果蔗根腐病病原菌分離鑒定及生物學(xué)特性分析

任慶肖，張金旭，王繼華，徐世強(qiáng)，姚偉，張木清

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東 廣州 510640)

甘蔗(Saccharum officinarum)廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重要的糖料作物，也是最好的可再生生物質(zhì)能源作物之一[1]。 果蔗(chewing cane)是一種可鮮食的水果型甘蔗，其口感清甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們的青睞[2]，是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于廣東、廣西、浙江、福建和云南等地區(qū)，主栽品種為“拔地拉”(Badila)，其種植面積占果蔗總面積的70%[3]。 近年來(lái)，廣東蔗區(qū)根腐病連年加重，造成大面積減產(chǎn)，嚴(yán)重打擊農(nóng)戶的果蔗種植積極性，對(duì)果蔗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

甘蔗根腐病是一種發(fā)生在甘蔗根部的土傳性病害，在果蔗上尤為嚴(yán)重。 2018年本實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了由Fusarium commune(共享鐮刀菌)引起的甘蔗根腐病，通過(guò)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)患病果蔗生長(zhǎng)初期田間表現(xiàn)植株矮小，發(fā)根力弱，根系逐漸變褐、變軟和腐爛，葉片因根系吸收水分、養(yǎng)分能力下降而出現(xiàn)卷曲、發(fā)黃甚至枯萎，嚴(yán)重時(shí)植株死亡；即使部分幼苗仍能繼續(xù)帶病生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)后期植株纖細(xì)，莖基部和根部的縱切面呈現(xiàn)黑褐色[4]。 而健康植株表現(xiàn)為地上部生長(zhǎng)良好，根系發(fā)達(dá)且附著土壤的能力強(qiáng)(圖1)。 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根腐病對(duì)甘蔗產(chǎn)量影響巨大，發(fā)病地塊平均減產(chǎn)30%～50%，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。 因此，初步認(rèn)為果蔗根腐病是一種新興的較為嚴(yán)重的病害，該病害貫穿于果蔗整個(gè)生長(zhǎng)期，果蔗生長(zhǎng)初期(2 ～3 個(gè)月)最易感染根腐病，應(yīng)加以重視并及時(shí)防治。

圖1 果蔗根腐病患病與健康植株及其根系的田間表型

本研究對(duì)廣東省廣州市果蔗區(qū)根腐病田間發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查并采集發(fā)病樣品分離病原菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定并測(cè)定其致病性，初步分析其生物學(xué)特性，以期為果蔗病害防治和病原菌研究提供理論依據(jù)，保障果蔗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為具有典型根腐病癥狀的果蔗植株樣品，2019年12月采集于廣東省廣州市番禺區(qū)果蔗種植基地，采集后立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 病原菌的分離與純化

采用傳統(tǒng)組織分離法進(jìn)行病原菌的分離，具體方法為:首先將患病植株根系洗凈瀝干水分，置于超凈工作臺(tái)上，用滅菌手術(shù)刀在患病根部的病健交界處切取5 mm 的根段，75%乙醇消毒30 s，后移至無(wú)菌水中洗滌3 次，最后用滅菌濾紙吸干多余水分，接種于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基(含鏈霉素、噻孢霉素)中央，28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2 ～3 d。 不斷對(duì)菌落進(jìn)行純化，直至菌落整齊一致沒(méi)有雜菌出現(xiàn)，獲得分離菌株，用于后續(xù)鑒定。

1.3 形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 用打孔器沿分離菌株的菌落邊緣打取6 mm 菌餅接種在PDA 平板上，28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地以及氣生菌絲的生長(zhǎng)狀況等培養(yǎng)性狀。 配制土壤瓊脂培養(yǎng)基以觀察厚垣孢子[5]。 培養(yǎng)數(shù)天后，挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡以及掃描電子顯微鏡下觀察分離菌株的顯微形態(tài)特征，并在顯微鏡下拍照，按照Skovgaard 等[2]的方法對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 DNA 提取:將分離菌株接種在PDW(馬鈴薯葡萄糖水)培養(yǎng)基上，28℃搖床培養(yǎng)3 d 后，用四層滅菌紗布過(guò)濾，收集200 mg新鮮菌體，用全自動(dòng)樣品快速研磨儀進(jìn)行預(yù)冷研磨，采用SDS 裂解法提取病原菌基因組DNA。 提取的DNA 置于-20℃冰箱中暫時(shí)保存。

PCR 擴(kuò)增:采用真菌ITS 序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、鐮刀菌特異性引物EF1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF2(5′-GGAAGTACCAGTSATCATGTT-3′)[7]對(duì)病原菌基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和檢測(cè)。

序列比對(duì):登錄NCBI 網(wǎng)站(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通過(guò)BLAST 功能將測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)分析，初步確定分離菌株的種屬。

系統(tǒng)發(fā)育分析:從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已知種名的近源菌TEF1-α基因序列，利用MEGA-7 軟件進(jìn)行ClustalW 多序列比對(duì)后，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建基于TEF1-α序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行Bootstrap重復(fù)分析1000 次，從而確定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.4 致病性測(cè)定

將果蔗莖用多菌靈消毒后，25℃(保持濕潤(rùn))催芽7 d 長(zhǎng)出健康根系，作為后續(xù)待處理植株。用打孔器沿分離菌株菌落邊緣打取菌餅接種在PDA 平板上，28℃黑暗培養(yǎng)5～7 d，用挑針輕輕刮下菌落，8 層紗布過(guò)濾菌絲得到孢子懸浮液，用無(wú)菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)至1.0×106cfu/mL。 室溫條件下，將10 mL/株的分生孢子懸浮液均勻接種在果蔗植株的根圍，以接種10 mL/株無(wú)菌水作為對(duì)照處理，每處理重復(fù)3 次。 處理后1～20 d 連續(xù)觀察植株根系的發(fā)病情況，出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀后，對(duì)病原菌進(jìn)行再分離和柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.5 生物學(xué)特性研究

將分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用打孔器沿其菌落邊緣打取6 mm 菌餅，分別接種在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)、LA(LB 肉湯瓊脂)、CDA(察氏瓊脂)、MEA(麥芽浸膏瓊脂)、SDA(沙氏葡萄糖瓊脂)、SAM(改良沙氏瓊脂)6 種培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)，每處理重復(fù)3 次，每隔24 h 采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)7 d 后，在培養(yǎng)皿中加10 mL 無(wú)菌水，制備孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定每個(gè)處理下的孢子產(chǎn)量。

將6 mm 菌餅接種在PDA 培養(yǎng)基上，分別置于16、20、24、28、32℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理重復(fù)3 次，每隔24 h 采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。 培養(yǎng)7 d 后，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定不同溫度處理下的孢子產(chǎn)量。

用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH，配制不同pH 值(pH＝3～11)的PDA 培養(yǎng)基，將6 mm 菌餅接種在培養(yǎng)基上，置于28℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理重復(fù)3 次，每隔24 h 采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)7 d 后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定不同pH 值處理下的孢子產(chǎn)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

本試驗(yàn)共分離27 株菌，其中6 株與Fusariumcommune(共享鐮刀菌)[6]形態(tài)特征相似(編號(hào)為F.C6、F.C15、F.C16、F.C25、F.C27、gx4-46)，主要形態(tài)特征如下。

在PDA 培養(yǎng)基上菌落顏色為白色，菌絲緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，氣生菌絲較少且為絨毛狀，培養(yǎng)數(shù)天后，菌落不變色，培養(yǎng)基背面逐漸變?yōu)榈S色。 小分生孢子較多，呈卵圓形，大小為(3.11 ～13.09)μm×(1.69 ～3.86) μm；大分生孢子較少，呈長(zhǎng)卵形微彎或月牙形兩端微尖，隔膜最多為3 個(gè)，大小為(11.05 ～33.21)μm×(3.03 ～5.65)μm。 掃描電鏡下的分生孢子形態(tài)為扁船形或腹側(cè)內(nèi)卷狀。 光學(xué)顯微鏡下觀察的分生孢子梗多為粗短的簡(jiǎn)單瓶梗，偶爾出現(xiàn)較為細(xì)長(zhǎng)的單瓶梗。 厚垣孢子為球形，直徑(5.49～10.95)μm。 由于分離菌株可以產(chǎn)生長(zhǎng)度超過(guò)25 μm 的細(xì)長(zhǎng)單瓶梗，符合Skovgaard等[6]對(duì)F. commune區(qū)別于尖孢鐮刀菌的形態(tài)特征描述，因此初步鑒定為F. commune(圖2)。

圖2 分離菌株gx4-46 的顯微形態(tài)特征

2.2 分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌株的TEF1-α基因序列與GenBank 中F. commune( GenBank 登 錄 號(hào):MT947795.1)的相應(yīng)片段相似度均達(dá)到99%以上，E-value 值為0。

利用MEGA-7 軟件將分離菌株和已知種名的鐮刀菌菌株的基因序列(表1)進(jìn)行聚類分析，選取F.solani(登錄號(hào):DQ247544.1)作為外群，采用NJ 法構(gòu)建基于TEF1-α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。 結(jié)果顯示供試菌株與F. commune處于同一分支，分支置信度為98%(圖3)。 因此將該6 株分離菌鑒定為F. commune。

圖3 基于TEF1-α 基因序列采用鄰接法構(gòu)建的分離菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的菌株及其GenBank 登錄號(hào)

2.3 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果(圖4)顯示，接種分離菌株后果蔗根系均有一定程度的發(fā)病，表現(xiàn)為植株矮小，生長(zhǎng)緩慢，主根逐漸變?yōu)樯詈稚橛胁煌潭鹊母癄€，新生根的數(shù)量減少，和田間發(fā)病情況相似。 不同菌株對(duì)果蔗根系的致病力不同，接種gx4-46 菌株后根系的發(fā)病率高達(dá)79.96%，顯著高于其他菌株，F(xiàn).C16、F.C27、F.C25、F.C15、F.C6的發(fā)病率分別為25. 13%、20. 09%、17. 86%、16.50%、12.77%(圖5)。

圖4 致病性測(cè)定結(jié)果

圖5 接種不同菌株的果蔗根系發(fā)病率

2.4 生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 gx4-46 菌株在不同培養(yǎng)基上表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)特性(圖6)。在LA 培養(yǎng)基中氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑平均生長(zhǎng)速率為1.47 cm/d，之后依次為CDA 培養(yǎng)基、MEA 培養(yǎng)基、SDA 培養(yǎng)基、SAM 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基。 在CDA 培養(yǎng)基上菌絲緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，菌絲紋路清晰，但氣生菌絲體較少。菌株在LA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，顯著高于其他處理。 可見(jiàn)LA 培養(yǎng)基為該菌株的最適培養(yǎng)基。

圖6 培養(yǎng)基對(duì)gx4-46 菌絲生長(zhǎng)速率和孢子產(chǎn)量的影響

2.4.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖7 可知，在16～32℃范圍內(nèi)果蔗根腐病病原菌均能生長(zhǎng)。 當(dāng)溫度為24℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑平均生長(zhǎng)速率為1.13 cm/d，生長(zhǎng)7 d 天后的孢子產(chǎn)量為6.07×106個(gè)/mL，均顯著高于其他培養(yǎng)溫度。 因此，24℃為最適合該菌株菌絲生長(zhǎng)的溫度。

圖7 培養(yǎng)溫度對(duì)gx4-46 菌絲生長(zhǎng)速率和孢子產(chǎn)量的影響

2.4.3 pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 果蔗根腐病病原菌對(duì)酸堿度的適應(yīng)范圍廣泛，在pH 值為3 ～11 范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)。 pH ＝7 時(shí)最適合病原菌的生長(zhǎng)，菌落直徑平均生長(zhǎng)速率為1.39 cm/d。 在pH 值為3～11 范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，pH＝11 時(shí)產(chǎn)孢量最大，pH 為3～4 時(shí)幾乎不產(chǎn)孢(圖8)。

圖8 pH 值對(duì)gx4-46 菌絲生長(zhǎng)速率和孢子產(chǎn)量的影響

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從果蔗根腐病根系樣品中分離到的27 株分離物中，有6 株被鑒定為Fusarium commune，分離頻率為22.22%。 致病性測(cè)定結(jié)果表明，供試菌株間存在一定的致病性差異，與前人的研究結(jié)果相同[5，8]。 果蔗根系接種gx4-46 菌株后發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)79.96%，因此，選取該菌株進(jìn)行進(jìn)一步生物學(xué)特性分析。 結(jié)果表明，LA 培養(yǎng)基為病原菌的最適培養(yǎng)基；24℃為該菌株菌絲生長(zhǎng)的最適溫度，這與曾莉莎等[9]對(duì)荷花腐敗病菌以及張河慶等[10]對(duì)豇豆根腐病病原菌的菌絲最適生長(zhǎng)溫度的研究結(jié)果相似；pH ＝7 最適合該菌株的生長(zhǎng)。

已知為害甘蔗根部的主要病原菌有Pythium arrhenomanes(強(qiáng)雄腐霉)、Pachymetra chaunorhiza、Macrophomina phaseolina(殼球孢菌)、Xylaria arbuscula(木生炭角菌)等[11-15]。 2018年本實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了由F. commune引起的甘蔗根腐病[4]，F(xiàn). commune作為尖孢鐮刀菌的姐妹種[6]，是一種具有廣泛寄主范圍和地理分布的植物致腐病菌，能引起道格拉斯冷杉[16]、美國(guó)森林苗圃[17]、水 稻[5]、大 豆[18]、煙 草[19]、豇 豆[10]、番茄[20]和軟棗獼猴桃[21]等多種作物的根腐病。 在水量豐富的地區(qū)或者水生植物上，該菌更容易生存繁殖。 如近年來(lái)報(bào)道的較為嚴(yán)重的荷花腐敗病以及荸薺枯萎病均由該菌引起[22，23]。 福建省煙草種植區(qū)普遍采用煙草與水稻輪作的種植方式，根腐病病原菌可能廣泛存在于水田中[19]。 百合枯萎病在5、6月份潮濕多雨季節(jié)發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)到30%[24]；此外，由該菌引起的水稻枯萎病與根腐病近年來(lái)也被首次報(bào)道[5]。 果蔗種植地區(qū)水量豐富，壟旁的水渠長(zhǎng)期處于滿水狀態(tài)，農(nóng)戶常施大水大肥，這也可能為病原菌的生存繁殖提供了有利條件。 因此，對(duì)于F. commune如何在水中或水量豐富地區(qū)繁殖以及侵染水生植物或水量豐富地區(qū)作物的致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)病原菌的鑒定及生物學(xué)特性的研究，確定F. commune為果蔗根腐病的致病菌，為病害防治和病原菌的研究提供了理論依據(jù)。 目前對(duì)于該病原菌侵染果蔗的流程、致病機(jī)理以及病原菌與寄主互作的機(jī)制還尚不明確。 后期需進(jìn)一步探究高效的化學(xué)防治方法以及時(shí)應(yīng)對(duì)果蔗根腐病的流行與發(fā)生，以期為病害的防治及高抗品種選育與栽培提供指導(dǎo)。