懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌、根際微生物群落分布及其化感物質(zhì)的比較分析

夏瑾華劉彩艷劉佳儀劉金玲劉樂彭雅婷尹明華

(1. 上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2. 上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；3. 上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心，江西 上饒 334001；4. 上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點實驗室，江西 上饒 334001)

三葉青為葡萄科崖爬藤屬多年生蔓生藤本植物，學(xué)名三葉崖爬藤，俗名金線吊葫蘆、蛇附子、石抱子、石猴子、石老鼠等，主要分布于浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西等省(自治區(qū))，為我國特有珍稀藥用植物[1]。 三葉青毒副作用小，是西藥無法代替的天然“植物抗生素”，一般以塊根或全草入藥，可抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、保肝[2]。 在臨床上，三葉青還可用來治療各類炎癥，如病毒性腦膜炎、乙型腦炎、病毒性肺炎、黃疸性肝炎等[3]；三葉青塊根對小兒高燒和癌癥也有顯著療效，對各類腫瘤如肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、宮頸癌等具有抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用[4]。

研究表明，植物根系和根際微生物之間的相互作用對于植物的生長和品質(zhì)形成至關(guān)重要[5]。植物根系通過分泌酚酸等化感物質(zhì)差異性地調(diào)節(jié)根際土壤微生物群落，促進(jìn)致病菌的增殖同時使有益菌衰減[6]。 三葉青在石質(zhì)土壤和非石質(zhì)土壤中種植兩年，發(fā)現(xiàn)兩種土壤的細(xì)菌群落顯著不同，且與三葉青塊根尺寸相關(guān)。 與非石質(zhì)土壤中的微生物群相比，石質(zhì)土壤具有更大的細(xì)菌多樣性、共生網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性，以及更多的Actinobacteria(放線菌門)、Rokubacteria(己科河菌門)、Rhizobiales(根瘤菌)、Desulfarculaceae(脫硫藻科)和Chthonobacteriae(紅細(xì)菌)細(xì)菌類群。 此外，塊莖表層土壤中細(xì)菌類群的潛在功能與宿主的基因調(diào)控途徑密切相關(guān)，如植物激素生物合成、光合作用和生物脅迫抗性，對塊莖的起始和發(fā)育至關(guān)重要[7]。 周武等[8]從三葉青塊根的氯仿抽提物中分離出4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、對羥基苯甲酸及十六烯酸甲酯和十八烯酸乙酯的混合物，生物活性測定表明三葉青塊根的主要化感物質(zhì)為4-羥基-3-甲氧基苯甲酸和對羥基苯甲酸。 還有研究表明，內(nèi)生菌可通過物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換與宿主相互作用進(jìn)而影響藥用植物內(nèi)環(huán)境氧化還原狀態(tài)、酸堿度等特性，促進(jìn)氨基酸、核酸、碳水化合物等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)換與儲存，加快宿主藥用植物對養(yǎng)分的吸收及代謝，從而提高中藥材品質(zhì)[9]。 王蕾臻[10]從三葉青塊根中分離獲得了多個內(nèi)生菌，其中內(nèi)生真菌TH15 可顯著促進(jìn)三葉青塊根的生長和發(fā)育。 目前關(guān)于三葉青栽培種之間塊根內(nèi)生菌、根際微生物群落分布及其化感物質(zhì)的比較分析未見報道。 本試驗以懷玉山三葉青兩個栽培種‘懷玉1 號’和‘懷玉2 號’為研究對象，利用Illumina 高通量測序和LC-MS 技術(shù)分析其根際微生物和塊根內(nèi)生菌的群落分布和化感物質(zhì)的差異，整體把握兩者根際微生物和塊根內(nèi)生菌資源狀況，尋找可以提高懷玉山三葉青有效成分含量的根際微生物和塊根內(nèi)生菌資源，對提高懷玉山三葉青藥材品質(zhì)和緩解化感自毒作用具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷玉山三葉青兩個栽培種懷玉1 號和懷玉2號大棚高地栽培的3年生塊根。

1.2 試驗方法

1.2.1 兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的測序 DNA 提取:兩個栽培種塊根和根際土壤均各取100 g，3 次重復(fù)。 采用PowerSoilTMDNA Isolation Kit 試劑盒提取DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

PCR 擴(kuò)增:使用正向引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′) 和 反 向 引 物806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)[11，12]擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的V3-V4 高變區(qū)。 擴(kuò)增體系(20 μL):5×FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，引物(5 μmol/L)0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，DNA 模板2.5 μL，加ddH2O 至20 μL。 PCR反應(yīng)條件:95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，27 個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。 每個樣本3 個重復(fù)，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)回收PCR 產(chǎn)物，并用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

熒光定量:將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega 公司)進(jìn)行定量檢測。

Miseq 文庫構(gòu)建:通過PCR 將Illumina 官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端；使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物；Tris-HCl 緩沖液洗脫后采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA 片段。 文庫構(gòu)建試劑盒為TruSeqTMDNA Sample Prep Kit。

Miseq 測序:DNA 片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；以DNA 片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物，在芯片上PCR 合成目標(biāo)待測DNA 片段；變性、退火后，芯片上DNA 片段的另一端隨機(jī)與附近的另外一個引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”(bridge)； PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA 擴(kuò)增子線性化成為單鏈；加入改造過的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將熒光基團(tuán)和終止基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3′端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA 片段的序列。

生物信息分析:Miseq 測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU 聚類分析結(jié)果，對OTU 進(jìn)行多樣性指數(shù)分析以及測序深度檢測；基于分類學(xué)信息，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。 在上述分析的基礎(chǔ)上，對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行多元分析和差異顯著性檢驗等。

1.2.2 兩個栽培種塊根化感物質(zhì)的測定 樣品處理:精確稱取1000 mg 樣品(兩個栽培種塊根的根際土壤)至裝有一顆直徑6 mm 的研磨珠的2 mL 離心管中；加入1000 μL 含0.02 mg/mL 內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸) 的提取液[甲醇∶水＝4∶1(V∶V)]；冷凍組織研磨儀研磨6 min(-10℃，50 Hz)；低溫超聲提取30 min(5℃，40 kHz)；樣品于-20℃靜置30 min；13000× g 離心15 min(4℃)，移取上清液，氮?dú)獯蹈桑患尤?00 μL 復(fù)溶液(乙腈∶水＝1∶1)復(fù)溶；渦旋混勻30 s，低溫超聲萃取5 min(5℃，40 kHz)；13000× g 離心10 min(4℃)，移取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中上機(jī)分析；另外，每個樣本分別移取20 μL 上清液，混合后作為質(zhì)控樣本。

LC-MS 檢測:本次LC-MS 分析的儀器平臺為賽默飛公司的超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜UHPLC -Q Exactive HF-X 系統(tǒng)。 色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm ×2.1 mm i.d.，1.8 μm； Waters，Milford，USA)；流動相A 為95%水＋5%乙腈(含0.1%甲酸)，流動相B 為47.5%乙腈＋47.5%異丙醇＋5%水(含0.1%甲酸)，進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為40℃。 質(zhì)譜條件:樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負(fù)離子掃描模式采集質(zhì)譜信號。 掃描范圍:70～1050 m/z；鞘氣流速:50 arb；輔助氣流速:1350 arb；加熱溫度:425℃；毛細(xì)管溫度:325℃；噴霧電壓(正模式):3500 V；噴霧電壓(負(fù)模式):-3500 V；SLens 電壓:50 V；碰撞能:20、40、60 eV；分辨率(Full MS):60000；分辨率(MS2):7500。

代謝產(chǎn)物鑒定:將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊等，最終得到含保留時間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度等信息的數(shù)據(jù)矩陣。 其后采用該軟件進(jìn)行特征峰搜庫鑒定，將MS 和MS/MS 質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，MS 質(zhì)量誤差設(shè)置為小于10 mg/kg，同時根據(jù)二級質(zhì)譜匹配得分鑒定代謝物。主要數(shù)據(jù)庫為http:/ /www.hmdb.ca/、https:/ /metlin.scripps.edu/等主流公共數(shù)據(jù)庫以及自建的數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的測序信息

由表1 可知，兩個樣品有效序列數(shù)為287798，有效堿基數(shù)為65272 031，序列平均長度為226 bp。

表1 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌、根際微生物的測序信息統(tǒng)計

2.2 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的OTU 分析

2.2.1 分類學(xué)分析 由圖1 可知，懷玉2 號塊根(LM_G)的物種數(shù)量為111，懷玉1 號塊根(WT_G)的物種數(shù)量為91；懷玉1 號根際土壤(WT)的物種數(shù)量為402，懷玉2 號根際土壤(LM)的物種數(shù)量為492。 表明懷玉1 號塊根內(nèi)生菌和根際微生物的物種數(shù)量均少于懷玉2 號。

圖1 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和 根際微生物OTU 分析的Rank-Abundance 曲線

2.2.2 Pan/Core 物種分析 由圖2 可知，懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物序列Core OTU 隨著樣本數(shù)目的增加逐漸減少；Pan OTU 隨著樣本數(shù)目的增加逐漸增加。

圖2 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和 根際微生物的Pan/Core OTU 分析

2.3 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的Alpha 多樣性分析

2.3.1 Alpha 多樣性指數(shù) 從表2 可知，懷玉1號塊根(WT_G)的Ace 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)最高，其次是懷玉2 號根際土壤(LM)，懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號根際土壤(WT)較低，表明懷玉1 號塊根(WT_G)和懷玉2 號根際土壤(LM)的物種數(shù)較多。 懷玉1 號根際土壤(WT)的覆蓋度最高。 對于Shannon 指數(shù)，懷玉1 號塊根(WT_G)和懷玉2 號根際土壤(LM)較高，而懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號根際土壤(WT)較低，表明懷玉1 號塊根(WT_G)和懷玉2 號根際土壤(LM)的物種多樣性較高。 對于Simpson 指數(shù)，懷玉2 號塊根(LM_G)最高，懷玉1 號塊根(WT_G)最低，表明懷玉1 號塊根(WT_G)的物種多樣性最高。

表2 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌、根際微生物的Alpha 多樣性指數(shù)

2.3.2 稀釋曲線 由圖3 可知，懷玉1 號塊根(WT_G)、懷玉2 號根際土壤(LM)、懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號根際土壤(WT)的稀釋曲線隨取樣量的增加均趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理。

圖3 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的稀釋曲線

2.4 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的群落組成

懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物群落主要為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota，圖4)。 在懷玉2 號根際土壤(LM)中，子囊菌門(Ascomycota)占比64.87%，unclassified_k_Fungi 占比18.66%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占比7.54%，羅茲菌門(Rozellomycota)占比0.93%，被孢霉門(Mortierellomycota)占比7.94%，others 占比0.06%；在懷玉1 號根際土壤(WT)中，子囊菌門(Ascomycota)占比63.18%，unclassified_k_Fungi 占比2.32%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占比22.20%，羅茲菌門(Rozellomycota)占比2.83%，被孢霉門(Mortierellomycota)占比9.41%，others 占比0.05%；在懷玉2 號塊根(LM_G) 中，子囊菌門(Ascomycota) 占比96.88%，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)占比3.08%，羅茲菌門(Rozellomycota) 占比0.01%，被孢霉門(Mortierellomycota) 占 比 0. 03%，others 占 比0.01%；在懷玉1 號塊根(WT_G)中，子囊菌門(Ascomycota)占比83.36%，unclassified_k_Fungi占比0. 07%，擔(dān) 子菌 門(Basidiomycota) 占 比15.43%，羅茲菌門(Rozellomycota)占比0.02%，被孢霉門(Mortierellomycota)占比7.94%，others 占比0.04%。表明懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1號根際土壤(WT)的優(yōu)勢群落均為子囊菌門(Ascomycota)，且兩者的子囊菌門(Ascomycota)數(shù)量相差不大，懷玉1 號根際土壤(WT)的擔(dān)子菌門(Basidiomycota) 數(shù)量高于懷玉2 號根際土壤(LM)；懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號塊根(WT_G)的優(yōu)勢群落也均為子囊菌門(Ascomycota)，其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，懷玉1 號塊根(WT_G)的擔(dān)子菌門(Basidiomycota)數(shù)量高于懷玉2 號塊根(LM_G)，子囊菌門(Ascomycota)數(shù)量低于懷玉2 號塊根(LM_G)。

圖4 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的群落組成分析

2.5 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的樣本層級聚類分析

由圖5 可知，懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1 號根際土壤(WT)聚為一個層級；懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號塊根(WT_G)聚為另一個層級。

圖5 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和 根際微生物的樣本層級聚類分析

2.6 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的樣本距離熱圖

由圖6 可知，懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉2 號塊根(LM_G)，懷玉1 號根際土壤(WT)和懷玉1 號塊根(WT_G)的距離最遠(yuǎn)，顏色梯度代表的數(shù)值為1。 懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1號根際土壤(WT)，懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號塊根(WT_G)的距離最近，顏色梯度代表的數(shù)值為0.6。

圖6 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的樣本距離熱圖

2.7 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的PCA 分析

由圖7 可知，懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1 號根際土壤(WT)兩樣本點接近，表明兩樣本物種組成相似。 懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號塊根(WT_G)兩樣本點較遠(yuǎn)，表明兩樣本物種組成不同。

圖7 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和 根際微生物的PCA 分析

2.8 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的多物種差異檢驗

懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的多物種差異檢驗見圖8。 懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1 號根際土壤(WT)子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、unclassified_k_Fungi、被孢霉門(Mortierellomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、 壺 菌 門( Chytridiomycota)、 捕 蟲 霉 門(Zoopagomycota)均具有顯著性差異，而Monoblepharomycota 的數(shù)量無顯著性差異。 懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號塊根(WT_G)子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、unclassified_k_Fungi、球囊菌門(Glomeromycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)的數(shù)量均具有顯著性差異。

2.9 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的KEGG 功能豐度

由圖9 可知，懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1號塊根(WT_G)內(nèi)生菌、懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1 號根際土壤(WT)微生物KEGG 功能豐度較高的酶類主要有:EC3.6.1.3(腺苷三磷酸酶，adenosinetriphosphatase)、EC5.3.1.4(L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，L-arabinose isomerase)、EC3.2.1.3(葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶，glucan 1，4-alpha-glucosidase)、EC2.7.7.6(DNA 定向RNA 聚合酶，DNAdirected RNA polymerase)、EC3.2.1.18(外顯α 唾液酸酶，exo-alpha-sialidase)、EC5.2.1.8(肽基脯氨酰異構(gòu)酶，peptidylprolyl isomerase)、EC2.7.7.7(DNA 定向DNA 聚合酶，DNA-directed DNA polymerase)、EC2.3.1.48(組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，histone acetyltransferase)、EC3.6.3.14[H(＋)-傳輸雙扇區(qū)ATP 酶，H(＋)-transporting two-sector ATPase]、EC3.4.25.1(蛋白酶體內(nèi)肽酶復(fù)合物，proteasome endopeptidase complex)、EC3.1.3.16(蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，protein-serine/threonine phosphatase)、EC1.14.14.1(非特異性單加氧酶，unspecific monooxygenase)等。

圖9 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的KEGG 功能豐度統(tǒng)計

2.10 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的FUNGuild 功能分類

由圖10 可知，懷玉2 號塊根(LM_G)和懷玉1 號塊根(WT_G)內(nèi)生菌、懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1 號根際土壤(WT)微生物的分類主要有:未定義腐生真菌(Undefined Saprotroph)、內(nèi)生凋落物腐生菌土壤腐生菌未定義腐生真菌(Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph)、動物病原內(nèi)生真菌寄生蟲植物病原木腐生物(Animal Pathogen-Endophyte-Fungal Parasite-Plant Pathogen-Wood Saprotroph)、動物病原未定義腐生真菌(Animal Pathogen-Undefined Saprotroph)、動物病原體內(nèi)生真菌地衣寄生蟲植物病原體土壤腐生真菌木材腐生真菌(Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph)、真菌寄生蟲未定義腐生物(Fungal Parasite-Undefined Saprotroph)、動物病原體糞腐菌內(nèi)生真菌植物腐生木(Animal Pathogen-Dung Saprotroph-Endophyte-Epiphyte -Plant Saprotroph-Wood)、動物病原體內(nèi)生真菌地衣寄生蟲植物病原體木材腐生真菌(Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Wood Saprotroph)、 動 物 病 原(Animal Pathogen)、植物病原(Plant Pathogen)、內(nèi)生菌根植物病原菌未定義腐生真菌(Endomycorrhizal-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph)、土壤腐生真菌(Soil Saprotroph)、內(nèi)生凋落物腐生真菌木材腐生真菌(Endophyte-Litter Saprotroph-Wood Saprotroph)等。

圖10 懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌和根際微生物的FUNGuild 功能分類統(tǒng)計

2.11 懷玉山三葉青兩個栽培種根際土壤化感物質(zhì)分析

圖11顯示，在該檢測條件下，峰形良好，分布相對均勻。

圖11 懷玉山三葉青兩個栽培種根際土壤 代謝物L(fēng)C-MS 總離子色譜圖

通過LC-MS 技術(shù)對懷玉山三葉青兩個栽培種根際土壤進(jìn)行檢測，共鑒定出6 種酚酸類化感物質(zhì)(表3)。 懷玉1 號根際土壤(WT)的龍膽酸、香草醛酸和水楊酸含量高于懷玉2 號根際土壤(LM)，而丁香酸、沒食子酸和阿魏酸含量低于懷玉2 號根際土壤(LM)。

表3 懷玉山三葉青兩個栽培種根際土壤化感物質(zhì)的比較分析

3 討論與結(jié)論

研究表明，根際微生物-植物-環(huán)境之間互作關(guān)系較為敏感，根際土壤微生物的多樣性、生理活性及微生物間的相互作用決定植物的品質(zhì)和產(chǎn)量[13]。 高通量測序具有成本低、通量高等優(yōu)點，在微生物生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。 本試驗通過Miseq 測序平臺研究了懷玉山三葉青兩個栽培種根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，為后續(xù)懷玉山三葉青化感效應(yīng)研究奠定了基礎(chǔ)。 唐彬彬等[14]發(fā)現(xiàn)，在真菌群落中，子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、 壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)在三七根際土壤群落中屬于優(yōu)勢菌群。 蘇小惠等[11]發(fā)現(xiàn)，5 個苧麻品種根際土壤真菌中子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢門。 楊瀟湘等[12]發(fā)現(xiàn)大豆和油菜根際土壤在門水平的優(yōu)勢類群相同，如子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門等的豐度都較高，但在屬水平上兩種樣品之間具有顯著差異。本試驗中，懷玉2 號根際土壤(LM)和懷玉1 號根際土壤(WT)的優(yōu)勢群落均為子囊菌門(Ascomycota)，其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，與上述結(jié)果一致。 Tan[15]、吳照祥[16]等發(fā)現(xiàn)，三七根際有益真菌被孢霉門(Mortierellomycota)的豐富度隨三七種植年限的增加而減少，可能使得真菌屬水平上種群失衡引起一些病原真菌如子囊菌門和擔(dān)子菌門的種群豐富度增加，從而導(dǎo)致三七發(fā)生連作障礙。 本試驗中，懷玉2 號塊根(LM_G)子囊菌門的數(shù)量顯著多于懷玉1 號塊根(WT_G)，懷玉2 號塊根(LM_G)擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的數(shù)量顯著低于懷玉1 號塊根(WT_G)，懷玉2號根際土壤(LM)有益真菌被孢霉門(Mortierellomycota) 的數(shù)量顯著低于懷玉1 號根際土壤(WT)。 懷玉山三葉青兩個栽培種的塊根內(nèi)生菌和根際土壤微生物的病原真菌和有益真菌群落在同一栽培種內(nèi)分布較為一致。

植物內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)組成隨物種及其基因型、生長環(huán)境不同而異[17]。 內(nèi)生菌以植物為宿主載體，二者相互作用形成微生態(tài)系統(tǒng)，間接影響植物的品質(zhì)和產(chǎn)量[18]。 蔡媛等[19]利用MiSeq 高通量技術(shù)，發(fā)現(xiàn)湖南、安徽、江西、湖北、貴州5 個產(chǎn)地15 組多花黃精內(nèi)生菌數(shù)量和種類豐富，其內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群為子囊菌門下一未知鑒定菌屬，其次為赤殼屬、炭疽屬、間座殼屬、鐮刀菌屬等。 楊立昌等[20]基于高通量測序，探明金釵石斛種子的內(nèi)生真菌序列歸為14 個OTUs，隸屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota )，其中子囊菌門為優(yōu)勢門。 雷鋒杰等[21]發(fā)現(xiàn)，人參根部相對豐度最高的內(nèi)生真菌類群為子囊菌門(Ascomycota)，占各人參樣品的80%以上，是人參內(nèi)生真菌中最主要的真菌類群，其次是擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，其相對豐度比例較高。 本試驗結(jié)果與上述結(jié)果一致。

三葉青已被證實具有化感自毒作用，主要化感物質(zhì)為4-羥基-3-甲氧基苯甲酸和對羥基苯甲酸[8]。 本試驗用GC-MS 技術(shù)檢測出6 種化感物質(zhì)，其中懷玉1 號根際土壤(WT)的龍膽酸、香草醛酸和水楊酸含量高于懷玉2 號根際土壤(LM)，而丁香酸、沒食子酸和阿魏酸含量低于懷玉2 號根際土壤(LM)。 說明懷玉山三葉青兩個栽培種懷玉1 號和懷玉2 號造成化感自毒和連作障礙的物質(zhì)有所差異。