金蕎麥HPLC 條件優(yōu)化及表兒茶素鑒定研究

吳海濤，陳玥，楊微，吳靈玉

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)理學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)村農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

金蕎麥（Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara）為蓼科植物金蕎麥的干燥根莖，味微辛、澀，性涼。中藥學(xué)將其歸為清熱藥一類，用于清熱解毒，排膿祛瘀，治療肺熱咳嗽[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金蕎麥的藥理活性有抗癌，抗菌，解熱、陣痛、抗炎，鎮(zhèn)咳祛痰作用，抗血小板聚集作用，調(diào)脂和降糖作用，抗氧化作用，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，抗突變作用，抗衰老作用等[3-5]。目前科學(xué)家對金蕎麥的研究較為廣泛，通過國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，金蕎麥中的化學(xué)成分主要有黃酮類、萜類化合物、有機(jī)酸類、甾體化合物等[6]，其中發(fā)揮主要活性的成分為黃酮類，包括蘆丁、芹菜素、表兒茶素、原花青素等[7]。

我國科學(xué)家研究金蕎麥時間較早，從古至今，已發(fā)現(xiàn)金蕎麥的多種臨床應(yīng)用并均具有較好的療效，其主要的藥用部位為塊莖。目前，金蕎麥在臨床上能夠用于治療閉經(jīng)、盆腔炎等婦科疾病，緩解支氣管炎、肺炎、咽喉腫痛、鼻咽腫瘤等呼吸道系統(tǒng)疾病，金蕎麥還能治療消化系統(tǒng)疾病如胃痛、膽管感染等，并對皮膚化膿性感染、外傷感染、急性乳腺炎、及家禽的一些急、漫性感染性疾病具有一定的療效[8-9]。由于金蕎麥對各種呼吸道疾病具有較好的治療及緩解作用，目前有文獻(xiàn)表明金蕎麥在預(yù)防和治療新冠肺炎上也具有較大的潛力[10]。

金蕎麥?zhǔn)钳熜Т_切的上市藥，有些學(xué)者研究了它的治療原理。梁明達(dá)等[11]和孟凡虹等[12]采用活性追蹤法從金蕎麥根莖中分離得到了活性部位，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明該活性部位能夠明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并通過一系列實(shí)驗(yàn)證明該活性部位為原花青素的縮合性單寧混合物，且其具有較高的抗癌活性，混合物中含有多羥基黃酮結(jié)構(gòu)，基本單元為（-）-表兒茶素[13]，有（+）兒茶素、（-）表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2以及原花青素C1，化學(xué)分類中屬于兒茶素類中的黃烷醇類。結(jié)合中外文獻(xiàn)，兒茶素類化合物可抗HIV，抑制腫瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞毒（COX-1 抑制劑），抗?jié)儯柚共≡w入侵，抗菌，抗腹瀉（阻滯在大腸中產(chǎn)生吲哚），類似維生素P 樣作用等；其中表兒茶素有抗氧化（DPPH 清除劑，IC50=1.7（g·mL-1；對照抗壞血酸，IC50=3.9（g·mL-1），抗過敏，抗炎，抗誘變，降血脂（減少血清中的膽固醇），抑制膽堿酯酶，骨髓細(xì)胞增殖促進(jìn)[14]等作用；而原花青素類物質(zhì)有抗腫瘤（抑制TPA 誘導(dǎo)的小鼠皮膚腫瘤），抗氧化（抑制LDL 的氧化，抗氧化活性強(qiáng)于維生素C），DPPH 清除（活性強(qiáng)于維生素C 和維生素E）等活性[15]。因此，研究將檢測黃烷醇類成分中的表兒茶素作為金蕎麥質(zhì)量檢測的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品鑒定所提供）；Symmetry C18 色譜柱（Waters 公司生產(chǎn)）；乙腈、甲醇均為色譜級（北京百靈威科技有限公司）；純凈水（華潤怡寶飲料有限公司）；甲酸、乙酸、甲苯、乙酸乙酯均為分析純。

藥材金蕎麥由黑龍江康麥斯藥業(yè)有限公司提供，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院制藥工程系賈桂燕老師鑒定為金蕎麥。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010A 型高效液相色譜儀（日本島津）；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；RE52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FA2104 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；pH 計(jì)（力辰科技）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

選取質(zhì)地均勻的金蕎麥根莖，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，確定所需藥材的量（盡量使整個實(shí)驗(yàn)用同一批藥材，并額外預(yù)留1/2 的藥材以備實(shí)驗(yàn)失敗樣品不足），洗凈待晾干后進(jìn)行粉碎（若過于干燥，在粉碎前撒適量蒸餾水，以防止粉塵飛揚(yáng)），10 目篩過濾網(wǎng)過濾，置于暗處保存，備用。取金蕎麥藥材粗粉約20 g，50%的乙醇，60 ℃加熱攪拌提取三次，每次提取時間為1 h，液料比為15∶10，得總濾液減壓濃縮至近干，取部分粗提物用乙腈-水混合溶液溶解后進(jìn)行TLC 和HPLC檢測，得到的色譜圖均不理想，發(fā)現(xiàn)粗提物所含雜質(zhì)太多，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測有較大影響，為了進(jìn)一步完善該方法，對所得粗提物進(jìn)行了聚酰胺柱層析實(shí)驗(yàn)，即將粗提物用純水溶解后濕法加入聚酰胺柱中，首先進(jìn)行水洗脫，采用3 倍柱體積的純水，棄去水液，更換洗脫液，采用4 倍柱體積乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至近干，最終得到實(shí)驗(yàn)所需含雜質(zhì)較少的金蕎麥提取物。

1.2.2 TLC（薄層色譜）鑒別

取提取物適量于試管中，用乙腈-水（10∶90）溶解，制得樣品溶液。取表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品適量，溶解劑為甲醇，即為對照品溶液。

使用微量毛細(xì)管分別吸取樣品溶液和對照品溶液各1 μL，點(diǎn)于Gf254 硅膠薄層板上，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-乙酸（20∶5∶1），放入層析杠中，展開，晾干。均勻的噴上三氯化鋁乙醇溶液顯色劑，烤板至干燥后，分別于365 nm 和254 nm 下的紫外光燈觀察，當(dāng)在254 nm 下觀察時，并沒有發(fā)現(xiàn)供試品在標(biāo)準(zhǔn)品相同位置處有相同斑點(diǎn)。這與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，故進(jìn)行更為精密的HPLC 實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

1.2.3 HPLC 色譜條件的優(yōu)化

（1）檢測波長的選擇

表兒茶素為黃烷醇類化合物，其在270～290 nm 范圍內(nèi)均有紫外吸收，為了找到實(shí)驗(yàn)所用表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的最大紫外吸收，在查閱有關(guān)文獻(xiàn)和書籍后，得出其最大紫外吸收在280 nm 處，但由于文獻(xiàn)中有報(bào)道檢測波長為220 nm，所以將供試品溶液分別在220 nm 和280 nm 下進(jìn)行了檢測。

（2）緩沖鹽種類的選擇

兒茶素類高效液相色譜法中所用緩沖鹽的pH值普遍為3 左右，但其種類卻較多，實(shí)驗(yàn)選擇pH 為3 的甲酸水溶液pH 為3 的乙酸水溶液進(jìn)行比較。

（3）流動相比例的選擇

對乙腈-甲酸水體系的梯度進(jìn)行了考察，共選擇了5 種流動相梯度進(jìn)行考察，如表1 所示。

表1 流動相比例Table 1 Mobile phase ratio

1.2.4 金蕎麥中表兒茶素的HPLC 鑒定

（1）供試品溶液的制備

取提取物適量，用乙腈-水（10∶90）溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，置于2.0 mL 樣品瓶中，得供試品溶液，放入樣品架上并記錄編號為1-1。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品適量，以甲醇為溶解劑，制成0.2 mg·mL-1的比奏準(zhǔn)品溶液，使用0.45 μm 微孔濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至2.0 mL 樣品瓶中，得對照品溶液，放入樣品架上并記錄編號為1-2。

（3）流動相的制備

量取500 mL 純凈水兩份，一份直接過0.45 μm過濾用水膜，另一份加入適量甲酸并用pH 計(jì)測得pH 為3 后過0.45 μm 過濾用水膜，再量取色譜甲醇、色譜乙腈各500 mL，過0.45 μm 過濾用有機(jī)膜，四種流動相放入超聲波清洗儀中超聲排氣20 min，即得。

（4）HPLC 鑒定

檢測條件為：Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱；35 ℃的柱溫；280 nm 的檢測波長；1.0 mL·min-1的流速；流動相為乙腈和甲酸緩沖鹽溶液（PH=3.0），按比例為7.5∶92.5 等度洗脫；進(jìn)樣量為20 μL。理論塔板數(shù)按（-）-表兒茶素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

以相同色譜條件，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL 進(jìn)樣，進(jìn)行測定。

（5）精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為100 μg·mL-1，每次10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄主峰保留時間。

（6）重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

將金蕎麥按1.2.1 步驟重復(fù)處理5 份，按（4）方式進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20 μL。記錄表兒茶素峰保留時間。

（7）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一金蕎麥樣品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20 μL。記錄表兒茶素峰保留時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 色譜條件優(yōu)化的結(jié)果與分析

2.1.1 檢測波長

在其他檢測條件相同情況下，比較220 nm 和280 nm 所得譜圖，如圖1，2 所示。比較后得出280 nm下的譜圖出峰較多，基線較平，峰形較好，主要成分峰的分離度較好，可以達(dá)到基線分離，8~56 min 可以清楚的看到14 個主峰，而在220 nm 波長下，主峰辨識度較差，為進(jìn)一步的檢測的優(yōu)化考慮，故選擇280 nm作為檢測波長。

圖1 檢測波長為220 nm 下的HPLC 譜圖Fig.1 HPLC spectra were detected at 220 nm

圖2 檢測波長為280 nm 下的HPLC 譜圖Fig.2 HPLC spectra were detected at 280 nm

2.1.2 緩沖鹽

在其他檢測條件相同情況下，按緩沖鹽為pH 為3 的甲酸和乙酸分別檢測后，如圖3，4 所示。結(jié)果表明，甲酸體系與乙酸體系相比較而言，基線較平，出峰時間合理，峰分離度較好，因此選擇pH 為3 的甲酸水溶液作為緩沖溶液。

圖3 pH 為3 的甲酸水體系下的HPLC 譜圖Fig.3 HPLC spectrogram of formic acid water system at pH 3

圖4 pH 為3 的乙酸水體系下的HPLC 譜圖Fig.4 HPLC spectrogram of acetic acid water system at pH 3

2.1.3 流動相比例

在其他檢測條件相同情況下，按表1 所示流動相比例分別檢測，如圖5-9 所示。結(jié)果表明，1 條件下前15 min 由于理論塔板數(shù)不夠，峰分離度較差，基線不平；2 條件下出峰較少、16.5 min 的峰型拖尾，對稱性較差；3、4 條件下基線飄移較嚴(yán)重，分離度太差，證明流動相梯度不合適；而5 條件下（如圖9）所出峰基線、峰型、分離度、對稱性等各方面均較好。因此選擇流動相比例為乙腈-甲酸水為7.5∶92.5。

圖5 流動相比例為1 下的HPLC 譜圖Fig.5 HPLC spectra with mobile phase ratio of 1

圖9 流動相比例為5 下的HPLC 譜圖Fig.9 HPLC spectra with mobile phase ratio of 5

2.2 金蕎麥中表兒茶素HPLC 鑒定的結(jié)果

2.2.1 HPLC 定性鑒定結(jié)果

結(jié)果表明，表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為31.074 min，供試品相對保留時間為31.832 min，供試品表兒茶素峰與標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時間一致。如圖10，11 所示。

圖10 金蕎麥藥材HPLC 譜圖Fig.10 HPLC spectrum of Fagopyrum buckwheat

圖6 流動相比例為2 下的HPLC 譜圖Fig.6 HPLC spectra with mobile phase ratio of 2

圖7 流動相比例為3 下的HPLC 譜圖Fig.7 HPLC spectra with mobile phase ratio of 3

圖8 流動相比例為4 下的HPLC 譜圖Fig.8 HPLC spectra with mobile phase ratio of 4

圖11 表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 譜圖Fig.11 HPLC spectra of epicatechin standard

2.2.2 HPLC 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的RSD 為0.79%，表明測定結(jié)果較準(zhǔn)確。

表2 表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品Table 2 Epicatechin standard

2.2.3 HPLC 現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

金蕎麥樣品中表兒茶素峰的保留時間為RSD 為1.71%（n=5），重現(xiàn)性良好。

2.2.4 HPLC 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

金蕎麥樣品中表兒茶素峰保留時間的RSD為0.84%（n=10），可見金蕎麥樣品在24 h 內(nèi)都比較穩(wěn)定。

表3 表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品Table 3 Epicatechin standard

3 討論

中國藥理文化博大精深，中藥更是一個相對復(fù)雜的體系，究其原因來講，主要是中藥中含有較多部位具有有效成分，這也導(dǎo)致了其有效成分分離提取的難度，傳統(tǒng)方法如蒸餾法，萃取法已經(jīng)很難滿足研究的目的，色譜方法的應(yīng)用和研究極大地提高了分離測定的速度和準(zhǔn)確性。其中應(yīng)用最廣泛的是高效液相色譜法，HPLC 具有樣品用量少、分離效率高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快、幾乎可以適用于任何定性定量分析領(lǐng)域等優(yōu)點(diǎn)。此外還報(bào)道過應(yīng)用紫外分光光度法[16]、大孔樹脂法[17]、薄層色譜法[18-19]等鑒別方法，但都不具備HPLC 所具備的一切優(yōu)點(diǎn)，也不及HPLC 應(yīng)用的廣泛。

目前對于兒茶素類化合物的檢測及鑒定方法眾多，其中主要有薄層色譜法（TLC）、毛細(xì)管電泳法（CE）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）以及膠束毛細(xì)管電動色譜等[20-21]。由于天然中藥的化學(xué)成分相對復(fù)雜，用分光光度法進(jìn)行檢測會有許多干擾因素，檢測過程中檢測試劑的加入時間、顯色劑的顯色時間等因素均對檢測結(jié)果具有較大的影響。故實(shí)驗(yàn)則通過HPLC 等化學(xué)分析手段，對金蕎麥的HPLC 條件進(jìn)行優(yōu)化并對醇提物中的表兒茶素成分進(jìn)行了鑒定研究，為今后進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)只鑒定了黃烷醇類中的表兒茶素，且表兒茶素峰峰面積相對較小，可以看出表兒茶素并不適合作為金蕎麥中的代表性化合物來對金蕎麥進(jìn)行質(zhì)量鑒定，因此猜測在之前的薄層色譜實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到表兒茶素并非其中不含這種成分，而是含量太低，薄層色譜靈敏度太低所造成。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對金蕎麥提取物中黃烷醇類代表化合物表兒茶素進(jìn)行定性檢測，使用的條件在藥典基礎(chǔ)上，對其中的檢測波長、緩沖鹽、流動相比例進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為：檢測波長280 nm，流動相為乙腈-甲酸水溶液（pH=3.0）等度洗脫，7.5∶92.5 的比例。優(yōu)化后的條件縮短了表兒茶素的保留時間，且分離度和對稱性均相對較好。穩(wěn)定性和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，表明優(yōu)化后方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，該條件為其他黃烷醇類物質(zhì)如兒茶素、原花青素等的鑒定提供方法依據(jù)，也為今后金蕎麥質(zhì)量控制的進(jìn)一步改進(jìn)提供依據(jù)。