行系統(tǒng)化療、放療和免疫支持治療。(4)愿意參與研究并簽訂合同，經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)號(hào)：2019-KY-305)。

1.2CT檢查設(shè)備與方法采用Aquilion 16 CT (Toshiba，日本)進(jìn)行掃描。參數(shù)：層距5～10 mm、層厚5～10 mm、電流250～280 mA、電壓120～140 kV。增強(qiáng)CT采用碘克沙醇(江蘇恒瑞)作為對(duì)比劑，1 mL/kg、流速3 mL/s，經(jīng)肘靜脈注射。影像資料均由1名放射科住院醫(yī)師描述與判斷，另有1名高級(jí)醫(yī)師負(fù)責(zé)質(zhì)控。記錄頸部淋巴結(jié)最大短徑，以淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm作為判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3CTC分析患者入院后抽取肘靜脈血5 mL置于含有EDTA的抗凝管中，保存于4℃條件下，實(shí)驗(yàn)于24 h內(nèi)完成。CTC分析所需要的試劑盒購(gòu)自格諾生物科技(上海)有限公司。試驗(yàn)包括：負(fù)向富集及靶向 PCR 檢測(cè)技術(shù)。將紅細(xì)胞裂解液加入3 mL靜脈血樣中進(jìn)行孵育，待紅細(xì)胞裂解后離心，加入 CD45+磁珠結(jié)合白細(xì)胞，用磁場(chǎng)捕獲并去除白細(xì)胞。剩余富含CTC的細(xì)胞群，加入特異性探針(針對(duì)表達(dá)葉酸受體α的細(xì)胞設(shè)計(jì)，由靶向葉酸受體的葉酸單元與共價(jià)偶聯(lián)的寡核苷酸單元組成)標(biāo)記CTC。離心，去除上清液游離探針，加入洗脫劑，洗脫與 CTC特異性結(jié)合的探針，制備待測(cè)樣品。加入PCR擴(kuò)增試劑后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增(PCR 擴(kuò)增模板的寡核苷酸單元序列為：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTT CTAA-3′)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，計(jì)算出3 mL血樣中CTC的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)用于組間數(shù)據(jù)比較；ROC曲線分析后，計(jì)算曲線下面積、相應(yīng)的特異度、準(zhǔn)確率、敏感度和尤登指數(shù)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床資料76例患者中，男47例(61.84%)、女29例(38.16%)。術(shù)前增強(qiáng)CT診斷有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的假陽(yáng)性率占59.21%(45/76)，卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明，性別(P=0.003)和術(shù)前CTC(P=0.002)是OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素。見(jiàn)表1。

表1 OSCC患者臨床特征的相關(guān)性分析(n=76)

2.2ROC曲線分析經(jīng)ROC曲線分析顯示，性別作為診斷術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的曲線下面積為0.668；將CTC≥10.05作為診斷術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的最佳標(biāo)準(zhǔn)，曲線下面積為0.702，特異度為46.67%，敏感度為87.10%，準(zhǔn)確率為63.16%，尤登指數(shù)為0.34。見(jiàn)圖1。

圖1 術(shù)前CTC檢測(cè)和性別ROC曲線

2.3CTC對(duì)OSCC患者術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評(píng)估以CTC≥10.05為分界，將CTC分為2組?？ǚ綑z驗(yàn)的結(jié)果表明：術(shù)前CTC水平(P=0.002)是OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)獨(dú)立因素。其比值比(odds ratio, OR)為5.906，95%可信區(qū)間為(1.775，19.655)。對(duì)于臨床判斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者，術(shù)前CTC數(shù)值高者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是CTC數(shù)值低者的5.906倍，以CTC進(jìn)一步篩查術(shù)前增強(qiáng)CT提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的假陽(yáng)性率下降至31.58%(24/76)(見(jiàn)圖2)。由此可見(jiàn)，CTC結(jié)合增強(qiáng)CT可為臨床醫(yī)生制定手術(shù)方案提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。

患者A，術(shù)前CTC值升高(13.5)，淋巴結(jié)約10.45 mm，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；患者B，術(shù)前CTC值正常(7.6)，淋巴結(jié)約13.23 mm，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移。圖2 患者增強(qiáng)CT圖像

3 討論

OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受多種因素影響，其潛在的發(fā)病機(jī)制尚不清晰。OSCC具有高度的局部侵襲性，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者占所有OSCC患者死因的90%左右[8]。關(guān)于處理OSCC患者頸部淋巴結(jié)方案，一部分學(xué)者建議單純進(jìn)行原發(fā)灶擴(kuò)大切除術(shù)，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后進(jìn)行淋巴結(jié)清掃術(shù)，這種方案顯著降低了患者的生存率；另一部分學(xué)者則建議行原發(fā)灶擴(kuò)大切除術(shù)聯(lián)合頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，這種方案的治愈率高，但由于擴(kuò)大了手術(shù)范圍，給患者造成了外觀損毀和早期部分功能喪失，而影響了患者生活質(zhì)量[9]。目前，評(píng)估口腔鱗癌在術(shù)前是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的手段較多，例如增強(qiáng)CT、PET、MRI及超聲。增強(qiáng)CT價(jià)格較PET-CT低廉，在頭頸部腫瘤中較MRI更能清晰顯示頜骨有無(wú)腫瘤侵犯，還可通過(guò)觀察圖像中淋巴結(jié)的大小、數(shù)目、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和密度、邊緣及其與周?chē)M織的關(guān)系進(jìn)行判斷。臨床上影像科常用的判斷有無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要標(biāo)準(zhǔn)為：(1)淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm。(2)增強(qiáng)掃描顯示中心低密度，外周不規(guī)則強(qiáng)化。(3)淋巴引流區(qū)發(fā)現(xiàn)≥3個(gè)相鄰的淋巴結(jié)。(4)淋巴結(jié)邊緣不規(guī)則或不規(guī)則強(qiáng)化、模糊、周?chē)鹃g隙消失。由于腫瘤轉(zhuǎn)移，炎癥或者組織增生均可導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大，僅僅基于增強(qiáng)CT判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確率較低[10]。因此，如何通過(guò)無(wú)創(chuàng)性方法有效評(píng)估患者是否有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)移，一直是臨床研究的重點(diǎn)。

CTC從腫瘤原發(fā)部位脫落，進(jìn)入血液系統(tǒng)或淋巴管系統(tǒng)，大量CTC聚集后形成有高度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞團(tuán)，再次從血管或淋巴管中溢出，到達(dá)特定器官發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這表示CTC具有高侵襲性、逃避機(jī)體免疫殺傷等特點(diǎn)，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CTC作為液體活檢的代表，可提供大量腫瘤的相關(guān)信息，有效反映腫瘤異質(zhì)性的特點(diǎn)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展。由于液體活檢的創(chuàng)傷較小、操作簡(jiǎn)單、樣本較容易獲取，且CTC的檢測(cè)僅需采集受檢者的外周血，因此CTC檢測(cè)可用于癌癥的早期篩查[11]。目前，CTC的檢測(cè)方式主要包括ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù))、Cell Search System、CTC芯片技術(shù)等。本研究中使用的技術(shù)相對(duì)新穎，葉酸受體陽(yáng)性CTC通過(guò)免疫磁珠法負(fù)向富集，隨后由配體-靶向PCR定量檢測(cè)CTC。CTC在胰腺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腺癌已被用于術(shù)前臨床評(píng)估和術(shù)后預(yù)后分析，但對(duì)口腔的研究較少[12-15]。Grisanti等[16]研究了53例OSCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者，發(fā)現(xiàn)CTC高的患者預(yù)后較差；另一個(gè)現(xiàn)象是CTC的數(shù)量與OSCC的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間存在顯著關(guān)聯(lián)。這證實(shí)OSCC的復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是通過(guò)血液循環(huán)和再循環(huán)實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)CTC可作為OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，ROC曲線分析顯示：以CTC≥10.05作為判斷OSCC術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于術(shù)前淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm的患者，術(shù)前血清CTC升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加，對(duì)OSCC患者術(shù)前判斷和評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要意義。本研究中，術(shù)前增強(qiáng)CT診斷的臨床淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者59.21%(45/76)為假陽(yáng)性，結(jié)合術(shù)前血清CTC檢測(cè)后，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移假陽(yáng)性率下降至31.58%(24/76)；對(duì)于臨床影像學(xué)判斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者，術(shù)前CTC數(shù)值高者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是CTC數(shù)值低者的5.906倍。表明增強(qiáng)CT結(jié)合術(shù)前CTC檢測(cè)可有效降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估的假陽(yáng)性率。但需要更大樣本量的分析予以證實(shí)。

綜上所述，術(shù)前評(píng)估增強(qiáng)CT發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)最大短徑≥10 mm的OSCC患者，術(shù)前血清CTC水平是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。術(shù)前進(jìn)行血清CTC檢測(cè)可以降低增強(qiáng)CT對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估的假陽(yáng)性率，從而幫助臨床醫(yī)生制定手術(shù)方案及治療策略。