觸發(fā)式自釋放喜樹堿聚合物前藥的合成與釋放調(diào)控

白皓宇, 周珠賢, 申有青

觸發(fā)式自釋放喜樹堿聚合物前藥的合成與釋放調(diào)控

白皓宇, 周珠賢, 申有青

(浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江省智能生物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310027)

精準(zhǔn)控制藥物釋放是提高藥物療效并降低毒副作用的關(guān)鍵。觸發(fā)式自釋放系統(tǒng)可用于藥物的程控和定點(diǎn)釋放。研究構(gòu)建一種觸發(fā)式自釋放的喜樹堿(CPT)聚合物前藥平臺(tái)。通過開環(huán)易位聚合，合成一系列分子質(zhì)量相近但氨基鏈長短/數(shù)量不同的聚合物前藥(PEG-E-CPT2和PEG-D-CPT2)，重點(diǎn)探究氨基鏈長短/數(shù)量對CPT自釋放的影響。結(jié)果表明，氨基鏈長短、數(shù)量和pH均可以改變CPT的釋放行為。通過控制氨基數(shù)量，PEG-E-CPT2和PEG-D-CPT2在180 h的釋放量可分別從10% 調(diào)控至89% 或62%。此外，利用酸敏感性-羧酸酰胺修飾氨基可實(shí)現(xiàn)酸觸發(fā)CPT釋放。該研究報(bào)道了利用鄰近側(cè)鏈氨基催化分子內(nèi)水解現(xiàn)象來調(diào)控藥物的釋放性能。

觸發(fā)式自釋放；聚合物前藥；喜樹堿；釋放調(diào)控

1 前言

喜樹堿(camptothecin，CPT)及其衍生物是一種具有高效且廣譜的抗腫瘤藥物，用于治療結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌等多種癌癥。但是CPT疏水性強(qiáng)、半衰期短以及對正常組織具有毒性(尤其是腸毒性)等問題限制了其臨床應(yīng)用[1]。已經(jīng)上市或正在進(jìn)行臨床研究的喜樹堿類遞送系統(tǒng)(如Onivide，NK-012，XMT-1001，Pegamotecan[2-6])，對延長藥物循環(huán)時(shí)間、提升藥代動(dòng)力學(xué)特征效果明顯，但是對非特異性全身釋放、刺激響應(yīng)性釋放慢的問題改善甚微。因此，開發(fā)一種高選擇性、程序性可控釋放的喜樹堿藥物遞送系統(tǒng)具有重大意義。

近年來，觸發(fā)式自釋放(self-immolative)前藥由于獨(dú)特的刺激響應(yīng)性以及可控降解的特性，受到越來越多的關(guān)注[7]。觸發(fā)式自降解體系通常通過分子內(nèi)的反應(yīng)，如1,4-消除、1,6-消除或環(huán)化消除啟動(dòng)解聚過程和藥物釋放[8-9]。腫瘤組織內(nèi)異常的微環(huán)境，如酸性pH、缺氧、過表達(dá)的酶以及高水平的活性氧、谷胱甘肽和 5'-三磷酸腺苷可以作為觸發(fā)因素，引發(fā)構(gòu)筑單元快速解聚，實(shí)現(xiàn)治療劑在腫瘤部位的可控釋放[10-14]。這種可控且快速的釋藥方式可以提高藥物對腫瘤的毒性[15-17]。但是，目前的觸發(fā)式自降解體系結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要多步合成步驟[18-19]，且降解產(chǎn)物中含有對正常細(xì)胞有毒性的醌甲基、鄰苯二甲醛等化合物[7]，這些缺點(diǎn)阻礙了觸發(fā)式自降解前藥在生物醫(yī)學(xué)材料的進(jìn)一步應(yīng)用。

分子內(nèi)堿催化水解是酯和酰胺鍵發(fā)生酶促水解的一種常見機(jī)制[20]。Zhou等[21]報(bào)道了一種氨基催化分子內(nèi)水解的樹枝狀大分子藥物遞送系統(tǒng)，樹枝狀大分子外圍氨基增加會(huì)導(dǎo)致連接CPT的酯鍵斷裂從而加速CPT的釋放。受此啟發(fā)，本研究猜想該現(xiàn)象是否能夠應(yīng)用于梳狀聚合物分子內(nèi)水解的調(diào)控，利用鄰近側(cè)鏈氨基調(diào)控藥物的釋放。

開環(huán)易位聚合(ring opening metathesis polymerization，ROMP)是一種條件溫和、高效可控的聚合方式[22-24]。目前常用的聚合單體為降冰片烯基單體，該類單體易于合成，轉(zhuǎn)化效率高，聚合產(chǎn)物分布窄[25-26]，是可控聚合的一種理想選擇。本研究以降冰片烯二酸酐(cis-5-norbornene-endo-2,3-dicarboxylic，NB)為原料，合成了4種降冰片烯基單體：NB-CPT作為活性藥物鏈，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)單體(NB-PEG)作為親水鏈，N-叔丁氧羰基[N-(tert-butoxycarbonyl)，Boc]保護(hù)的氨基單體(NB-EDA-Boc和NB-DAB-Boc)作為氨基調(diào)控鏈，通過ROMP合成了一系列不同氨基鏈結(jié)構(gòu)和數(shù)目的梳狀聚合物，進(jìn)而考察氨基鏈對CPT斷裂的影響。本研究還設(shè)計(jì)合成了一種新型的弱酸觸發(fā)式自水解聚合物，利用對氨基保護(hù)基團(tuán)的選擇，可實(shí)現(xiàn)對鄰近藥物鏈釋放的控制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器和試劑

三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、NB、6-氨基己酸(6-amino-hexanoic acid，HA)、3-氨基丙酸(β-alanine，PA)、氯化亞砜、N-(叔丁氧羰基)-1,2-乙二胺(N-tert-butoxycarbonyl-ethylenediamine，N-Boc-EDA)、N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺(N-(tert-butoxycarbonyl)- 1,4-diamino-butane，N-Boc-DAB)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(benzotriazol-1-yl- oxytripyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate，PyBop)、N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine，DIPEA)、乙烯基乙醚、丁二酸酐(succinic anhydride，SA)、四氫化鄰苯二甲酸酐(tetrahydrophthalic anhydride, DCA)、2,3-二甲基馬來酸酐(2,3-dimethylmaleic anhydride，DM)購于安耐吉試劑，Grubbs三代催化劑(Grubbs 3)購于Sigma-Aldrich，聚乙二醇單甲醚400 (mPEG400)購于TCI試劑網(wǎng)，喜樹堿(CPT，98%)購自浙江海正股份有限公司。除注明外，本研究使用的其他化學(xué)試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑。核磁共振氫譜(1H-NMR)由Bruker ARX400核磁共振譜儀(德國Bruker)檢測。聚合物的分子量及分布由Wyatt GPC/SEC-MALS凝膠滲透色譜儀(gel permeation chromatography，GPC) (Wyatt)檢測。釋放實(shí)驗(yàn)由Agilent 1260高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography，HPLC) ( Agilent)檢測。

2.2 NB-PA的合成

NB-PA的合成參照文獻(xiàn)[27]的方法，具體如下：稱取NB (5.0 g，30.5 mmol)和PA (7.2 g，30.6 mmol)溶解在150 mL甲苯中，溶液在120 ℃下回流20 h，旋蒸得到純白色結(jié)晶狀固體粗產(chǎn)物。將固體粗產(chǎn)物溶于40 mL乙酸乙酯，用飽和NaHCO3溶液洗滌3遍，水相用二氯甲烷(dichloromethane，DCM)洗2遍，用2 mol×L-1HCl將pH調(diào)節(jié)到2，酸化之后水相析出白色沉淀，用50 mL三氯甲烷萃取3遍，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后濃縮，真空干燥得到白色固體5.6 g(產(chǎn)率94 %)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)化學(xué)位移：6.29 (t,= 1.7 Hz, 2H), 3.53～3.40 (m, 2H), 3.34～3.20 (m, 2H), 2.68 (d,= 1.0 Hz, 2H), 2.35 (t,= 7.4 Hz, 2H), 1.67 (dd,= 15.3, 7.6 Hz, 4H), 1.57 (dd,= 15.2, 7.7 Hz, 1H), 1.52 (d,= 9.9 Hz, 1H), 1.41～1.30 (m, 2H), 1.22 (d,= 9.8 Hz, 1H)。

2.3 NB-CPT的合成

CPT-NH2參照文獻(xiàn)[21]合成得到。稱取CPT-NH2(2.0 g, 3.75 mmol)、NB-PA (1.0 g, 4.25 mmol)和PyBop (6.0 g , 11.5 mmol)混合于200 mL DCM，將5 mL DIPEA緩慢滴加到溶液中，室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)液用2 mol×L-1HCl洗滌3次，飽和NaHCO3溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗滌1次，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥。濃縮后得到的粗產(chǎn)品，過硅膠柱純化，得到淡黃色固體2.0 g (產(chǎn)率75%)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.44 (s, 1H), 8.29 (d,= 8.5 Hz, 1H), 7.95 (d,= 8.1 Hz, 1H), 7.85 (t,= 7.3 Hz, 1H), 7.68 (t,= 7.4 Hz, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.18 (ddd,= 15.0, 5.3, 3.1 Hz, 2H), 5.65 (d,= 17.2 Hz, 1H), 5.39 (d,= 17.2 Hz, 1H), 5.30 (d,= 6.6 Hz, 3H), 4.47 (dd,= 18.5, 6.4 Hz, 1H), 4.12～4.04 (m, 1H), 3.76～3.66 (m, 2H), 3.16 (s, 2H), 2.55 (dd,= 12.1, 4.8 Hz, 4H), 2.31～2.22 (m, 1H), 2.22～2.12 (m, 1H), 1.40 (d,= 9.9 Hz, 1H), 1.14 (d,= 9.9 Hz, 1H), 0.99 (t,= 7.4 Hz, 3H)。

2.4 NB-HA的合成

取NB (5.0 g, 30.5 mmol)和HA (4.0 g, 30.6 mmol)溶解在150 mL甲苯中，后續(xù)反應(yīng)、純化步驟與NB-PA類似，最終得到白色固體4.4 g(產(chǎn)率88%)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：6.29 (s, 2H), 4.27～4.16 (m, 2H), 3.77～3.63 (m, 29H), 3.55 (dd,= 5.7, 3.6 Hz, 2H), 3.48～3.43 (m, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.27 (s, 2H), 2.68 (s, 2H), 2.33 (t,= 7.5 Hz, 2H), 1.65 (dd,= 15.3, 7.6 Hz, 2H), 1.58 (dd,= 15.5, 7.9 Hz, 2H), 1.52 (d,= 9.9 Hz, 1H), 1.33 (dt,= 15.4, 7.6 Hz, 2H), 1.22 (d,= 9.9 Hz, 1H)。

2.5 NB-PEG的合成

取NB-HA (3.48 g, 14.8 mmol)溶解在30 mL DCM中，冰浴條件下逐滴加入氯化亞砜(2.2 mL, 29.6 mmol)，并滴加1滴無水N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)促溶，室溫?cái)嚢柽^夜。旋蒸得到結(jié)晶狀白色固體物質(zhì)。取mPEG (5.7 g, 14.0 mmol)，加入20 mL甲苯，在120 ℃下回流10 h，以完全去除mPEG中的水，密封待用。向上一步得到的白色固體中加入100 mL無水四氫呋喃(tetrahydrofuran, THF)、19 mL無水三乙胺和除水mPEG，室溫?cái)嚢柽^夜，旋蒸溶劑，用DCM溶解。有機(jī)相用2 mol×L-1HCl洗2遍，飽和NaHCO3洗滌2遍，無水硫酸鎂干燥后濃縮，放置于真空干燥箱干燥，得到無色液體約2.0 g(命名為NB-PEG)(產(chǎn)率57%)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：6.29 (s, 2H), 4.27～4.16 (m, 2H), 3.77～3.63 (m, 32H), 3.55 (dd,= 5.7, 3.6 Hz, 2H), 3.48 ～3.43 (m, 2H), 3.38 (s, 3H), 3.27 (s, 2H), 2.68 (s, 2H), 2.33 (t,= 7.5 Hz, 2H), 1.65 (dd,= 15.3, 7.6 Hz, 2H), 1.58 (dd,= 15.5, 7.9 Hz, 2H), 1.52 (d,= 9.9 Hz, 1H), 1.33 (dt,= 15.4, 7.6 Hz, 2H), 1.22 (d,= 9.9 Hz, 1H)。

2.6 NB-EDA-Boc的合成

稱取NB (1.72 g, 10.5 mmol)和N-Boc-EDA (2.0 g, 10.6 mmol)溶解在150 mL甲苯中，120 ℃回流。減壓濃縮得到白色固體。加入DCM溶解，用2 mol×L-1HCl溶液洗滌3遍，NaCl溶液洗滌3遍，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥，旋蒸得到粗產(chǎn)品。用甲醇重結(jié)晶，得到白色晶體2.8 g (命名為NB-EDA-Boc)(產(chǎn)率80%)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：6.29 (t,= 1.7 Hz, 2H), 4.78 (s, 0H), 3.68～3.57 (m, 1H), 3.34 (d,= 4.2 Hz, 1H), 3.29～3.25 (m, 1H), 2.70 (s, 1H), 1.51 (d,= 9.9 Hz, 1H), 1.41 (s, 5H), 1.25 (d,= 9.7 Hz, 1H)。

2.7 NB-DAB-Boc的合成

稱取NB (1.72 g, 10.5 mmol)和N-Boc-DAB (2.2 g, 11.2 mmol)，用上述方法得到2 g白色固體(命名為NB-DAB-Boc) (產(chǎn)率95%)。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：6.29 (s, 2H), 3.48 (t,= 7.2 Hz, 1H), 3.27 (s, 1H), 3.13 (s, 1H), 2.68 (s, 1H), 1.63～1.46 (m, 3H), 1.43 (s, 5H), 1.21 (d,= 9.8 Hz, 1H)。

2.8 聚合物PEGn-Em-CPT2和PEGn-Dm-CPT2的合成

通過調(diào)控單體的投料比，用ROMP合成不同比例的聚合物，接著用TFA脫去Boc基團(tuán)，得到聚合物P(NB-PEG)-P(NB-EDA)-P(NB-CPT)2(簡稱為PEG-E-CPT2)和P(NB-PEG)-P(NB-DAB)-P(NB-CPT)2(簡稱為PEG-D-CPT2)，和表示聚合度。以PEG18-E5-CPT2的合成為例描述合成過程。稱取NB-EDA-Boc (20 mg, 0.097 mmol)、NB-CPT (24.2 mg, 0.039 mmol)和NB-PEG (240 mg, 0.35 mmol)溶解于1 mL的干燥DMF中，用氮?dú)夤呐莩鹾螅尤隚rubbs 3 (16 mg, 0.019 mmol)。在室溫下反應(yīng)2 h。加入0.2 mL乙烯基乙醚終止反應(yīng)。反應(yīng)液用體積比為1:1的乙醚和正己烷的混合液沉淀2次，得到黏稠狀液體。未脫保護(hù)的產(chǎn)物用凝膠滲透色譜儀檢測分子量分布。將得到的聚合物溶解于DMF中，滴加等體積的TFA脫保護(hù)，室溫?cái)嚢柽^夜。乙醚沉淀后得到淡黃色黏稠狀液體，真空干燥過夜。

2.9 聚合物PEG-E/R-CPT的合成

選取PEG12-E20-CPT2進(jìn)行下一步修飾。稱取PEG12-E20-CPT210 mg，溶解于2 mL DCM中，加入500 mg的SA以及1滴DIPEA，攪拌過夜。通過茚三酮法檢測到氨基完全反應(yīng)即可終止反應(yīng)。用冰乙醚中沉淀，得白色沉淀12 mg，產(chǎn)率90%。用同樣的方法制備氨基被DCA或DM保護(hù)的聚合物。聚合物命名為PEG-E/R-CPT，其中R為SA、DCA或DM。

2.10 PEGn-Em-CPT2和PEGn-Dm-CPT2的體外釋放實(shí)驗(yàn)

將PEG-E-CPT2和PEG-D-CPT2分別用含有Tween 80(體積分?jǐn)?shù)為1%)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS) (pH = 7.4)配制成1 mg×mL-1的溶液，于37 ℃搖床中振蕩孵育。在不同時(shí)間取樣后用HPLC檢測，流動(dòng)相：甲醇和水的體積比為6:4，流速為1 mL×min-1，檢測波長為360 nm。

2.11 PEG-E/R-CPT的體外釋放實(shí)驗(yàn)

將PEG-E/R-CPT分別用含有Tween 80 (體積分?jǐn)?shù)為1%) 的PBS (pH=7.4或6.5)配制成1 mg×mL-1的溶液，于37 ℃搖床中振蕩孵育。檢測方法與上述實(shí)驗(yàn)類似。

3 結(jié)果與討論

3.1 單體的合成與表征

本研究所用的4種單體NB-CPT、NB-PEG、NB-EDA-Boc和NB-DAB-Boc均以NB為起始原料，與相應(yīng)化合物反應(yīng)所得，合成路線如圖1所示。

圖1 本研究的單體的合成路線

NB-PA和NB-HA的合成參照文獻(xiàn)[27]的方法合成，具體方法為：NB與PA (或HA)在甲苯高溫回流條件下反應(yīng)得到，反應(yīng)結(jié)束后溶解于乙酸乙酯中，通過NaHCO3溶液堿洗和DCM洗滌，去除反應(yīng)體系中的剩余反應(yīng)物。再溶解于水，調(diào)節(jié)pH到酸性，將帶羧基的產(chǎn)物從水中析出，進(jìn)而通過三氯甲烷萃取得到純的產(chǎn)物。產(chǎn)物的1H-NMR如圖2(a)和2(b)所示，氘代試劑為CDCl3。=6.29處為降冰片烯雙鍵的特征峰，積分為2，所有聚合單體均含有該特征峰。NB-PA與CPT-NH2反應(yīng)得到NB-CPT (圖2(c))。NB-HA經(jīng)二氯亞砜活化后，與mPEG400的羥基反應(yīng)，得到NB-PEG (圖2(d))。含有氨基的單體NB-EDA-Boc和NB-DAB-Boc分別由NB與N-Boc-乙二胺、NB與N-Boc-丁二胺在甲苯回流中反應(yīng)得到，產(chǎn)物的1H-NMR如圖2(e)和圖2(f)所示。1H-NMR中可觀察到=6.29處的降冰片烯雙鍵特征峰和=1.4處的Boc特征峰，各氫歸屬位置和積分正確，可見單體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。

圖2 聚合單體的1H-NMR圖譜

3.2 聚合物PEGn-Em-CPT2和PEGn-Dm-CPT2的合成與GPC表征

研究表明裸露氨基會(huì)催化CPT-NH2中酯鍵的斷裂，從而加速CPT的釋放，同時(shí)裸露的氨基也能催化以CPT為核的聚賴氨酸樹枝狀大分子的藥物釋放，并且釋放曲線與氨基結(jié)構(gòu)和數(shù)量相關(guān)[21]。為了探究聚合物側(cè)鏈氨基結(jié)構(gòu)的長短是否會(huì)對聚合物上CPT的釋放速度產(chǎn)生影響，本研究設(shè)計(jì)合成了2種Boc保護(hù)的氨基單體(NB-EDA-Boc和NB-DAB-Boc)。氨基單體與NB-PEG、NB-CPT在Grubbs 3的作用下，通過ROMP合成一系列不同單體比例的梳狀共聚物，接著用TFA脫去聚合物的Boc保護(hù)基(見圖3)，得到梳狀共聚物PEG-E-CPT2和PEG-D-CPT2。

圖3 PEGn-Em-CPT2/PEGn-Dm-CPT2的合成路線

由于2種氨基單體的烷基鏈的長度不同，為了保證CPT的釋放不受聚合物分子量的影響，本研究固定NB-CPT的聚合度為2，通過調(diào)控NB-PEG和氨基單體的投料比使得最終的聚合物分子量接近。通過GPC表征(見圖4，圖中RI為折光率)，所得的7種聚合物的出峰時(shí)間非常接近，表明聚合物的分子量接近、聚合可控。7種聚合物的分子質(zhì)量分布均較窄，多分散系數(shù)(polydispersity index, PDI)在1.08～1.13(見表1)，可見聚合物的分子質(zhì)量w分布較均勻。上述聚合物用TFA脫保護(hù)后，得到鏈長和數(shù)量不同的氨基側(cè)鏈。該聚合物前藥相比原藥CPT，具有良好的親水性，PEG端可以改善小分子的循環(huán)能力，有望提高CPT的生物利用度。

圖4 不同聚合度的聚合物的GPC表征

表1 PEGn-Em-CPT2和PEGn-Dm-CPT2聚合物表征

aDegree of polymerization;bDetermined by gel permeation chromatography (GPC)

3.3 聚合物側(cè)鏈氨基對CPT釋放的影響

為驗(yàn)證聚合物上的側(cè)鏈氨基是否可以加速聚合物上CPT的釋放，同時(shí)考察氨基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)對CPT釋放速率的影響，利用HPLC檢測聚合物前藥在pH 7.4條件下的CPT釋放行為，以PEG14-E15-CPT2的釋放為例，如圖5所示，隨著時(shí)間延長，HPLC譜圖上保留時(shí)間為5.5 min處的CPT峰逐漸增強(qiáng)，表明在pH 7.4的溶液中，PEG14-E15-CPT2會(huì)逐漸釋放出CPT。

圖5 PEG14-E15-CPT2在pH 7.4 PBS中的HPLC色譜圖

圖6 PEGn-Em-CPT2/PEGn-Dm-CPT2在pH 7.4 PBS中的釋放動(dòng)力學(xué)

進(jìn)一步對比了氨基鏈數(shù)目對CPT釋放的影響，如圖6所示，當(dāng)聚合物中氨基鏈數(shù)少于或等于5時(shí)，聚合物上CPT的累計(jì)釋放量均低于10%；隨著氨基鏈數(shù)量增加，CPT釋放明顯加快，PEG14-E15-CPT2和PEG12-E20-CPT2在180 h的釋放量分別達(dá)到76% 和89%，PEG14-D15-CPT2和PEG12-D20-CPT2在相同時(shí)間內(nèi)釋放量達(dá)到52% 和62%，表明對于同種結(jié)構(gòu)的聚合物前藥，CPT的釋放速率與氨基鏈的數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，即通過改變聚合物側(cè)鏈氨基數(shù)可以調(diào)控CPT的釋放速率，PEG-E-CPT2可以調(diào)控CPT釋放量從10% 近線性增加到89%，PEG-D-CPT2可以調(diào)控CPT釋放量從10% 近線性增加到62%。此外，在具有相同氨基鏈數(shù)量的情況下，短鏈氨基(乙二胺，E)比長鏈氨基(丁二胺，D)的催化效率更高。其中在180 h內(nèi)，PEG12-E20-CPT2和PEG12-D20-CPT2之間的CPT釋放量差別可以達(dá)到27%，PEG14-E15-CPT2和PEG14-D15-CPT2之間的CPT釋放量差別為24%，而氨基鏈數(shù)為5的聚合物釋放沒有差異。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)鄰近側(cè)鏈氨基可以催化分子內(nèi)水解，且短鏈氨基具有更高效的催化自水解能力，通過調(diào)節(jié)梳狀共聚物的氨基鏈數(shù)量和長短可以調(diào)控CPT的釋放速率。

3.4 酸響應(yīng)聚合物PEG-E/R-CPT的合成與體外釋放

為了進(jìn)一步證實(shí)氨基對CPT釋放的催化作用，本研究采用不同酸酐對氨基進(jìn)行酰胺化，獲得了不同酸敏感性能的-羧酸酰胺結(jié)構(gòu)。特定結(jié)構(gòu)的-羧酸酰胺在中性或堿性條件下穩(wěn)定，但在酸性條件下會(huì)迅速水解，并暴露出氨基[21, 29-30]。將聚合物側(cè)鏈氨基修飾上不同的-羧酸酰胺，可以遮蔽聚合物的氨基，減少CPT在血液中的釋放，同時(shí)利用-羧酸酰胺的酸不穩(wěn)定性，可以在酸性的腫瘤微環(huán)境或溶酶體中水解而裸露氨基，進(jìn)而促進(jìn)CPT在腫瘤中的釋放。另一方面，帶正電的載體在體內(nèi)應(yīng)用中有很多局限性，包括循環(huán)時(shí)間短、易引起溶血和細(xì)胞毒性等[31]。表面PEG化和酰胺化可以遮蔽正電性，減少以上問題的產(chǎn)生，延長血液循環(huán)時(shí)間，有望在體內(nèi)應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)選用釋放速率最快的PEG12-E20-CPT2聚合物做進(jìn)一步的修飾。合成方法如圖7所示，脫保護(hù)的PEG12-E20-CPT2分別與過量的丁二酸酐(SA)、四氫化鄰苯二甲酸酐(DCA)或2,3-二甲基馬來酸酐(DM)在堿性條件下反應(yīng)，得到了3種-羧酸酰胺化的聚合物PEG-E/R-CPT。

圖7 PEG-E/R-CPT的合成路線

對合成的酰胺化聚合物的藥物釋放特性進(jìn)行了研究。如圖8所示，總體上，相比未修飾的PEG12-E20-CPT2，經(jīng)過修飾后的PEG-E/R-CPT在pH 7.4的條件下釋放CPT的速率明顯下降，說明氨基保護(hù)可以減緩CPT自釋放。在pH 6.5的條件下，3種聚合物的釋放順序?yàn)镻EG-E/DM-CPT > PEG-E/DCA-CPT > PEG-E/SA-CPT，其中PEG-E/SA-CPT在200 h的釋放比例僅有4%。根據(jù)課題組之前的研究[21]，3種-羧酸酰胺在pH 6.5下的斷裂速率為DM > DCA > SA，其中SA在pH 6.5下不斷裂。這與3種聚合物的釋放快慢相一致，進(jìn)一步證明氨基的暴露可以催化CPT水解，同時(shí)還說明通過控制-羧酸酰胺的酸不穩(wěn)定特性，可以調(diào)控CPT的釋放速率。

圖8 PEG-E/R-CPT在不同pH的PBS中的釋放動(dòng)力學(xué)

R = SA, DCA, or DM

4 結(jié)語

研究構(gòu)建了一種觸發(fā)式自降解CPT聚合物前藥系統(tǒng)，并利用鄰近側(cè)鏈氨基催化分子內(nèi)水解控制藥物的釋放。該系統(tǒng)可通過對氨基鏈長短、數(shù)量和保護(hù)基團(tuán)的修飾，實(shí)現(xiàn)對CPT自釋放的精準(zhǔn)調(diào)控，有望應(yīng)用于藥物控釋和遞送領(lǐng)域。

[1] BOTELLA P, RIVERO-BUCETA E. Safe approaches for camptothecin delivery: Structural analogues and nanomedicines [J]. Journal of Controlled Release, 2017, 247: 28-54.

[2] PASSERO F C, JR., GRAPSA D, SYRIGOS K N,. The safety and efficacy of Onivyde (irinotecan liposome injection) for the treatment of metastatic pancreatic cancer following gemcitabine-based therapy [J]. Expert Review of Anticancer Therapy, 2016, 16(7): 697-703.

[3] MATSUMURA Y. Preclinical and clinical studies of NK012, an SN-38-incorporating polymeric micelles, which is designed based on EPR effect [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2011, 63(3): 184-192.

[4] BURRIS H A, INFANTE J R, ANTHONY GRECO F,. A phase I dose escalation study of NK012, an SN-38 incorporating macromolecular polymeric micelle [J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2016, 77(5): 1079-1086.

[5] YURKOVETSKIY A V, FRAM R J. XMT-1001, a novel polymeric camptothecin pro-drug in clinical development for patients with advanced cancer [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2009, 61(13): 1193-1202.

[6] SCOTT L C, YAO J C, BENSON A B,. A phase II study of pegylated-camptothecin (pegamotecan) in the treatment of locally advanced and metastatic gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinoma [J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2009, 63(2): 363-370.

[7] GONZAGA R V, DO NASCIMENTO L A, SANTOS S S,. Perspectives about self-immolative drug delivery systems [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2020, 109(11): 3262-3281.

[8] PETERSON G I, LARSEN M B, BOYDSTON A J. Controlled depolymerization: stimuli-responsive self-immolative polymers [J]. Macromolecules, 2012, 45(18): 7317-7328.

[9] ALOUANE A, LABRUERE R, LE SAUX T,. Self-immolative spacers: Kinetic aspects, structure-property relationships, and applications [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2015, 54(26): 7492-7509.

[10] KIM H, BROOKS A D, DILAURO A M,. Poly(carboxypyrrole)s that depolymerize from head to tail in the solid state in response to specific applied signals [J]. Journal of the American Chemical Society, 2020, 142(20): 9447-9452.

[11] ZHANG P, GAO D, AN K,. A programmable polymer library that enables the construction of stimuli-responsive nanocarriers containing logic gates [J]. Nature Chemistry, 2020, 12(4): 381-390.

[12] MENG X, GAO M, DENG J,. Self-immolative micellar drug delivery: The linker matters [J]. Nano Research, 2018, 11(12): 6177-6189.

[13] PORUBSKY M, GURSKA S, STANKOVA J,. AminoBODIPY conjugates for targeted drug delivery systems and real-time monitoring of drug release [J]. Molecular Pharmaceutics, 2021, 18(6): 2385-2396.

[14] 徐昌活, 周泉, 祝鼎成, 等. 基于門舒特金反應(yīng)的酶觸發(fā)自降解高分子載體及其在基因輸送中的應(yīng)用 [J]. 高分子學(xué)報(bào), 2017(6): 937-945.

XU C H, ZHOU Q, ZHU D C,. Esterase-activated self-immolative polymeric vector based on Menschutkin reaction for gene delivery [J]. Acta Polymerica Sinica, 2017(6): 937-945.

[15] DAL CORSO A, BORLANDELLI V, CORNO C,. Fast cyclization of a proline-derived self-immolative spacer improves the efficacy of carbamate prodrugs [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2020, 59(10): 4176-4181.

[16] LEGIGAN T, CLARHAUT J, TRANOY-OPALINSKI I,. The first generation of beta-galactosidase-responsive prodrugs designed for the selective treatment of solid tumors in prodrug monotherapy [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51(46): 11606-11610.

[17] ZHANG Y, YIN Q, YIN L,. Chain-shattering polymeric therapeutics with on-demand drug-release capability [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52(25): 6435-6439.

[18] LIU G, WANG X, HU J,. Self-immolative polymersomes for high-efficiency triggered release and programmed enzymatic reactions [J]. Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(20): 7492-7497.

[19] WANG Z, WU H, LIU P,. A self-immolative prodrug nanosystem capable of releasing a drug and a NIR reporter for in vivo imaging and therapy [J]. Biomaterials, 2017, 139: 139-150.

[20] FIFE T H, SINGH R, BEMBI R. Intramolecular general base catalyzed ester hydrolysis. The hydrolysis of 2-aminobenzoate esters [J]. Journal of Organic Chemistry, 2002, 67(10): 3179-3183.

[21] ZHOU Z X, MA X P, MURPHY C J,. Molecularly precise dendrimer-drug conjugates with tunable drug release for cancer therapy [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53(41): 10949-10955.

[22] SU J K, JIN Z, ZHANG R,. Tuning the reactivity of cyclopropenes from living ring-opening metathesis polymerization (ROMP) to single-addition and alternating ROMP [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2019, 58(49): 17771-17776.

[23] BARTHER D, MOATSOU D. Ring-opening metathesis polymerization of norbornene-based monomers obtained via the passerini three component reaction [J]. Macromolecular Rapid Communications, 2021, 42(9): e2100027.

[24] GUTEKUNST W R, HAWKER C J. A General approach to sequence-controlled polymers using macrocyclic ring opening metathesis polymerization [J]. Journal of the American Chemical Society, 2015, 137(25): 8038-8041.

[25] VARLAS S, FOSTER J C, O'REILLY R K. Ring-opening metathesis polymerization-induced self-assembly (ROMPISA) [J]. Chemical Communications, 2019, 55(62): 9066-9071.

[26] KAMMEYER J K, BLUM A P, ADAMIAK L,. Polymerization of protecting-group-free peptides via ROMP [J]. Polymer Chemistry, 2013, 4(14): 3929-3933.

[27] LEITGEB A, WAPPEL J, SLUGOVC C. The ROMP toolbox upgraded [J]. Polymer, 2010, 51(14): 2927-2946.

[28] BRAY F, FERLAY J, SOE RJOMATARAM I,. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. Ca-a Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68(6): 394-424.

[29] SHEN Y, ZHOU Z, SUI M,. Charge-reversal polyamidoamine dendrimer for cascade nuclear drug delivery [J]. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2010, 5(8): 1205-1217.

[30] XU P, VAN KIRK E A, ZHAN Y,. Targeted charge-reversal nanoparticles for nuclear drug delivery [J]. Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46(26): 4999-5002.

[31] DUNCAN R, IZZO L. Dendrimer biocompatibility and toxicity [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57(15): 2215-2237.

Self-immolative camptothecin polymeric prodrugs for controlled drug release

BAI Hao-yu, ZHOU Zhu-xian, SHEN You-qing

(Zhejiang Key Laboratory of Smart Biomaterials, College of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Precise controlling of drug release profiles is essential for enhancing drug efficiency and reducing side effects. Self-immolative systems have been developed as promising platforms for programmable and on-demand drug release. A self-immolative camptothecin (CPT)-based polymeric prodrugs for controlled drug release was constructed. The polymeric CPT prodrugs were prepared by Grubbs 3 catalyzed (3rd generation) ring-opening metathesis polymerization (ROMP). The results show that neighboring amine groups in the polymeric prodrugs can catalyze the hydrolysis of CPT ester and promote CPT release. The drug release profile of CPT was tunable by pH, amine chain length and amine numbers. The drug release of PEG-E-CPT2and PEG-D-CPT2can be tuned from 10% to 89% and 62% within 180 hours, respectively.By amidization of amine groups with acid-responsive-carboxylic amides, polymeric CPT prodrugs with acid-responsive drug release was obtained. This work demonstrates the neighboring amine catalyzed hydrolysis can be used for self-immolative drug release.

self-immolation; polymeric prodrug; camptothecin; controlled drug release

1003-9015(2022)04-0570-09

R 979.1

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2022.04.013

2021-10-21；

2021-11-29。

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2021YFA1201200)，國家自然科學(xué)基金(52073249, 21875211)。

白皓宇(1995-)，男，山西長治人，浙江大學(xué)碩士生。

周珠賢，E-mail：zhouzx@zju.edu.cn

白皓宇, 周珠賢, 申有青. 觸發(fā)式自釋放喜樹堿聚合物前藥的合成與釋放調(diào)控[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2022, 36(4): 570-578.

： BAI Hao-yu, ZHOU Zhu-xian, SHEN You-qing. Self-immolative camptothecin polymeric prodrugs for controlled drug release [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2022, 36(4): 570-578.