普通小麥苗期莖基腐病抗性QTL 定位

郭燦，程敦公，齊軍山，劉曉晗，劉海琛，劉秀坤，陳志偉，單寶雪，肖彥軍，張玉梅，趙振東，李法計，李豪圣

(1. 青島農業(yè)大學農學院，山東 青島 266109；2. 山東省農業(yè)科學院作物研究所，山東 濟南 250100；3. 山東省農業(yè)科學院植物保護研究所，山東 濟南 250100；4. 魯東大學農學院，山東 煙臺 264025；5. 山西農業(yè)大學農學院，山西 太古 030801)

小麥莖基腐病(Fusarium crown rot，F(xiàn)CR)是由多種鐮刀菌侵染引起的世界性小麥病害，以假禾谷鐮刀菌(Fusarium pseudograminearum)侵染為主[1，2]。 小麥幼苗被鐮刀菌侵染后，莖基部葉鞘和莖稈變褐，嚴重時引起幼苗發(fā)黃、枯萎；灌漿期發(fā)病可導致穗子干枯，以致籽粒秕瘦[3，4]。 近年來在我國小麥主產省份，河南省每年約有10%的小麥受FCR 影響，部分地區(qū)產量損失達50%[5，6]；河北省小麥由FCR 引起的白穗率為20% ～50%[7]；山東省農業(yè)農村廳統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全省小麥FCR 發(fā)病面積達80 萬公頃以上，部分地塊白穗率達30%～50%。 因此，F(xiàn)CR 已成為影響我國小麥生產的主要病害之一。

近年來，國內外學者從抗病基因發(fā)掘和種質資源鑒定等方面開展了一系列研究。 在抗病基因發(fā)掘方面，于1A、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4B、5B、5D、6A、6B 和6D 等染色體上定位到超過60 個FCR 相關QTL 或顯著性位點[3，8-22]。 Ma 等[12]在3BL 染色體上檢測到一個FCR 主效QTL，可以解釋49%的表型變異；Zheng 等[23]通過構建次生分離群體，將前期定位到的主效QTLQcrs.cpi-3B精細定位到0.7 cM(1.5 Mb)區(qū)間內。 在抗病資源鑒定方面，通過苗期和成株期接種鑒定，檢測到西農979、豫麥18、石優(yōu)17 等約30 個具有較強FCR抗性的品種[21，24，25]。 但是，已發(fā)掘的主效抗病基因少且分子標記缺乏、可用于育種的抗源匱乏仍是當前抗病育種工作面臨的主要問題。

為繼續(xù)發(fā)掘FCR 抗病位點，本研究以藁城8901/周麥16 構建的重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體為材料，結合構建的高密度遺傳連鎖圖譜，對苗期莖基腐病抗性QTL 進行定位，以期為發(fā)掘抗病基因和聚合育種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以藁城8901/周麥16 構建的重組自交系群體(176，F(xiàn)2∶6RILs)為研究材料。 其中，藁城8901 是河北省藁城市農業(yè)科學研究所育成的優(yōu)質強筋小麥品種，周麥16 是河南省周口市農業(yè)科學研究所育成的矮稈小麥品種。 前期觀察發(fā)現(xiàn)，藁城8901 的FCR 抗性優(yōu)于周麥16。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌擴繁、接種和幼苗培養(yǎng) 將假禾谷鐮刀菌接種到PDA 培養(yǎng)基上，待長滿整個平板，接入滅菌的麥粒培養(yǎng)基中于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周左右，定時搖晃，確保病原菌均勻分布在麥粒表面。 長滿后備用。

培養(yǎng)前，將麥粒培養(yǎng)基擴繁的病原菌和無菌土以3∶100 的質量比例混勻，轉入培養(yǎng)盆(7 cm×7 cm×7 cm)中，每盆播種8 粒種子，每個家系播種3 盆，放置溫室內進行培養(yǎng)。 根據(jù)培養(yǎng)盆內土壤濕度定期澆水，試驗期間不施用任何肥料。 白天溫度控制在25℃左右，夜間溫度控制在20℃左右，連續(xù)培養(yǎng)30 天后調查。 分別于2020年12月和2021年5月、8月在山東省農業(yè)科學院作物研究所溫室內進行3 次試驗(T1、T1 和T3)。

1.2.2 病情分級標準及病情指數(shù)計算 每個家系調查15 株幼苗，參照楊云等[26]的試驗方法對發(fā)病度進行分級，并計算病情指數(shù)。 分級標準為0 級:植株未發(fā)??；1 級:地下莖明顯變褐或第1 葉鞘出現(xiàn)輕微癥狀；3 級:第1 葉鞘明顯變褐，但未變黑；5 級:第1 葉鞘變黑或第2 葉鞘變褐；7 級:第3 葉鞘出現(xiàn)變褐癥狀，或植株因發(fā)病而發(fā)育遲緩或接近死亡；9 級:植株因病死亡。 病情指數(shù)計算公式為:

根據(jù)病情指數(shù)，將苗期抗病性分為5 類:免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、感病(S)和高感(HS)，相應病情指數(shù)分別為0、0.01 ～10.00、10.01 ～20.00、20.01～30.00 和＞30.00。

1.2.3 基因型檢測和遺傳連鎖圖譜構建 于苗期進行取樣，提取藁城8901/周麥16 RIL 群體和親本基因組DNA，在北京博奧晶典生物技術有限公司(http:/ /cn.capitalbio.com/)進行小麥90K SNP 基因芯片檢測，檢測完畢后對標記質量進行篩選。

RIL 群體遺傳連鎖圖譜構建參照文獻[27]。具體步驟如下:第一，利用IciMapping v4.2 軟件的BIN 功能將相互之間沒有交換的標記分到同一組內，并挑選缺失率最低的標記作為該組的骨架標記；第二，采用JoinMap 4.0 軟件的Grouping 功能對骨架標記進行分群；第三，利用MapDisto 1.7 軟件的AutoMap 功能對骨架標記進行排序，并計算遺傳距離；最后，結合中國春小麥基因組數(shù)據(jù)(IWGSC RefSeq v1.0，https:/ /urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/blast.php)確定每個連鎖群所在的染色體。

1.2.4 QTL 分析 利用骨架標記和苗期FCR 病情指數(shù)，采用IciMapping v4.2 的完備區(qū)間作圖法(ICIM)進行QTL 分析。 在P＝0.01 水平下，所有位點2000 次排列檢驗預測LOD 閾值介于2.0 ～2.5 之間，因此，為保證結果準確性，本研究選擇2.5 作為LOD 閾值用于鑒定顯著QTL。 不同試驗中置信區(qū)間有重疊的視作同一QTL，參考中國春小麥基因組物理圖譜對本研究定位到的QTL 與已報道QTL 進行比較(IWGSC RefSeq v1.0，https:/ /urgi. versailles. inra. fr/blast _ iwgsc/blast.php)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SAS進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 病情指數(shù)方差分析及表型分析

方差分析結果(表1)顯示，藁城8901/周麥16 RIL 群體苗期FCR 病情指數(shù)在基因型和試驗間均在0.01 水平差異顯著。 因此，可用于抗病性遺傳分析。

表1 小麥苗期莖基腐病病情指數(shù)方差分析

表型分析結果(表2)表明，在3 次試驗中，周麥16 苗期FCR 病情指數(shù)均高于藁城8901，周麥16 表現(xiàn)為高感，藁城8901 表現(xiàn)為感病。 RIL 群體苗期FCR 病情指數(shù)均表現(xiàn)為超親分離，抗性范圍為中抗到高感。

表2 小麥苗期莖基腐病病情指數(shù)表型分析

2.2 遺傳連鎖圖譜

在RIL 群體中，共有11979 個高質量多態(tài)性SNP 標記。 選取3242 個骨架標記構建遺傳連鎖圖譜，標記被分到34 個連鎖群中，連鎖圖譜總長度為3130.3 cM(表3)。 其中，B 染色體組骨架標記數(shù)目最多，遺傳連鎖圖長度最長，標記在染色體上的平均密度也最大；D 染色體組骨架標記數(shù)目最少，遺傳連鎖圖長度最短，標記的密度也最小。標記在染色體上的平均密度為1.04 個標記/cM。

表3 藁城8901/周麥16 RIL 群體遺傳連鎖圖譜信息

2.3 QTL 定位

對3 次試驗及平均值進行QTL 分析，分別檢測到3、4、3、4 個QTL，分布在1D(2)、3B(2)、4A(2)、5B(2)、5D、6A(4)和7B 染色體上，解釋表型變異的4.42%～11.37%(表4，圖1)。

圖1 藁城8901/周麥16 RIL 群體苗期莖基腐病抗性QTL 位置圖

表4 苗期莖基腐病抗性QTL

4 個QTL 在兩次試驗中均被檢測到。QFCR-S.saas-1DL同時在T3 和均值中檢測到，分別解釋表型變異的7.06%和5.62%；QFCR-S.saas-4AS同時在T1 和均值中檢測到，分別解釋表型變異的6.71%和6.84%；QFCR-S.saas-6AS-1同時在T2和T3 中檢測到，分別解釋表型變異的4.60%和9.42%；QFCR-S.saas-6AS-2同時在T2 和均值中檢測到，分別解釋表型變異的5.60%和7.73%。位于7BL 染色體上的QFCR-S.saas-7BL解釋的表型變異最高，達11.37%。

3 討論與結論

近年來，隨著秸稈還田的實施，土壤中病原菌積累量逐年增加，由此引起的小麥FCR 已逐漸成為黃淮麥區(qū)和北部冬麥區(qū)主要病害之一，影響遍及河北、山東、山西、河南、安徽、江蘇等省份，造成的糧食損失逐年增加[5-7]。 化學防治不僅耗費巨大，而且對環(huán)境安全造成嚴重影響，不利于農業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展，而培育抗病品種是應對FCR 危害最經(jīng)濟有效的措施。 抗病品種的培育不僅需要抗性穩(wěn)定的抗源用于配制雜交組合，還需要明確的抗病機理指導材料選擇。 由于我國小麥FCR 研究起步較晚，尚未發(fā)掘到主效抗病基因并廣泛應用，抗病品種和種質發(fā)掘數(shù)目也極少，難以滿足育種應用。 因此，繼續(xù)發(fā)掘抗病基因和優(yōu)異種質，不僅有利于抗病遺傳機制解析，還可為聚合育種提供可用材料。

小麥FCR 抗性由多基因控制，前人研究將抗病基因定位在小麥絕大多數(shù)染色體上，其中3B和4B 染色體QTL 數(shù)目最多，分別有9 個和10個[8-22]。 本研究檢測到的14 個苗期FCR 抗病QTL 中，有4 個在兩次試驗中穩(wěn)定存在。 其中，3B 染色體上的QFCR-S.saas-3B-1與Pariyar等[19]通過關聯(lián)分析檢測到的顯著性標記CAP12_rep_c3868_270 物理位置相距約1 Mb，可能為同一位點。 1DL 染色體上檢測到的QFCR-S.saas-1DL，與Collard[9]、Bovill[11]、Martin[17]、周淼平[18]等在該染色體上檢測到的QTL 位置不一致；此外，6A 染色體上兩個穩(wěn)定存在的QTL 位置也與Yang[21]、Rahman[22]等報道的位點不一致，還需做進一步研究。

江蘇太湖地區(qū)農業(yè)科學研究所以高感赤霉病的小麥品種阿夫與中感赤霉病品種臺灣小麥雜交，于20 世紀70年代初育成赤霉病抗性超親的高抗品種蘇麥3 號[28]。 本研究中，用感和高感FCR 創(chuàng)建的RIL 群體中，部分家系FCR 抗性水平達到中抗，說明基因重組、累加、互作，嚴格選擇和鑒定雜種后代，有可能育成超親抗病新品種。 程順和等[29]認為避開豐產性差的抗源的應用，重視豐產性好、不高感赤霉病的親本間配組，把抗赤霉病育種作為大面積豐產育種的一部分，并提出用中感到中抗的豐產親本材料進行配組取代赤霉病抗性好但豐產性很差的親本，在后代鑒定篩選時，針對豐產性的同時進行赤霉病抗性選擇，以解決豐產與赤霉病抗性之間的矛盾。 在今后小麥抗FCR 育種中也應兼顧抗性和豐產性。